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乙型肝炎DNA疫苗系列质粒的构建及其在SP2/0细胞中的表达
近年来兴起的核酸疫苗对某些病毒感染同时具有预防和治疗作用。我们构建了一系列能表达乙型肝炎病毒大、中、小蛋白的疫苗质粒，并研究了其在SP2/0细胞中的表达情况。一、材料与方法1. S、MS、LS蛋白编码基因片段的获取：以含有adr亚型HBV全基因组pBHB4质粒为模板，用3对人工合成的引物SF/SR、S2F/SR、S1F/SR分别扩增编码小蛋白S（nt28-708）、中蛋白MS（nt3077-708）和大蛋白LS（nt2719-708）的DNA片段。引物SF、S2F和S1F分别互补于S、前S2和前S1基因起始区域，SR则互补于S基因相应的终止区。2. S1S重组基因片段的获取：采用重叠扩增PCR法对S1S2S基因进行剪切和重组，即获得不含S2的S1S重组基因片段。3. 重组质粒的构建及鉴定：将上述获得的S、S1S、S2S及S1S2S基因片段分别插入质粒pSG5UTPL/Flag载体的SV40启动子下游和质粒pRc/CMV载体的CMV启动子下游。将以上8个重组质粒转化大肠杆菌XL Blue 1，经菌落PCR鉴定技术筛选含相应插入片段的阳性克隆，然后抽提、扩增、纯化并酶切鉴定，以373A型核酸自动分析仪测定所插入片段的核酸序列。4. 重组质粒在SP2/0细胞中的表达：将纯化的质粒转染SP2/0细胞并筛选、建立长期转染细胞株。分别收集部分转染细胞，超声破碎后收集上清液，以Western-Blot检测相应蛋白质在SP2/0细胞中的表达情况。
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用免疫组化方法鉴定转染基因nm-23-H1蛋白表达的实验体会
作者通过转染细胞(ACC-m/nm23-H1)蛋白表达经免疫组化方法分析鉴定获得满意效果这一方法,将该法与蛋白印迹方法加以比较,并进行分析评价,重新认识到该法具有许多优势.
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根据蛋白质表达的多态性快速鉴定转染细胞及其稳定性的实验
目的:利用蛋白质表达的多态性快速有效地判断转染细胞目标基因蛋白质表达及其稳定性.方法:采用经本室转染质粒nm23-H1的ACC-m细胞(代号为ACC-m/nm23-H1)和ACC-m细胞(阴性对照),鼠抗人nm23-H1单克隆抗体,按SP法做常规免疫组化染色.结果:ACC-m/nm23-H1细胞在表达nm23-H1蛋白时呈强阳性,其表达蛋白质的形态、分布及表达的形式都呈现多态性,与阴性对照相比,差异显著.结论:蛋白质表达的多态性是基因杂合的结果,也是细胞获稳定转染的标志之一,而免疫组化结果能较好的反映出转染细胞的这一特质.
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p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较
目的比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响.方法构建正义和反义p53 cDNA真核细胞表达载体pEGFP-p53(RS)和pEGFP-p53(AS),用Lipofectin介导转染801D细胞.PCR检测外源p53和neo基因.荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白.免疫组化染色检测突变蛋白表达.比较pEGFP-p53(AS)-801D和pEGFP-p53(RS)-801D的集落形成试验和裸鼠移植试验.用流式细胞术分析细胞周期.结果 PCR检测出外源p53和neo基因存在于细胞,细胞可见绿色荧光.免疫组化检测示pEGFP-p53(AS)-801D突变蛋白呈阴性,母系为阳性,表明反义p53能封闭突变p53蛋白表达.pEGFP-p53(RS)-801D和pEGFP-p53(AS) 801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤性均降低,pEGFP-p53(RS)-801D更为明显.pEGFP-p53(AS)-801D细胞周期阻滞于G1期.结论在同一细胞背景下,p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要的作用.外源野生型p53在肿瘤细胞中可恢复重建其功能,外源反义p53可封闭突变蛋白表达,阻止细胞停留于G1期.
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p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响
目的研究外源p53反义RNA对有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响.方法构建p53反义RNA真核细胞表达载体PEGFP-p53(AS),经酶切图证明反向联结质粒.Lipofectin介导转染有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801D,经G418筛选获耐受克隆.稀释法建立单细胞克隆系,应用PCR检测外源基因,荧光显微镜检测细胞绿色荧光蛋白表达,p53单抗免疫组化染色检测p53突变蛋白表达,体外集落形成实验检测细胞生长,流式细胞仪检测细胞周期,MTT法检测细胞对顺铂药物敏感性.结果酶切图证明了p53-cDNA反向联结于质粒,构建了PEGFP-p53(AS),并建立了转染单细胞克隆系PEGFP-p53(AS)-801D及空载细胞系PEGFP-801D.PCR检测外源p53基因和neo基因存在于转染细胞系,而荧光显微镜下发现其胞浆有绿荧光蛋白表达.免疫组化染色p53突变蛋白在801D细胞系为阳性,而PEGFP-p53(AS)-801D为阴性,证明外源反义p53在转染细胞稳定表达并封闭内源突变蛋白表达.与母系相比,PEGFP-p53(AS)-801D集落形成抑制率为61%(P＜0.01),流式细胞仪检测该细胞系G1期细胞数明显增加,出现G1期阻滞的表现.MTT检测PEGFP-p53(AS)-801D对顺铂比母系更为敏感.结论有p53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显,对顺铂耐药,外源p53反义RNA可封闭突变蛋白表达,抑制细胞体外恶性增殖,增加对顺铂的药物敏感性.转染p53反义RNA可抑制p53突变的恶性表型或恢复野生型p53基因功能.
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甲病毒表达载体的特点及在核酸疫苗中应用
甲病毒属(Alphavirus)在病毒分类学上被归属于披膜病毒科(Togaviridae).可以在蚊、禽类和哺乳动物的宿主细胞中复制.甲病毒基因组是一条单股正链RNA,其5′端为非结构蛋白编码区(NS1-NS4),可编码病毒自身复制酶,主要与病毒的自身转录和复制有关.病毒感染宿主细胞或病毒基因组RNA转染细胞后,均可启动高水平的复制过程,迅速产生新的子代病毒颗粒,可在每个宿主细胞内达到105的高拷贝数[1].甲病毒在复制过程中,NS1-NS4序列首先翻译合成为一种能进行自身水解的多聚蛋白.多聚蛋白前体经自身剪切后形成4个非结构蛋白(NSP1-4).它们是自身转录和复制所需要的酶,启动自身RNA的复制.在这些酶蛋白的作用下,以正链RNA为模板,合成全长的负链RNA,再以负链RNA为模板合成子代基因组正链RNA和编码病毒结构蛋白的mRNA,经过翻译合成病毒的结构蛋白.在此过程中,以正链RNA为模板合成全长的负链RNA的反应可持续不断的进行,从而可以转录出大量的结构蛋白编码基因的mRNA拷贝,指导合成出大量的蛋白.倘若用编码抗原的目的基因取代结构蛋白基因,则可构成强大的以复制酶为基础的核酸疫苗.以上的病毒生物学特点促使学者研究将甲病毒作为一种具有独特功能优势的基因工程载体.
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DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究
目的:从人骨骼肌cDNA文库中,分离、鉴定视网膜感光受体外周蛋白的结合蛋白(PBP)-DnaJ(HSP40)类分子伴侣,并初步分析其在转染的哺乳动物细胞中的表达及分布.方法:以32p-dCTP标记探针杂交筛选人骨骼肌cDNA文库,对阳性克隆进行序列分析,并以脂质体介导转染哺乳动物细胞,用免疫印迹及间接免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达.结果:筛选出全长pbp基因,经与GenBank中的序列比较分析证实,与DnaJ家族的1个成员-mrj(1.5kb)的序列相同,且含140 bp左右富含GC的非编码区上游序列.在COS-7细胞中瞬时表达的PBP,大多呈典型的胞浆分布,而J-domain缺失的pbp片段多为胞核分布.而在CHO细胞中稳定表达的PBP,在处于不同细胞周期时相的细胞中的分布不同.结论:DnaJ除与HSP70(DnaK)协同发挥重要功能外,其本身作为分子伴侣也可能发挥着重要作用,且与细胞周期可能存在某种密切联系.
关键词： DnaJ分子伴侣蛋白 基因 转染细胞 外周蛋白结 合蛋白 -
GFP共表达检测重组型Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用
[贾林涛,于翠娟,许彦鸣,赵晶,高下,张淼丽,王成济,杨安钢. 细胞与分子免疫学杂志,2001;17(3):218-221]目的探讨由野生型人caspase-3大小亚基颠倒构建的重组型caspase-3的促细胞凋亡活性. 方法用RT-PCR法获得人caspase-3基因. 通过重组PCR进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列. 将上述基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染人HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构. 结果成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因. 构建了重组型caspase-3基因的表达载体. 转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡. 电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征. 结论重组型caspase-3可促进HeLa细胞的调亡.(井晓梅)
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人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究
目的 环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之 一. 本研究旨在获得hCOX-2 编码基因序列，构建其正、反义真核表达载体，并用反义重组载体转染COX-2高表达的胃癌 细胞，以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制. 方法 按文献报道的hCOX-2 核苷酸序列设计合成PCR引物，利用总RNA抽取试剂盒从COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SGC 7901中提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再用PCR方法扩增目的基因序列. PCR产物经DNA序 列测定证实后，利用引物5端引入的EcoRⅠ, XbaⅠ酶切位点，通过粘端连接，将 所获目的 基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中. 对两种重组质粒分别进 行相应的酶切鉴定. 采用脂质体介导的方法用COX-2反义核酸转染SGC7901细胞，经G418筛 选 后，随机挑选细胞克隆. 通过RT-PCR检测COX-2 mRNA水平的变化. 结果 应用RT-PCR反应扩 增获得大小约1.9 kb的特异性片段. 经DNA序列分析，证实与文献报道的hCOX-2编码区序列 一致. 重组正义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(+)用EcoRⅠ，XbaⅠ双酶切后，产生大 小约5.4 kb，1.9 kb的片段；重组反义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)通过PstⅠ酶切， 产 生大小约4.5 kb, 1.5 kb与1.3 kb的片段，与预期结果相符. 转染细胞经筛选后，随机挑选 、扩增了3个细 胞克隆，其中1个细胞克隆稳定表达COX-2反义核酸，RT-PCR提示其COX-2 mRNA水平显著 下 降. 结论 成功克降了hCOX-2编码基因序列，并构建了其正、反义真核表 达载体. 反转录PC R是克隆基因的简便、有效方法. 为扩增高GC含量的cDNA模板，可在PCR引物中加入限制性内 切酶位点，可以方便地实现基因的定向克隆. COX-2反义核酸在胃癌细胞系SGC7901中得到 稳定转染，转染细胞COX-2 mRNA表达显著受抑制.
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抗HCV复制调控区药物体外筛选模型的建立
目的:建立抗丙型肝炎病毒(HCV)复制调控区体外药物筛选模型.方法:将全长HCV的5'非翻译区(5' UTR)的cDNA克隆至启动子探测载体pEGFP-1,构建重组载体p5'NCR-EGFP,并转染至人肝癌细胞系HepG2.获得的转染细胞以荧光显微镜检测及原位杂交法验证,并经流式细胞术分选.通过干扰素与利巴韦林2种常规抗病毒药物对所构建的模型进行初步应用.结果:荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(EGFP)的强表达,原位杂交检测到转染细胞的核区有特异性杂交信号.流式细胞术可检测到表达EGFP的阳性细胞达95％以上.初步运用结果显示,γ干扰素对该模型有明显的抑制作用,而利巴韦林及α-2b干扰素在本模型上的抑制作用较弱.结论:该细胞模型经验证可以成为体外筛选抗HCV复制调控区药物的模型.
