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利用同种异体脱细胞基质构建人工真皮的研究
目的在同种异体脱细胞基质中植入幼儿包皮成纤维细胞,构建人工真皮替代物,以研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用,为研制大面积创面覆盖物--复合皮奠定基础.方法(1)酶消化法培养幼儿成纤维细胞;(2)制备尸体皮脱细胞基质,接种成纤维细胞后于不同时间观察细胞的形态变化;(3)细胞计数;(4)H.E染色;(5)扫描电镜观测脱细胞基质的表面是否有成纤维细胞附着;(6)三联染色观察人工真皮中胶原纤维、弹力纤维及网状纤维的分布.结果(1)利用脱细胞基质构建的人工真皮形成后质地与颜色近似真皮组织,有一定的弹性,可出现较明显的细胞增殖,未见人工真皮收缩现象.(2)细胞计数法所得生长曲线表明植入尸体皮脱细胞基质中的细胞具有典型的细胞增殖现象.(3)H.E染色可见成纤维细胞主要分布于脱细胞基质表面.(4)扫描电镜下可见脱细胞基质表面有梭形的成纤维细胞出现,且成纤维细胞紧密贴附于脱细胞基质上.(5)三联染色显示人工真皮中存在胶原纤维及成纤维细胞新合成的弹力纤维.结论成纤维细胞在脱细胞基质中有着活跃的生物学特性,以脱细胞基质为支架构建的人工真皮具有同正常真皮相似的结构与功能.
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人脱细胞半月板的制备
目的：研究人脱细胞半月板的制备及其形态结构和生物力学性能。方法：切取人半月板制备人脱细胞半月板，用HE、甲苯胺蓝、天狼星红、番红花O、AB染色和Hoechst-33258染色等方法进行定性检测，扫描电镜进行形态学观察，用生物力学机测定其在不同压缩比率下的瞬时形变恢复率，大形变恢复率及大受压强度。结果：各种染色均显示细胞陷窝内已无细胞结构，Hoechst-33258染色显示无细胞残留，天狼星红染色为阳性，电镜观察示半月板表面及内部不规则存在空虚的陷窝。人脱细胞半月板的孔隙较大，孔隙直径为80～760μm，孔隙率在67％以上。生物力学测定其压缩30％时，大瞬时形变恢复率为（89．62±1．04）％，大形变恢复率为100％，大强度是（3．04±0．13）N。结论：人半月板经去污剂等处理后，去除了细胞成分，保留了三维立体结构的细胞外基质，具有一定的生物力学性能；成功制备的人脱细胞半月板可作为半月板组织工程的支架载体。
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灌注法大鼠全肺脏脱细胞基质支架的建立
目的 应用灌注法建立大鼠全肺脏脱细胞基质支架,探讨灌注法制备的肺脱细胞基质作为细胞支架构建组织工程器官的可行性.方法 12周龄Wistar大鼠20只,麻醉后完整切取肺组织.由肺动脉插入18G灌注头连接到Langendorff灌注平台,保持灌注压40cmH2O.肺脏用肝素化PBS液将残留血液冲洗干净,然后用1%脱氧胆酸钠溶液灌注90min,再用核酸酶应用液灌注30min.检测指标包括常规苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态;Weigert弹力纤维+Von Gieson结缔组织(ET+VG)染色观察胶原纤维和弹性纤维的分布.结果 进行脱细胞灌注后,大鼠肺脏逐渐呈均一的白色半透明状,显微镜观察肺组织细胞已基本消失,而胶原纤维排列较整齐,弹性纤维保存良好.结论 灌注法是一种简单有效构建大鼠全肺组织基质支架的技术,1%脱氧胆酸钠溶液能够较好地脱除大鼠肺脏的细胞.
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食管粘膜下层脱细胞基质的制备及其力学性能
脱细胞基质支架由于其良好的组织相容性和生物相容性而成为组织工程领域的研究热点之一.采用高渗盐溶液联合DNA酶法(HSD)、表面活性剂联合DNA酶法(SD)、磷脂酶联合DNA酶(PhD)等三种方法对猪食道粘膜下层的脱细胞条件进行探索,并对支架脱细咆前后的力学性能进行比较分析.实验结果显示HSD和SD二种方法去除细胞效果明显;食管粘膜下层经上述这三种方法处理后,其力学性能均受到了一定程度的影响,而其中SD法处理的脱细胞基质力学性能与正常组织的比较相近.SD法对猪食管粘膜下层脱细胞效果较好,同时较大限度地保留了食道粘膜下层组织的力学性能.
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脱细胞神经基质材料在周围神经修复中的研究进展
脱细胞神经基质是天然的神经支架结构，即采用适当方法去除同种异体(或异种)神经中的细胞及髓鞘成分，保留各层神经膜性结构支架。脱细胞基质构建的人工神经具有以下特性：可接纳神经轴突长入，对轴突再生起机械引导作用，残留部分生物活性因子。各种物理方法尽管取得一定的效果，但均无法清除细胞和髓鞘崩解产物，也即无法根本上降低移植物的抗原性，从而制约了这些方法的应用。应用三硝基甲苯X -100和脱氧胆酸钠溶液脱细胞较为彻底。既往研究表明，脱细胞神经进行宿主再细胞化后进行异体神经移植修复大鼠周围神经较短缺损，效果与不进行宿主再细胞化的脱细胞神经无显著性差异。在修复较短缺损(<3 cm)时，可能再细胞化意义不大，修复较长缺损(>3 cm)时，再细胞化可能会弥补宿主细胞迁移能力的不足。建立标准化、可普遍接受的动物实验研究模式非常必要。选择大动物为实验对象，力求尽可能接近人体生理功能；建立对损伤和修复效果的评估标准，获得大量有效、可靠的实验数据，将使实验研究成果更具实际意义和临床应用价值。
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脱细胞基质在尿道修复中的应用
细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是组织附着的基本框架和代谢场所,目前研究的ECM 替代物主要分为天然材料和人工合成材料.脱细胞基质(acellular matrix grafts,AMGs)材料是对天然的ECM 进行脱细胞处理而获得的天然ECM 替代物,能为细胞创造尽可能接近体内的生长环境.
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同种和异种脱细胞半月板的制备及生物力学研究
目的：探讨人脱细胞半月板和兔脱细胞半月板的制备方法，比较两者生物力学性能差异。方法随机切取16个人半月板组成人脱细胞半月板组，随机切取16个兔半月板组成兔脱细胞半月板组，蒸馏水冲洗后采取Triton X-100和脱氧胆酸钠等试剂制备两组脱细胞半月板。用番红花O、甲苯胺蓝、AB染色和天狼星红染色等方法，分别对两组脱细胞半月板进行组织学观察，扫描电镜观察；用生物力学机测定两组脱细胞半月板在不同压缩比率下的瞬时形变恢复率，大形变恢复率及大受压强度。结果各种染色均显示两组脱细胞半月板的细胞陷窝内已无细胞结构，天狼星红染色均为阳性。电镜检查示人脱细胞半月板组和兔脱细胞半月板组表面均有大量空虚的陷窝。压缩比率在40％时，人脱细胞半月板组的瞬时形变恢复率为（78.99±1.36）％，兔脱细胞半月板组的瞬时形变恢复率为（78.32±2.21）％，两组的差异无统计学意义（F＝1.597， P＞0.05）。在形变≤40％的情况下，两组大形变恢复率均为100％。在压缩比率为20％（ F ＝39.030）、30％（ F ＝47.732）和40％（ F＝56.436）时，人脱细胞半月板组的大强度均大于兔脱细胞半月板组的大强度（ P＜0.05）。结论人半月板和兔半月板经去污剂等处理后，去除了细胞成分，保留了三维立体的细胞外基质，成功制备了人脱细胞半月板和兔脱细胞半月板。人脱细胞半月板的力学性能优于兔脱细胞半月板，可作为组织工程支架材料。
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小肠黏膜下脱细胞基质修复前尿道狭窄的疗效分析
目的 探讨小肠黏膜下脱细胞基质(small intestinal submucosa,SIS)修复前尿道狭窄的可行性和有效性.方法 2009年6月至2010年8月采用4层SIS补片修复治疗尿道狭窄患者18例.患者年龄20～69岁,平均38岁;尿道狭窄段3.5～7.0 cm,平均4.6 cm;术前大尿流率1.5～5.5 ml/s,平均3.8 ml/s.术中按需将SIS(长4.0～7.5 cm,宽 2.0 cm)植入尿道背侧缺损处,5-0可吸收线将SIS间断固定在阴茎海绵体上,SIS两侧与已剪开的狭窄段尿道作连续缝合,两端分别与尿道断端作间断吻合.结果 手术过程顺利,术后恢复好.随访6～18个月,平均10个月,患者未发生感染、排斥反应等并发症.17例排尿通畅,大尿流率14.0～44.0 ml/s,平均25.4 ml/s.尿道造影显示尿道通畅;术后4、6周尿道镜检查示SIS移植物与周围组织分界清楚;术后14周尿道镜检查SIS已降解,修复段尿道与周围组织间限消失,黏膜光洁完整,管腔无明显狭窄;植入SIS部位活检显示黏膜表层为上皮细胞.1例尿道下裂术后患者术后5个月出现轻度尿道狭窄症状,行尿道扩张治疗.结论 利用SIS修复尿道狭窄具有创伤小、抗感染力强的特点,可作为组织工程尿道修复重建材料修复部分尿道狭窄患者.
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兔自体耳软骨膜复合游离移植形成工程化软骨的实验研究
目的探求用软骨膜复合移植的方法形成自体软骨的可行性. 方法将兔自体耳软骨膜包裹异体耳软骨脱细胞基质材料复合游离移植于兔背部皮下(Ⅰ组),并在移植物附近皮下游离移植双层耳软骨膜(Ⅱa组)及单纯脱细胞的异体耳软骨基质(Ⅱb组)作为对照.在术后3周、6周分别取标本进行研究. 结果在3周、6周时,Ⅰ组与Ⅱa组成软骨细胞的增殖变化情况差异有显著性(P<0.05),Ⅰ组比Ⅱa组成软骨细胞的增殖明显旺盛,有的已经向软骨细胞转化,并有少量细胞外基质分泌,基质内软骨囊出现.Ⅱb组无成软骨细胞及软骨囊出现. 结论自体耳软骨膜与异体耳软骨脱细胞后的基质材料复合移植促进自体软骨生成.提示该基质材料有促进软骨膜细胞分化和生长的作用.
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脱细胞基质生物补片与聚丙烯补片在腹股沟嵌顿疝治疗中应用效果的前瞻性随机对照研究
目的 探讨脱细胞基质生物补片与聚丙烯补片在腹股沟嵌顿疝治疗中的临床效果及安全性.方法 采用前瞻性随机分组研究2013年5月至2015年5月,四川省人民医院60例腹股沟嵌顿疝患者作为研究对象.试验组采用脱细胞基质生物补片修补,对照组采用聚丙烯补片修补.对比分析2组患者手术时间、术后住院时间2组患者的复发率、手术切口感染、慢性疼痛、异物感等发生率情况.结果 试验组与对照组在一般资料、手术时间、术后住院时间方面比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).术后随访3年,2组患者复发率、切口感染率、慢性疼痛发生率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).对照组患者术后异物感发生率高于研究组,对照组的血清肿发生率低于试验组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 脱细胞基质生物补片治疗腹股沟嵌顿疝可降低术后异物感发生率,但不会增加复发率,具有一定的临床应用价值.
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同种异体气管软骨脱细胞基质构建组织工程化气管的初步研究
目的 初步探寻同种异体气管软骨脱细胞基质与向软骨诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)共同构建组织工程化气管的可行性.方法 分离并诱导宿主犬MSCs向软骨细胞分化,通过内蛋白多糖含量测量及Ⅱ型胶原免疫组化染色观察初步诱导效果.使用曲拉通化学消化法对供体犬气管软骨进行脱细胞处理,根据消化时间分组,观察气管软骨脱细胞基质制备效果.将诱导后MSCs与同种异体气管软骨脱细胞基质分别进行体外与体内复合培养,组织学及电镜下观察诱导细胞的生长情况,以进行构建组织工程化气管可行性初步分析.结果 宿主犬MSCs软骨方向诱导后诱导组细胞培养液内蛋白多糖含量为(42.48±2.32)μg/ml,较未诱导组(19.62±1.30)μg/ml明显增高(p<0.01),诱导组细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.HE染色及扫描电镜均可见120小时组供体犬气管组织黏膜细胞及软骨细胞完全消失,软骨基质结构完整.体外联合培养7天内可见诱导后MSCs在脱细胞软骨基质表面生长,14天时细胞逐渐凋亡;体内联合培养可见诱导细胞在软骨基质浅层生长,但基质内部未见细胞成分生长,并无新生软骨形成.结论 使用曲拉通化学消化法可成功制备结构完整的同种异体气管软骨脱细胞基质,但作为构建组织工程化气管的支架材料,其空隙率和贯通性仍需进一步改进.
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不同试剂脱除猪主动脉瓣细胞的对比研究
目的用不同方法去除猪主动脉瓣的细胞并比较效果,为组织工程瓣膜提供良好的实验材料.方法采用十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酯酸钠(SD)、曲拉通(Triton)X-100制备猪主动脉瓣脱细胞基质.标本进行大体、光镜、电镜观察,DNA提取、力学性能的检测并比较.结果SD无法完全脱除主动脉瓣瓣根内的细胞.Triton X-100和SDS可以完全脱除瓣膜细胞.Triton X-100较好的保持了主动脉瓣胶原纤维和弹性纤维的原有排列和分布,并有较好的力学性能.而SDS对瓣叶和瓣根血管壁中的纤维支架都造成了一定的损伤.SDS和Triton X-100脱细胞时间无明显差别.结论Triton X-100可以成功脱除猪主动脉瓣细胞,并较好的保持了主动脉瓣的结构和力学性能.
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碳化二亚胺交联并肝素化的血管脱细胞基质的组织相容性
目的 应用碳化二亚胺交联同种异体犬颈总动脉脱细胞基质,并且利用其双功能交联特性将肝素共价结合于脱细胞基质上,评价其组织相容性.方法 应用多步骤除垢剂-胰酶作用制备犬颈总动脉脱细胞基质,按脱细胞基质、碳化二亚胺和肝素的质量比1∶2∶1制备交联并肝素化的脱细胞基质,采用甲苯胺蓝染色法定性检测肝素结合;采用细胞毒性四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测其细胞相容性;采用大鼠皮下埋植实验检测其体内组织相容性,并进行免疫组织化学和透射电镜检测.结果 碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质的形态和强度无明显变化,甲苯胺蓝染色定性地显示了肝素与支架的结合;细胞毒性实验显示碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质浸提液提高了内皮细胞的增值率;大鼠皮下埋植实验显示,交联并肝素化的脱细胞基质有良好的组织相容性,并且促进成肌纤维细胞浸润.结论 碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质具有良好的组织相容性,同时能够促进细胞的再分布过程.
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碳化二亚胺交联犬颈总动脉脱细胞基质的组织相容性初步研究
目的 应用碳化二亚胺交联同种异体的犬颈总动脉脱细胞基质,对其进行组织相容性评价.方法 应用多步骤除垢剂-胰酶作用制备犬颈总动脉脱细胞基质,按脱细胞基质与碳化二亚胺质量比1:1和1:2制备不同交联程度的脱细胞基质.通过体外降解率,细胞毒性MTT实验和大鼠皮下埋置实验对交联效果和组织相容性进行评价.结果 经碳化二亚胺交联的脱细胞基质形态上无明显变化,HE染色纤维排列规则无断裂.0.1%Ⅱ型胶原酶作用下,交联的脱细胞基质的降解率较单纯脱细胞基质显著降低,交联程度高的脱细胞基质较交联程度低的脱细胞基质降解率低.细胞毒性MTT结果显示碳化二亚胺交联的脱细胞基质细胞毒性分级为0～1级,无细胞毒性.大鼠皮下埋置实验显示交联的脱细胞基质抵抗组织酶降解的能力显著提高,同时免疫反应减轻.交联程度高,效果越明显.结论 碳化二亚胺交联的脱细胞基质具有良好的组织相容性和抗组织酶解能力,作为血管移植物和组织工程化血管的支架材料有广阔的应用前景.
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利用脱细胞基质预构小口径组织工程血管的实验研究
目的 在犬腹腔内预置脱细胞基质后形成结缔组织管,观察将其作为血管替代物的力学特征及移植于自体股动脉后的组织结构变化.方法 在犬腹腔内埋置长8～12 cm用硅胶棒支撑的制备好的脱细胞基质,3周后将硅胶棒周围形成的管状物作为血管替代物移植于自体股动脉,同时对此管状物作力学、组织学检测及与颈动脉、股静脉的对比分析.在移植术后6个月观察血管通畅情况.光镜、透射及扫描电镜观察替代物的组织结构.结果 ①血管替代物的力学性能弱于正常动脉而强于正常静脉.②组织学观察:形成的管状物内腔有少量的间皮细胞黏附;弹性纤维、胶原纤维结构较完整;纤维网中充满成纤维母细胞.6个月后内皮细胞在替代物内壁覆盖连续,平滑肌细胞与对照组相近.③移植6个月后脱细胞基质组血管全部通畅.结论 ①用脱细胞基质预构的血管替代物力学性能符合血管移植、血运重建的需要.②所形成的血管替代物移植6个月后组织相容性良好,替代物管壁厚度及组织结构已接近正常血管.
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人肺癌H460细胞在脱细胞化鼠肺基质支架中的生长
目的 探索人肺癌细胞在用灌注法脱细胞的鼠肺基质支架中生长的可行性.方法 取成年SD大鼠心肺组织,利用0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液及1％ TritonX-100溶液对离体的鼠肺行灌注法脱细胞,将人肺癌H460细胞株种植于脱细胞化鼠肺基质中,并将其置于特制的生物反应器中灌注培养l～2周.结果 脱细胞化后的鼠肺基质去除了大鼠自身细胞,保留了细胞外基质结构.H460细胞在脱细胞化鼠肺基质支架中生长.结论 人肺癌H460细胞株能在去细胞化的鼠肺基质支架中生长,这种间接体内模型的成功建立对人类肺癌的生物学进展研究有重要的意义.
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猪腹膜脱细胞基质联合微骨折技术修复兔膝关节软骨缺损
目的:检测猪腹膜脱细胞基质(pig peritoneum-derived acellular matrix,PPAM)支架材料联合微骨折修复兔膝关节软骨缺损的效果.方法:采用CCK-8 Kit测定SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)在PPAM支架上的生长状态,Live/Dead染色观察细胞在PPAM支架上的活性.用直径4mm环钻造成深度约1.5 mm的新西兰大白兔膝关节软骨缺损,微骨折术后将PPAM支架植入软骨缺损处,单纯微骨折技术(Microfracture,MF)作为对照组,分别在第6周、12周和24周取材.大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原(COL Ⅱ)免疫组化染色检测软骨缺损修复的效果.结果:CCK-8 Kit和Live/Dead染色结果显示PPAM支架支持细胞生长和增殖,无细胞毒性.大体观察和组织学检测显示PPAM联合MF修复软骨缺损能促进软骨缺损填充组织的质量,组织学评分优于单纯MF组.结论:PPAM支架是一种有良好生物相容性的天然材料来源组织工程材料,联合MF技术能促进关节软骨缺损的修复.
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牦牛牛心包在抗钙化心脏瓣膜中的应用研究
目的 探讨牦牛牛心包用作抗钙化心脏瓣膜材料在经导管主动脉瓣置换术应用中的可行性.方法 以黄牛牛心包和商品化的赛诺产品作对照,先对牦牛和黄牛牛心包进行脱细胞处理,然后分别用苏木精-伊红(HE)染色和DNA检测试剂盒定性和定量分析脱细胞效果.采用戊二醛和京尼平两种交联剂分别对上述脱细胞牛心包进行交联,在检测力学性能、热力学稳定性和生物相容性的基础上,将经交联处理的脱细胞牛心包埋植于幼年Wistar大鼠皮下2～4周,取材后进行组织学染色和组织钙化情况分析.结果 经脱细胞处理后的牦牛牛心包几乎不可见细胞核,DNA含量由(0.90±0.13)μg/mg降低至(0.09±0.02)μg/mg,脱细胞后DNA含量远低于赛诺产品(P<0.001).牦牛脱细胞牛心包及戊二醛、京尼平交联牦牛脱细胞牛心包的力学强度均大于相应的黄牛牛心包对照组(均P<0.05),其中戊二醛交联牦牛脱细胞牛心包的大应力高[(8.44±2.61)MPa],高于赛诺产品组[(7.92±1.81)MPa](P<0.05).交联前后的牦牛脱细胞牛心包的热皱缩温度均略高于黄牛脱细胞牛心包,但差异均无统计学意义(均P>0.05).经戊二醛或京尼平交联后,牦牛脱细胞牛心包的溶血率和细胞增殖率与黄牛脱细胞牛心包相近(均P>0.05),但皮下埋植材料组织再生能力劣于黄牛脱细胞牛心包,钙化程度略高于黄牛脱细胞牛心包(均P>0.05),皮下埋植4周戊二醛交联组的钙含量为32.62～65.49μg/mg.结论 牦牛牛心包较黄牛牛心包具有更优异的力学性能和热力学稳定性,其生物相容性也可满足经导管主动脉瓣置换术的要求.
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天然生物材料支架的应用
天然生物材料支架具有与细胞外基质结构相似,生物相容性好等特点,在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有明显的优势.羊膜取材容易,易于加工处理,无毒无刺激性,具有抗微生物的特性和促进组织修复的生物学作用;小肠粘膜下层无免疫性,含有多种生长因子,具有促进细胞黏附、增殖和分化等作用.血管、膀胱、软骨等脱细胞基质分别用于相应的组织缺损修补,易达到结构再生和功能的恢复.本文就上述支架材料在组织上程中的应用进行综述.
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三种组织工程鼓膜支架材料的生物相容性
背景:自体组织修复鼓膜穿孔存在增加手术创伤、取材有限等缺点,构建组织工程鼓膜是鼓膜穿孔治疗的发展方向.目的:构建3种不同材料的组织工程鼓膜支架材料,并评价其生物相容件.设计、时间及地点:随机对照动物实验,细胞学体内观察,于2004 08/2005 02在解放军第四军医大学组织工程中心完成.材料:将健康小猪的硬脑膜、真皮及人羊膜进行脱细胞处理.方法:将颅先培养的豚鼠鼓膜成纤维细胞种植于 3种材料表面,观察成纤维细胞的生长状态;18只豚鼠随机分为3组,于右侧背皮下分别埋植制各的脱细胞硬脑膜、真皮及人羊膜.主要观察指标;3种脱细胞生物支架材料的显微结构及组织相容性.结果:3种脱细胞材料均为网状结构,无仟何细胞及细胞残核存在;豚鼠鼓膜成纤维细胞能够很好地贴附于3种脱细胞材料生长,无细胞毒性;将3种组织材料分别埋植于豚鼠皮下后,无埋植材料排出现象,1周时植入材料周围有较明显炎症反应,其中以脱细胞真皮周围组织反应较轻,4周时炎症反应消失.结论:通过脱细胞方法可以成功建立具有良好生物相容性的组织工程鼓膜支架材料;3种材料中以脱细胞猪真皮的生物相容性佳.
