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周围神经再生早期过程中内源性和外源性巨噬细胞数量变化的实验研究
目的:周围神经再生过程中巨噬细胞发挥了重要的作用,然而目前对于神经内内源性和外源性巨噬细胞的具体作用了解的却很少,因此本实验研究了小鼠坐骨神经损伤后早期再生过程中内源性和外源性巨噬细胞数量比例变化的情况,探索周围神经再生的规律.方法:移植CAG-EGFP转基因小鼠的全骨髓有核细胞到骨髓灭活野生型C57B1/6小鼠体内建立嵌合体小鼠模型.待移植成功3个月后夹伤小鼠一侧坐骨神经,并在损伤后第2、7、14和28天取材、切片,使用巨噬细胞特异性抗体CD68进行免疫荧光染色,分析损伤神经段中内源性巨噬细胞(CD68+/EGFP-)、外源性巨噬细胞(CD68+/EGFP+)的数量及其比例变化情况.结果:①夹伤骨髓移植模型小鼠坐骨神经后,参与坐骨神经损伤修复的巨噬细胞可分为两类,即内源性巨噬细胞(CD68+/EGFP-)和外源性巨噬细胞(CD68+/EGFP+)；②夹伤坐骨神经后,浸润的总巨噬细胞数量从第2天开始逐渐增加,到第14天达到高峰,约为正常情况下的60倍,随后逐渐减少；③起初外、内源性巨噬细胞间的比例是1:1,差值大出现在损伤后第14天为4:1.结论:小鼠坐骨神经夹伤后,内外源性巨噬细胞共同参与了受损神经组织远心段的修复和再生过程,损伤初期发挥作用的主要是内源性巨噬细胞,随后大量浸润的外源性巨噬细胞占主导作用.本实验首次连续观察并定量分析了神经损伤后早期内源性和外源性巨噬细胞的数量改变,证实了瓦勒氏变性过程中内源性和外源性巨噬细胞在不同阶段对巨噬细胞总量的贡献作用.
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牛膝活性提取物对大鼠坐骨神经横断的修复作用
目的:研究牛膝活性提取物(ABPPk)对大鼠坐骨神经横断的修复作用.方法:SD大鼠随机分为5组,ABPPk低、中、高剂量组(剂量分别为2.5、5.0、10.0 mg/kg),阳性对照组(弥可保,0.13mg/kg),生理盐水组(阴性对照).行大鼠左侧坐骨神经横断缝合术,术后每日腹腔注射给药.于术前1d和术后1、7、14、21、28 d行热痛阈实验,测定大鼠热痛阈值;术后7、14、21、28d行足迹实验,测定大鼠坐骨神经功能指数;术后28 d行电生理检测,测定大鼠复合肌动作电位;透射电镜观察大鼠再生有髓神经纤维的髓鞘厚度和髓鞘板层数目;行Masson三色染色观察大鼠腓肠肌肌纤维横截面.结果:与生理盐水组相比,ABPPk中、高剂量组大鼠热痛阈值、坐骨神经功能指数、复合肌动作电位幅度、再生有髓神经纤维髓鞘厚度、板层数目及腓肠肌肌纤维横截面积均增高,各剂量组之间呈量效关系.结论:ABPPk有利于轴突再生和髓鞘形成,能促进大鼠周围神经损伤后功能和形态的恢复.
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骨髓间充质干细胞在周围神经再生中的应用
干细胞是存在于胚胎和成体中的一类特殊细胞,它能长期地自我更新,在特定条件下具有分化形成多种终末细胞的能力.骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSC,以下简称MSC)就是来源于骨髓基质中的一类成体干细胞.世界上每年由于车祸、锐器、枪弹等外伤造成周围神经损伤的病例很多,运用组织工程化神经来修复周围神经损伤已经成为一个研究热点.
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复合胶原酶消化法制备高纯度小鼠雪旺细胞
目的 建立高效、快速获得大量高纯度雪旺细胞的方法,为组织工程神经构建提供优质、足量的种子细胞.方法 取新生6～7 d的小鼠,在解剖显微镜下分离双侧坐骨神经,0.25%复合胶原酶37℃消化90 min,然后将细胞悬液接种于预先用层粘蛋白铺盘的培养瓶,贴壁培养48 h后,0.05%复合胶原酶37℃消化30 min,振荡分离雪旺细胞与成纤维细胞.经过两次纯化后,运用免疫细胞化学和流式细胞仪检测所得的雪旺细胞的纯度.结果 经过两次纯化后,P75NTR免疫细胞化学及流式细胞仪检测证实,通过本方法可获得纯度为99%以上的雪旺细胞,每个25 cm2培养瓶可获得(102.8±5.9)×104个细胞.结论 复合胶原酶差速消化法是一种高效、快捷的雪旺细胞纯化方法,仅需5 d即可制备高纯度的雪旺细胞.
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离体施万细胞实验性高血糖损伤机制的实验研究
目的 同步观察高血糖对离体施万细胞增殖能力和神经生长因子(NGF)合成水平的影响,探讨周围神经再生时糖尿病性损伤的可能机制.方法 采用Brockes改良法从新生Wistar乳鼠坐骨神经组织分离纯化施万细胞.采用3H-TdR掺人法检测离体施万细胞的增殖能力,用ELISA法测定离体施万细胞NGF的合成水平.结果 经ABC法染色计数,抗S100免疫组化染色着色细胞的阳性率为(92±2)％,表明采用该法鉴定显示着色细胞为表达特异性抗原S100的施万细胞.高血糖组与对照组比较,细胞增殖能力和NGF合成显著受到抑制(P＜0.01).结论 离体施万细胞实验性高血糖损伤所致的增殖能力下降可能与高血糖状态下施万细胞的NGF合成减少密切相关.
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周围神经导管修复中神经营养因子的应用方式进展
神经再生是一个由细胞、因子、细胞外基质共同参与的复杂生物学过程.目前,周围神经再生修复的研究重点主要在设计制作有活性的复合神经导管,以模拟自体神经,完善功能恢复效果.本文对神经营养因子在活性神经导管中的应用方式进行综述.
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B6-St小鼠与C57BL/6小鼠周围神经再生能力的比较
目的 通过小鼠坐骨神经损伤模型,比较C57BL/6小鼠和B6-St小鼠(Short tail mice)外周神经再生能力的差异.方法 选用C57BL/6小鼠作为对照组,B6-St小鼠为实验组,每组各10只,雌雄各半,夹伤各组小鼠左侧坐骨神经,建立周围神经的损伤模型.手术后8d、12d、16d进行足迹实验,计算坐骨神经功能指数(SFI);手术后21 d,进行电生理检测,记录复合肌动作电位(CMAPs);计算小鼠双侧腓肠肌湿重比;夹伤一侧的腓肠肌制作病理切片并染色,检测肌纤维横切面积(CSA).结果 与C57BL/6小鼠相比,B6-St小鼠术后8d、12d、16 d SFI值略有下降(P＞0.05);B6-St小鼠坐骨神经夹伤处的复合肌动作电位和C57BL/6小鼠趋于一致(P＞0.05);腓肠肌湿重比组间差异无统计学意义(P＞0.05);根据病理切片统计分析,两组小鼠肌纤维横截面积CSA相似(P＞0.05).结论 B6-St小鼠与C57BL/6小鼠的周围神经再生能力相类似.
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壳聚糖在周围神经损伤修复中的应用
壳聚糖的细胞亲和性和修复外周神经损伤等方面的研究都有新的进展.壳聚糖作为外周神经损伤修复材料有良好的研究应用价值和开发前景.此文介绍了壳聚糖在修复外周神经损伤中的研究现状.
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HRP逆行示踪对人工组织神经移植物辅加NRF修复大鼠坐骨神经缺损的评价
目的:用HRP逆行示踪法评价人工组织神经移植物辅加神经再生素修复大鼠周围神经缺损的效果.方法:壳聚糖套管和聚乙醇酸纤维组成人工组织神经移植物并辅加神经再生素,修复大鼠的坐骨神经缺损(10mm).术后24周时,进行大鼠HRP逆行示踪试验.结果:脊髓及背根神经节中均出现数量不等的被HRP标记的神经元胞体.结论:人工组织神经移植物辅加神经再生素对缺损的神经修复具有良好的桥梁作用和促神经生长作用.
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自体骨髓间充质干细胞组织工程化神经修复坐骨神经缺损的研究
目的:研究医用人工组织神经移植物与自体骨髓间充质干细胞构建成的组织工程化神经桥接修复周围神经缺损的能力.方法:采用自体骨髓间充质干细胞组织工程化神经桥接毕格犬5cm缺损的坐骨神经,桥接组n=5,缺损组n=5.术后定期观察术肢运动功能情况.术后6月,进行电生理学检测,并对再生神经和靶肌进行形态学观察.结果:桥接组术后6月,组织工程化神经移植物已完全降解,再生神经组织修复了坐骨神经5cm缺损,动物术肢承重能力恢复较好,行走、奔跑或上下楼梯时两后肢比较协调;而缺损组动物术肢难以承重,两后肢运动极不协调.神经三色染色显示,桥接段再生神经纤维密集,形成大量的再生单位.电生理学检测,桥接组术侧均记录到了复合肌动作电位(CMAPs),而缺损组未记录到CMAPs.桥接组腓肠肌无明显萎缩,肌肉三色染色显示胶原纤维增生不明显.缺损组腓肠肌明显萎缩,胶原纤维增生明显.结论:自体骨髓间充质干细胞组织工程化神经桥接5cm坐骨神经缺损术后6月,再生神经修复了缺损,并在形态和生理功能上都得到了明显的恢复,靶肌实现了神经的重支配,动物术肢的运动功能取得了明显恢复.
关键词： 组织工程化神经 自体骨髓间充质干细胞 周围神经再生 毕格犬 -
神经生长颗粒对大鼠坐骨神经挤压伤修复的影响
目的:研究神经生长颗粒对大鼠坐骨神经挤压伤修复的影响.方法:雌性SD大鼠60只,麻醉后行坐骨神经夹伤术.术后第2天开始灌药,并随机分为5组:阳性对照弥可保组；实验组神经生长颗粒高、中、低剂量组；生理盐水阴性对照组.灌药后3周,通过对术后动物的整体观察,压伤段神经电生理学检测和腓肠肌组织学形态测量,评价修复效果.结果:灌药后3周,大鼠坐骨神经干复合肌动作电位(CMAP)和神经传导速度(MCV),NGG高剂量组与弥可保组比较差异无统计学意义,明显优于生理盐水组；腓肠肌肌湿重比,NGG高、中剂量组与弥可保组比较差异无统计学意义,均显著优于生理盐水组；胶原纤维面积NGG高剂量组与弥可保组比较差异无统计学意义,显著低于生理盐水组.结论:神经生长颗粒有明显的促神经再生和促神经功能恢复的作用.
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壳聚糖/聚羟基乙酸移植物桥接大鼠坐骨神经5mm缺损的研究
目的:探讨壳聚糖/PGA移植物桥接大鼠坐骨神经5mm缺损后神经再生的进程.方法:雌性SD大鼠24只,体重200±20g,随机分为3组,每组8只.行壳聚糖/PGA移植物桥接大鼠坐骨神经5mm缺损模型,实验分1W,2W,3W 3个时间点,分别于各时间点灌注取材,采用免疫组织化学染色方法观察坐骨神经再生的进程.结果:壳聚糖/PGA移植物桥接大鼠坐骨神经5mm缺损,1W时长人约1 500μm,2W时再生纤维已接近远端桥接处,长入距离约5 000μm,同时远端溃变的碎屑已基本清除;3W时可见部分再生神经纤维已完全通过神经移植物生长至损伤远端,同时可观察到局部有髓鞘蛋白P0的表达.
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丝素纤维与背根神经节体外生物相容性初步研究
目的:通过丝素纤维与背根神经节共培养观察其与神经组织的相容性.方法:采用丝素制备,背根神经节与丝素共培养,免疫细胞化学等方法.结果:培养7天后大量的细胞从背根神经节爬出,缠绕在丝素材料上.经免疫细胞化学染色激光共聚焦显微镜观察,示该类细胞主要为雪旺细胞.另可见大量的神经纤维从背根神经节发出,沿着丝素材料延伸.结论:丝素与背根神经节有良好的组织相容性,可适用于外周神经修复.
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影响周围神经再生的细胞学因素
周围神经再生过程涉及雪旺细胞的变性、增殖和迁移;巨噬细胞向损伤区的定向趋化,对变性雪旺细胞和崩解髓鞘的吞噬;轴浆的运输和轴突的再生等方面的变化,其间有多种细胞因子参与起作用.本文对影响周围神经再生的几种主要的细胞因素进行总结和分析.
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周围神经再生的细胞与分子机制
周围神经损伤和再生过程是相当复杂的,它涉及雪旺氏细胞(SCs)的变性、增殖和迁移;巨噬细胞向损伤区的定向趋化,对变性SCs和崩解髓鞘吞噬;轴浆的运输与轴突的再生等方面的变化,其间有各种各样的细胞因子、细胞骨架成分以及细胞间的信号分子参与和调控.对这些物质及其相互作用进行深入研究,是探索周围神经再生的本质和规律的必由之路,本文拟就近年来的有关神经再生的分子机制的研究概况作一简要综述.
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双向差速法制备高纯度雪旺细胞的实验研究
[目的]利用乳鼠的雪旺细胞与成纤维细胞贴壁及复合酶消化分离速度不同的特点,建立简单而快速提取和纯化雪旺细胞的方法.[方法]取3 dSD大鼠双侧坐骨神经,在解剖镜下剥离去除神经外膜,剪碎后用0.2％复合胶原酶( Collagenase NB4)消化,细胞悬液接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶差速贴壁30 rain,然后将细胞悬液移入一新的培养瓶培养48 h；用0.05％复合胶原酶37℃消化30 min,振荡分离雪旺细胞与成纤维细胞,培养48 h后在相差显微镜下观察细胞形态；计数、纯度测定；免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测所得的雪旺细胞的纯度.[结果]经过2次纯化后,每25 cm2培养瓶可获取约(117.2+3.4) xl04个细胞；第一轮纯化后雪旺细胞纯度达86.99％±1.53％,经2次纯化后纯度为98.32％ +0.12％,两轮纯化之间有显著性差异,P<0.001；P75NTR免疫细胞化学鉴定细胞为阳性,流式细胞仪检测雪旺细胞纯度达97.9％.[结论]双向差速复合胶原酶消化法是一种高效、快捷的雪旺细胞纯化方法.
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神经生长因子促进周围神经血管形成的实验研究
[目的]探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)在大鼠坐骨神经再生过程中促进血管形成的作用.[方法]利用自行研制的梭形双通道桥接管桥接36只SD大鼠坐骨神经长10 mm缺损.将动物随机分为2组,A组:医用几丁糖凝胶组;B组:医用几丁糖凝胶+NGF和医用几丁糖凝胶+睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF).术后4、8、16周观察再生神经的大体形态,并用HE染色和透射电镜观察再生神经的束间及束内血管分布.[结果]A组2支管内再生神经大体观察无明显差异,B组NGF侧再生神经外观呈粉红色或淡红色,质脆,弹性差;CNTF侧再生神经呈淡黄性,质韧,弹性佳.HE染色见NGF侧再生神经较CNTF侧再生神经排列紊乱,其束间及束内的血管较多见;超微结构示:B组NGF侧再生神经较少,但可见较多的成纤维细胞和丰富的新生血管.[结论]虽然NGF对周围神经再生的促进作用不及CNTF,但其在神经再生的早、中、晚期均具有较为明显的血管形成作用,其作用机制可能与成纤维细胞增殖密切相关.
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小间隙影响周围神经再生的组织学与图像研究
目的:通过再生神经的特征进行组织学和图像分析对比找出一个使周围神经缺损自行修复的佳间隙.方法:将大鼠双侧坐骨神经外露于10倍显微镜下,实验侧部分切除坐骨神经后留有3.0、5.0、7.0和10.0mm的间隙用预制的动脉套接坐骨神经两端,对照侧坐骨神经切断后直接吻合,8周后各组行组织学和图像分析对比.结果3.0、5.0mm小间隙神经再生好,7.0mm再生差,而10.0mm再生神经没达到远端.结论:3.0～5.0mm小间隙有利于周围神经再生.
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周围神经损伤治疗进展
周围神经是指脊髓经椎间孔传出的分布至躯干及四肢的由运动、交感、感觉三种纤维组成的混合神经。周围神经损伤是指上述神经因某些因素的损伤及缺血再灌注损伤造成神经传导功能障碍、神经轴索中断或神经断裂，导致躯干和四肢感觉、运动及交感神经功能障碍的一种临床病症〔1、2〕，可严重影响患者的劳动力。近年来，国内外学者对周围神经损伤的修复及治疗做了大量实验及临床研究，现综述如下。1 手术治疗手术治疗包括神经松解、缝合、转移移植术及修复术。神经缝合术是治疗神经轴索中断、神经断裂的有效方法，包括端端缝合、端侧缝合。周围神经断裂后，断端缝合处张力大小是影响神经修复的重要因素。王军义等〔3〕用周围神经断裂减张缝合术（包括外膜-外膜法、神经瘤外膜-外膜法、外膜-组织床法）治疗断裂神经96例（103条），优良率达84.4％。1990年，Klin等〔4、5〕提出用CO２激光点式缝合断裂神经，认为通过激光的作用重建外膜及束膜连续性，终达到神经纤维解剖及功能恢复，激光缝合与缝线缝合相比的优点是无异物、不易形成神经瘤，同时神经功能恢复快。早在40年代，Yong和Medavar等就采用纤维蛋白原凝集法粘合神经，但由于粘合力不强，效果不理想未被广泛采用。国内顾玉东〔6〕等用凝胶粘合技术修复大鼠左侧坐骨神经，结果表明，凝胶粘合瞬间神经对位获得改善，术后8周粘合组神经纤维较缝合组平直，缝合口远端纤维较缝合组密，缝合口神经纤维通过率及远端轴突截面积均与缝合组有显著性差异。近年来，Viterobo等〔7〕将大鼠坐骨神经切断，将其远端缝合到同侧正常胫神经的侧方，或将一段移植神经用端侧缝合方式桥接于胫神经侧方和腓神经远端之间；结果显示，从胫神经发出的侧芽能通过缝合处长入远端腓神经内。充分说明通过端侧缝合，从正常神经主干能发出侧芽，使失神经支配的远端神经获得神经支配。董震〔8〕等用大鼠右侧腓总神经做神经修复模型进行端侧缝合，结果表明，周围神经可通过端侧缝合而再生，以束、外膜开窗及45°角的缝合方法为佳。周围神经断裂可用上述多种方法修复，但周围神经缺损的修复仍是一难题。采用自体神经移植效果较好，但其来源受限，并发症多。异体神经移植的实验及临床效果报道不很一致。Bain〔9〕用灵长动物行异体神经移植，同时口服免疫抑制剂环孢霉素A25mg／（kg*d），术后1年组织学检查见异体神经内神经纤维生长良好。陈书连等〔10〕用大鼠左侧颈外静脉内外翻转后，修复右侧坐骨神经10mm缺损，结果翻转组较常规组的再生纤维数目、髓鞘厚度、纤维直径以及运动神经传导速度均有提高，他们认为这是由于静脉外膜及其上的神经纤维内置入腔能更有效地发挥引导神经再生的作用。Masaki等〔11〕将小鼠坐骨神经邻近一小动脉通过硅胶管的纵向缺口置入管内，发现神经再生良好，再生的神经内有新血管生成，且再生的轴突密度高。有人设计了硅胶管内纵行置入数条细线，以引导轴突再生，获得成功，但再生的神经位于管内，易出现神经纤维化、慢性神经卡压，需二次手术取出导管。近国外有人设计出由两层不同材料组成的神经导管，内层是具有渗透性的生物薄膜，外层是多孔的可吸收材料支持层。此导管能对神经再生起良好的支持、趋化作用，有利于营养物质的交换，保持类似神经外膜的性能〔12〕。此外，复合桥接体的发展为周围神经再生开辟了一个新天地。理想的桥接体应符合以下条件：①具有良好生物相容性，接触引导神经再生；②具有适合于连接损伤神经两断端的大小和长度；③桥接体内含各种再生需要素，含有能产生趋向引导及提供轴突生长基质的物质；④良好血运；⑤保护再生轴突，避免瘢痕组织侵扰。邵景范、罗永湘〔13〕报道了白芨胶载体神经生长因子（NFG）促进周围神经再生的实验研究，与对照组比较有明显再生促进作用，其解释为NFG注入硅胶管内，在水溶液中活性易丧失，小量NFG还能从桥接管两端的微小间隙漏出。而白芨胶组NFG可逐渐吸收而持续缓慢释放，在较长时间内发挥NFG的生物学作用。白芨胶还能作为一种基质成分使神经再生过程基质桥形成提前，间接促进细胞移行和神经再生。
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失神经支配骨骼肌萎缩治疗的实验研究进展
周围神经损伤后可导致肢体不同程度的功能障碍甚至完全丧失劳动能力.周围神经再生是临床医学经常遇到而又亟待解决的难题.显微外科技术的应用,大大提高了周围神经损伤的修复水平,然而其术后功能恢复并不理想[1].周围神经损伤虽然局限于神经元轴突部分,但功能恢复涉及神经元胞体,轴突和靶器官.故对周围神经损伤的研究主要着眼于三个环节,即保护神经元、提高神经再生速度和防治失神经骨骼肌萎缩.其中任何一个环节延缓或发生了不可逆性损害,均将影响肢体功能的康复,从而终影响疗效.骨骼肌的发生、功能和结构的维持都受到运动神经的支配和调节[2],一旦失去神经支配,将丧失收缩功能,肌肉体积减少,肌纤维会逐渐萎缩,并逐渐被结缔组织所替代,肌细胞同时也发生一系列的改变[3].
