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地高辛标记核酸病理形态学检测方法的建立及应用
目的 建立地高辛标记原位杂交(ISH)和原位PCR(ISP)方法,探讨其在病理形态学检测中的应用.方法 以细胞cDNA或质粒DNA为模板制备地高辛探针,ISH检测肺癌、胃癌或结直肠癌切片上JCV T抗原DNA、beclin 1和SERCA3 mRNA表达水平.在肺癌和胃癌切片上扩增地高辛标记的JCV T抗原DNA.杂交或标记后,进行抗地高辛碱性磷酸酶反应并行NBT/BCIP或Fuchsin显色.结果 PCR扩增获得高纯度地高辛标记DNA探针,甲酰胺杂交液杂交显示JCV T抗原存在于JCI细胞的细胞核中,beclin 1和SERCA3 mRNA阳性信号见于结肠癌和癌旁黏膜上皮细胞质中.ISP扩增了地高辛标记的JCV T抗原DNA,显色后发现JCV T抗原主要定位在JCI细胞、肺泡上皮细胞和肺癌细胞核、胃癌及癌旁黏膜细胞核中.NBT/BCIP显色比Fuchsin显色更为敏感,甲基绿复染使得上述2种显色更加清晰.结论 地高辛标记的ISH和ISP操作简便,敏感度高,NBT/BCIP显色和甲基绿复染图像美观.
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轮状病毒肠道外感染的研究
目的:了解人类轮状病毒(RV)全身扩散后易感的肠外器官与组织,为临床的早期诊断与治疗提供有价值参考.方法:从RV胃肠炎患儿临床表现和化验检查获取RV全身感染的临床证据;采用原位PCR与杂交技术,从RV胃肠炎死亡病理组织标本中,获取RV感染的直接证据;用人类RV感染小鼠,验证人类RV一旦扩散至全身后,其易感的主要肠外器官与组织.结果;RV易感的肠外器官与组织主要有支气管与肺泡、心、肝、肾,其次有血液、神经、胰、胆.结论:人类RV一旦扩散至全身后,可能会对多个系统造成不同程度的损伤,认识这种可能性,早期预防与诊断,及时调整治疗方案,合理治疗,对提高危重症BV感染的治愈率、减少死亡率都具有重要的意义.
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HPV16/18感染和微血管密度在宫颈癌中表达及其临床意义
目的:明确人乳头瘤病毒16/18(HPV16/18)感染和微血管密度(MVD)在宫颈原位癌(CIS)和子宫颈浸润癌(ICC)组织中的表达和分布,探讨其在子宫颈癌发病中的意义.方法:采用原位PCR杂交和免疫组织化学法检测HPV16/18感染和MVD在43例宫颈浸润癌(ICC)、15例宫颈原位癌(CIS)及16例正常宫颈组织中感染和表达情况.结果:在ICC中HPV16/18感染与组织病理学类型有关(P<0.05);而与FIGO分期、组织病理学分级、癌细胞浸润转移和癌灶直径大小无关(P>0.05).组织病理学类型为腺癌,其主要为HPV18型感染,组织病理学类型为鳞癌,其主要为HPV16型感染;MVD与宫颈癌的FIGO分期及癌细胞浸润转移密切相关,组间比较差异有显著性(P<0.05);与MVD有相关性,组间比较差异有显著性(P<0.05).结论:HVP16/18感染与MVD的表达无相关性.但可为宫颈癌组织病理学来源提供信息.MVD与宫颈癌的恶性程度及淋巴结有无转移密切相关.因此,采用MVD评价宫颈癌预后是有意义的.
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原位PCR确诊一例由病毒性心肌炎所致心肌梗塞
目的 应用原位PCR诊断青年型急性心肌梗塞的柯萨奇B组病毒(coxsackie virus B，CVB)感染。方法 应用原位PCR法对具有急性心肌梗塞临床演变年轻患者的心肌活检组织进行CVB检测，以明确病因。结果患者的心肌活检组织中CVB-RNA显示阳性。结论 柯萨奇B组病毒感染所致的急性病毒性心肌炎可导致急性心肌梗塞。
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原位PCR技术检测PTEN基因DNA在肺癌中的表达
目的:从DNA水平检测PTEN基因在肺癌组织中的表达,探讨PTEN基因的表达与肺癌发生发展的关系.方法:应用原位PCR技术检测56例肺癌石蜡标本PTEN基因DNA表达.结果:①PTEN DNA表达阳性信号主要位于癌细胞核,胞浆中亦有少量表达,阳性产物呈棕黄色弥漫分布;②不同性别患者的PTEN基因的表达不同,但差异甚微;③PTEN DNA表达在非小细胞肺癌中的阳性率明显高于小细胞肺癌中的表达阳性率;④分化不良的肺癌PTEN基因表达阳性率低于分化良好和中等分化者;⑤19例有淋巴结转移的肺癌患者PTEN基因表达明显低于37例无淋巴结转移者.结论:PTEN基因在肺癌组织中的表达较正常肺组织中的表达有所降低,说明PTEN基因的低表达可能在肺癌的发生发展过程中起重要作用,且该基因的表达与肺癌患者的性别无显著相关,而与肺癌的病理类型、组织分化程度、临床分期,以及有无淋巴结转移密切相关.
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间接法原位PCR在cHL IgH基因重排研究中的应用
目的:探索在石蜡切片上进行间接法原位PCR的可行性及利用产物探针检测IgH克隆性基因重排的意义.方法:选取获得IgH克隆性基因重排的经典型霍奇金淋巴瘤(cHL),纯化产物合成探针,进行间接法原位PCR.结果:在H/RS细胞和周围背景细胞核内均发现棕褐色杂交颗粒,利用产物探针互测时也能出现杂交颗粒.结论:在石蜡切片上进行间接法原位PCR是可行和有效的,但产物探针的精确性仍有待进一步证实.
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应用原位PCR和原位杂交技术检测宫颈癌及癌前病变组织中HPV DNA
人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的关系已获公认。仍有许多学者采用原位杂交(ISH)，斑点杂交和PCR技术对其进行深入研究〔1,2〕。我们采用原位PCR和ISH技术对宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)组织中的HPVDNA进行对比检测，探讨ISPCR技术检测石蜡切片中HPV DNA的敏感性。
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人类轮状病毒感染新生小鼠肠道外组织的病理变化
目的了解人类轮状病毒(RV)全身扩散后对机体的影响,为临床的防治提供有价值参考.方法选用对人类RV敏感的健康新生昆明小鼠,经灌胃与腹腔注射两种途径接种RV,3 d后处死小鼠,光镜下观察各脏器病理变化;电镜下观察肝脏的病理变化;各脏器原位杂交,原位PCR检测RV,并与健康小鼠比较.结果光镜下:RV口服组小肠绒毛、胃固有层、心肌细胞有改变;RV腹腔注射组除上述改变外,肝,肾也有改变;电镜下:肝细胞线粒体肿胀、凝集病变尤为明显,细胞核固缩-崩解,粗面内质网扩张,肝细胞中存在大量脂滴和空泡;毛细胆管明显扩张,微绒毛脱落.原位杂交:RV口服组小肠上皮细胞,RV腹腔注射组肠、肾近曲小管上皮细胞呈阳性;原位间接PCR:RV口服组小肠绒毛、肠腺细胞、肾近曲小管和集合管上皮细胞呈阳性,RV腹腔注射组肠、肾、肝、心脏、胰呈阳性.结论 RV一旦向全身扩散,可侵犯除肠之外的多个器官组织,提示人类RV也可能具有一定的泛嗜性.
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原位PCR对弓形虫感染鼠病理检测效果的观察
观察原位PCR方法在弓形虫感染病原学检测中的效果.以RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第2、4、6天处死,取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本,以直接法原位PCR扩增并检测石蜡标本中的弓形虫DNA,与免疫组化方法检测冷冻切片标本的结果相比较.18例直接原位PCR法检测标本中均得到阳性信号,病原体检出率为100%,优于免疫组化法(11/18).直接法原位PCR为检测病理标本中的弓形虫DNA提供了一种新的可行方法.
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原位PCR技术及其应用
目的阐述原位PCR技术的基本原理、进展、应用及存在问题.方法通过检索国内、外相关文献,归纳整理;结合实践操作经验,展开分析.结果原位PCR技术是一种特异性、敏感性较高的靶序列检测定位技术,作为研究基因信息和细胞、染色体等的形态信息的有力工具,尤其是专用原位PCR仪在医学研究(医学检验、病理学领域)上的广泛应用.结论原位PCR技术的应用推广及研究深入,也存在其技术应用不完善之处.
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应用原位PCR技术检测宫颈癌和宫颈上皮内瘤变组织中人乳头瘤病毒DNA
目的探讨原位PCR(isPCR)技术的敏感性及人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变(CIN)的关系.方法采用isPCR技术对66例宫颈癌和25例CIN组织中的人乳头瘤病毒(HPV)DNA进行检测.结果 52例宫颈癌检测到了HPV DNA(78.8%),其中HPV16 DNA阳性45例(78.8%),HPV18 DNA阳性10例(15.2%),HPV16、18的DNA均阳性3例,HPV18 DNA阳性而HPV16 DNA阴性7例,CIN中HPV DNA阳性13例.结论 isPCR是一种敏感性高、特异性强的方法;宫颈癌和CIN的发生与HPV16和HPV 18感染有密切关系.
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豫医无毛小鼠无毛基因DNA原位PCR检测
目的:探讨原位PCR技术对检测基因组变异的有效性.方法:应用原位PCR检测豫医无毛小鼠皮肤和脾的石蜡组织切片,并以健康昆明小鼠皮肤和脾的石蜡组织切片、PCR反应液不加Taq DNA聚合酶、不加引物和引物不带生物素作为对照.结果:豫医无毛小鼠皮肤和脾石蜡组织切片中检测到清晰的杂交信号,而且杂交信号位于细胞核内;4组对照均未出现杂交信号.结论:原位PCR在基因组变异检测方面实用、有效.
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原位PCR标本的处理及反应条件的优化
目的探讨原位PCR中标本处理的佳方法和反应的佳条件.方法应用原位PCR方法对昆明小鼠进行基因检测和定位,对标本使用不同的方法处理,检测和定位过程中改变主要的反应条件.结果进行原位PCR的标本使用0.05%多聚赖氨酸处理黏附性好;4%多聚甲醛固定标本5 min、30 gg/ml蛋白酶K 37℃处理30min标本的结构和通透性好;PCR反应液中Mg2+达到4.5 mmol/L扩增结果好.结论标本的处理和反应条件对原位PCR的结果影响很大.
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鼻咽癌组织中EB病毒的不同原位检测方法比较
目的:探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测EB病毒的更快速、更灵敏的方法.方法:用地高辛标记的寡核苷酸EBER-1和EBVDNA的BamHI-W片段为探针,分别用原位杂交、原位PCR检测鼻咽癌组织切片中EBV的分布情况.结果:用寡核苷酸EBER-1作探针原位杂交检测EB病毒的方法比用BamHI-W片段作探针原位杂交及原位PCR的方法更灵敏、更简单.结论:用EBER-1作探针原位杂交检测鼻咽癌组织切片中EB病毒的方法不失为一种简单、快速、灵敏的方法.
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轮状病毒感染全身扩散诱发因素的初探
目的 探讨免疫低下、肠道混合感染因素在诱发轮状病毒(RV)肠道外扩散中的作用,为研究肠道病毒肠道外扩散的机制,为临床的防治提供参考.方法 健康昆明小鼠腹腔注射环磷酰氨制作免疫低下小鼠模型,分别经灌胃和腹腔两种途径接种RV;健康昆明小鼠相继灌胃接种产毒性大肠杆菌和RV,制作肠道混合感染小鼠模型;猝死小鼠,光镜下观察病理变化;各脏器原位杂交,原位PCR检测RV;初步调查RV腹泻合并轮状病毒血症患儿健康状况,检测TNFα、IL-2及锌、铁、铜、铅、钙、锰、镁7种微量元素水平.结果 光镜下:免疫低下组心、肝、肾,混合感染组肝、肾组织有病理改变;原位杂交:免疫低下腹腔注射RV组、肠道混合感染组肾小管均呈阳性.原位PCR:肠道混合感染组肝、肾,免疫低下腹腔注射组心、肝、肾、胰呈阳性;轮状病毒血症患儿多数存在免疫与营养方面的异常.结论 免疫低下、肠道混合感染、营养素不足可能是诱发和/或加重RV肠道外扩散和感染的重要原因之一.
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免疫低下小鼠轮状病毒肠道外感染的实验研究
目的探讨免疫低下因素在诱发轮状病毒(RV)肠道外扩散中的作用,为临床防治提供参考后.方法给健康昆明小鼠注射环磷酰胺制作免疫低下小鼠模型,经口服和腹腔注射两种途径给免疫低下小鼠接种RV,处死小鼠,光镜下观察其病理变化.各脏器原位杂交,原位PCR检测RV.结果光镜下:口服RV组小肠绒毛、胃固有层、心肌细胞有改变;腹腔注射组除上述改变外,肝、肾也有改变.原位杂交:口服RV组小肠绒毛,腹腔注射组小肠绒毛、肾呈阳性.原位PCR:口服RV组小鼠的小肠绒毛,肠腺细胞,肾近曲小管和集合管上皮细胞呈阳性;腹腔注射组小鼠的肠、肾、肝、心、胰呈阳性;其余组动物各个组织器官均为阴性.结论免疫低下可能是诱发和加重RV肠道外扩散和感染的重要原因之一.
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应用原位PCR检测小儿急性白血病免疫球蛋白重链重排
目的:探讨间期细胞原位PCR方法在小儿急性白血病研究中的临床应用价值.方法:采用dig-11-dUTP标记免疫球蛋白重链 (IgH)第三互补决定区( CDR-Ⅲ)的引物,建立直接原位 PCR方法,检测小儿急性白血病患儿间期淋巴细胞.结果:22例淋巴细胞性白血病初诊患儿中,18例外周血间期淋巴细胞可检测到IgH基因重排;3例骨髓完全缓解,外周血间期淋巴细胞原位 PCR仍有阳性细胞,3个月复发.结论:间期细胞原位 PCR技术能敏感、准确地检测小儿 B细胞系急性淋巴细胞性白血病,并帮助预测复发.
关键词： 间期细胞 原位PCR 急性淋巴细胞性白血病 -
树对丙型肝炎病毒的易感性研究
目的:探讨树对丙型肝炎病毒( HCV)的易感性.方法:对来自云南的树接种含HCV的病人血清,然后用PCR方法检测树血清的HCV RNA,用反向被动血凝法测定抗-HCV抗体,用原位PCR方法检测树肝细胞内的HCV RNA.结果:34.8%的树(8/23)在接种HCV后,血清中检出HCV RNA,对4 例抗HCV阳性和谷丙转氨酶升高的树的肝组织进行原位PCR检测,结果在1例肝细胞中检出H CV RNA.此外,30.4%的树(7/23)在接种后出现抗-HCV抗体.部分阳性树均有不同程度的谷丙转氨酶异常升高及肝组织病理性炎症反应.对照组动物(2只)从未出现HCV RNA及抗 -HCV抗体,但其中一只树曾有一过性转氨酶升高.结论:树可以感染HCV.
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间期细胞原位PCR检测B细胞系恶性淋巴瘤
目的:应用原位PCR技术检测B细胞系恶性淋巴瘤.方法:采用免疫球蛋白重链(IgH)基因第三互补决定区(CDR-Ⅲ)的引物,dig-ll-dUTP标记引物,应用直接原位PCR技术检测Ⅲ～Ⅳ级恶性淋巴瘤患者的间期淋巴细胞.结果:在初诊的15例恶性淋巴瘤患者中,12例检测到IgH基因重排;4例临床表现呈现淋巴瘤性白血病患者,治疗后骨髓完全缓解.2例间期细胞原位PCR仍显示有IgH基因重排,6个月复发.结论:间期细胞原位PCR技术能敏感、准确地检测Ⅲ级以上的恶性淋巴瘤,并帮助预测复发,为一有效的基因诊断方法.
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建立检测大鼠原位腹主动脉移植细胞嵌合的直接原位PCR法探讨
目的:建立直接原位PCR法检测受者细胞迁移于移植腹主动脉形成的细胞嵌合.方法:采用异性别大鼠腹主动脉原位移植模型,收集术后1天、7天、2周、3周、4周、2月的腹主动脉,建立Digoxgenin-11-dUTP直接掺入法检测雄性受者来源细胞.结果:在7天、2周、3周、4周、2月移植腹主动脉增殖的内膜中检测到受者来源细胞,并与阴性和阳性对照相比有显著意义.结论:直接原位PCR法可用于移植后受者细胞嵌合的检测.
