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酪氨酸蛋白激酶抑制剂RG50864对血小板衍生生长因子诱导的肺动脉平滑肌细胞增生的影响
目的研究酪氨酸蛋白激酶抑制剂RG50864对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的肺动脉平滑肌细胞增生的影响.方法用原代培养的小牛肺动脉平滑肌细胞,采用细胞计数法,噻唑蓝(MTT)比色法及Giemsa染色法对PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增生等情况进行分析.结果与对照组相比,RG50864处理组能在24、48、72 h显著地抑制PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增生,且呈剂量依赖性.结论RG50864可显著地抑制PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增生.
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用牛颈静脉制备抗栓 抗钙化性右心流出道修复材料的实验研究
目的论证用牛颈静脉制备抗栓、抗钙化右心流出道修复材料的可行性.方法用EX-313交联牛颈静脉带瓣胶原管道并用肝素处理其内壁,裁成带单瓣的补片,用其扩大7条犬的肺动脉,同时建立用戊二醛制成的补片扩大肺动脉对照模型.在6个月内观察补片的抗栓、抗钙化、内皮化及组织重构的情况.结果在抗栓、抗钙化、内皮化及组织重构方面EX-313及肝素处理的牛颈静脉明显优于戊二醛处理者.结论经亲水性交联剂EX-313及肝素处理内壁的牛颈静脉有可能成为制作重建右心流出道的基本材料,在进一步研究的基础上它也可能成为组织工程带瓣管道的支架材料.
关键词： 牛 颈静脉:抗钙化:肝素:带瓣管道 -
四苯基卟啉锰配合物与牛血清白蛋白相互作用的研究
用分光光度法研究了四苯基卟啉锰配合物(Mn3+TPPCI)与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用，测定了二者相互作用的平衡常数和热力学参数，发现二者之间可形成1:1的配合物，BSA存在一个强结合位。在它们的相互作用过程中发生了氧化还原反应，一个电子上BSA转移至MnTPPCl。
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河北省O157:H7大肠杆菌病原学和流行病学研究
河北省首次在腹泻病人和牛便中检出O157:H7出血性大肠(EHEC)杆菌.共监测水及水生动物、蔬菜、牛肉、家禽及家畜粪便、腹泻病人便12种657份样品,其中河湖水72份、水生动物11份、蔬菜类74份、牛肉44份、牛便111份、猪便21份、鸡便23份、鸭便16份、鹅便10份、腹泻病人便275份.在275份腹泻病人粪便中检出2株O157:H7大肠杆菌,检出率为0.73%.111份牛便中检出O157:H7大肠杆菌,检出率为1.80%,其它样品中均未检出.根据菌落形态、菌体形态、血清学试验、生物化学试验等均符合EHEC O157:H7大肠杆菌特性,并测定了其溶血素及Vero细胞毒素(LSF),均为阳性.通过病例调查,感染因素可能为个人卫生差及生食蔬菜.
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孵育温度对丁二醇改性处理戊二醛鞣制的牛心包生物瓣膜防钙化性能及热皱缩温度的影响
目的:探讨2,3-丁二醇不同孵育温度改性处理戊二醛鞣制的牛心包对其防钙化性能及热皱缩温度的影响.方法:实验于2003-06/12在中南大学湘雅二医院胸心外科实验室完成.收集1～3岁新鲜黄牛心包8个,将每个牛心包均分成5份,共分成5组,分别置入4℃,20℃,30℃,40℃的纯2,3-丁二醇溶液孵育改性60 d,对照组置入4℃的3 g/L戊二醛Hepe缓冲液中,每组8份试片.选择刚离乳SD雄性大鼠8只,SD大鼠背部作两个纵形切口,将经过处理的同一牛心包来源的5份心包试片植入切口,第1个纵形切口两侧各1片,第2个纵形切口两侧及下部各1片,相距≥2 cm,植入牛心包试片60 d后,取出各组试片,用原子吸收火焰法检测组织钙含量,并观察牛心包试片热皱缩温度.结果:8只SD大鼠所获全部标本进入结果分析.①组织钙含量检测结果:20℃,30℃和40℃丁二醇组组织钙含量相似,但明显低于对照组和4℃丁二醇组[(8.18±7.22),(21.56±26.53),(3.24±2.57),(138.36±69.23),(192.83±2.86)mg/g,(P=0.002～0.016)].②热皱缩温度检测结果:20℃,30℃及40℃丁二醇组明显低于对照组及4℃丁二醇组[(83.31±0.46)℃,(82.96±0.33)℃,(82.44±0.42)℃,(83.75±0.46)℃,(83.67±0.41)℃,(P＜0.05)];40℃丁二醇组明显低于20℃丁二醇组(P＜0.001).结论:2,3-丁二醇的不同孵育温度改性处理戊二醛鞣制的牛心包,其中4℃组防钙效果差,20℃,30℃,40℃组均具有明显的防钙化效果,三者之间无明显差异.热皱缩温度随着孵育温度的升高而降低.但改变幅度不是很大.均高于80℃,改性后的牛心包在生理温度下不会发生组织热皱缩.
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光氧化反应增加去细胞牛颈静脉的组织稳定性
目的:观察去细胞及去细胞后光氧化反应对牛颈静脉的组织稳定性的影响.方法:实验于2005-06/09在中南大学湘雅二医院胸心外科实验室完成.①将新鲜牛颈静脉纵形剪开成血管片,横行切取牛颈静脉血管片成6根血管条,随机分为6组,新鲜组,去细胞组,及根据不同的光氧化处理时间将去细胞结合光氧化处理组分为去细胞后光氧化反应12,24,36和48 h组.②通过测定处理前后的组织厚度、热皱缩温度、抗张强度及组织蛋白提取分析来比较组织稳定性.结果:①各组在处理前后的厚度:去细胞处理后血管片比处理前变薄[(0.36±0.85),(0.43±0.94)mm,P＜0.05],而去细胞再光氧化处理后的血管片厚度无明显改变(P＞0.05).②各组血管片组织稳定性评价:去细胞组热皱缩温度及抗张强度比新鲜组、去细胞后光氧化反应12 h组、24 h组、36 h组、48 h组明显降低[热皱缩温度:(69.75±0.54),(72.50±0.53),(73.80±0.59),(74.40±0.46),(75.10±0.21),(75.20±0.26)℃,P＜0.05;抗张强度:(3.13±0.94),(5.19±0.65),(4.54±0.88),(4.67±0.60),(5.55±0.43),(5.80±0.82)MPa,P＜0.05];经光氧化处理后热皱缩温度上升且高于新鲜组(P＜0.05);而大应力与新鲜组比较无明显变化(P＞0.05);去细胞后光氧化反应组的组织蛋白提取量明显少于新鲜组及去细胞组,且随光氧化反应时间延长,组织蛋白提取量逐步减少.结论:去细胞处理降低了牛颈静脉的组织稳定性,而经光氧化进一步处理后组织稳定性增强,且随光氧化时间延长组织稳定性增强.
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基因重组人骨形成蛋白2生物学活性及其复合异种骨体内异位植入的成骨活性
目的:观察复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性及其量效关系.方法:实验于2001-07/2002-05在安徽医科大学完成.以基因重组人骨形成蛋白-2与去抗原部分脱钙牛松质骨载体复合,制成复合基因重组人骨形成蛋白2的异种骨(基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨)植入小鼠右股部肌袋内.将6周龄雄性BALB/C小鼠144只,随机分成4组,植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组;植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白-2/脱钙牛松质骨骨粒组,单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组,单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组,每组36只.术后7,14,21 d取材,通过大体观察、X射线影像学、组织学和骨计量学方法检测各组的诱导成骨活性.结果:144只实验动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析.①单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组于光镜下见大量间充质细胞增殖,局部软骨组织生成,软骨细胞成熟.②脱钙牛松质骨与基因重组人骨形成蛋白2复合后,小牛骨松质结合基因重组人骨形成蛋白2呈实体性疏松绒毛结构,骨松质孔洞内填充云絮状基因重组人骨形成蛋白2物质,两者结合良好.③各组术后不同时间组织学检查结果为:植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7 d出现软骨分化的小鼠有5只,苏木精-伊红染色观察,标本大量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,14 d有4只出现新骨诱导的现象,出现多处分散的骨软骨组织,多发生于植骨周围,21 d见散在软骨岛和稀疏退变小软骨岛,部分小鼠有新骨形成,但无骨髓及板层骨形成.植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7 d出现软骨分化的小鼠有3只,见少量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,有零星的间充质细胞分化、过渡为软骨细胞;14 d有部分标本可见骨及软骨组织,有的可见稀疏小软骨岛存在,21 d有4只出现新骨诱导.单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组主要表现为纤维结缔组织包绕植骨,植骨周围见组织细胞增生.单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组以肌纤维为主,无典型软骨细胞出现.表现为正常横纹肌切面和肌间隔结构.④术后不同时间植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组和植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组的碱性磷酸酶活性和钙含量均高于对照组,前者高于后者,具有统计学意义(P＜0.05).结论:①基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨是高效诱导成骨材料,经处理的小牛松质骨是良好的缓释载体,提高了基因重组人骨形成蛋白2的骨诱导能力.②复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性与基因重组人骨形成蛋白2的含量成正比.
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新生牛跟腱胶原蛋白海绵与细胞的生物相容性
目的:采用新生牛跟腱制备生物医用胶原蛋白海绵,通过分别接种Vero细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤原代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸原代细胞至胶原蛋白海绵组织支架上,观察新生牛跟腱胶原蛋白海绵与3种细胞的生物相容性.方法:实验于2006-02/05在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成.①用新生牛跟腱经冰醋酸、胃蛋白酶等消化,经盐析、透析及冻干等处理后,制备成胶原蛋白海绵.②在六孔板中,将Vero细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤原代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸原代细胞分别接种于经紫外线、臭氧灭菌后的胶原蛋白海绵上,经37℃体积分数为0.05的CO2恒温培养;并用另一组细胞在凯氏瓶中培养作对照实验.用奥林帕斯倒置相差显微镜及JVC摄像系统观察、拍摄与记录细胞生长情况,并于培养11d,用考马斯亮蓝和苏木精-伊红染色,证实相差显微镜观察的结果.结果:①胶原蛋白海绵制备结果:用新生牛跟腱制备得到具有一定孔隙度的胶原蛋白海绵,经紫外线、臭氧灭菌后可进行细胞培养.②3种细胞在胶原蛋白海绵上和六孔板底的生长情况:3种细胞接种后5 h,在胶原蛋白海绵周围的六孔板孔底可看到Vero细胞已贴壁、伸展,个别细胞有分裂现象,在胶原蛋白海绵表面,隐约可见圆形细胞排列.Vero细胞和天祝白牦牛胚胎皮肤原代f2细胞接种72 h、岷县黑裘皮羔羊睾丸原代f2细胞接种48 h时,孔底细胞已经铺满单层,但与对照孔比较,生长速度较慢.②3种细胞用考马斯亮蓝细胞骨架染色和苏木精-伊红染色的结果:培养到第11天,3种来自不同动物、不同组织的细胞接种的胶原蛋白海绵支架孔中均有大量细胞良好生长,胶原海绵外观变得挺拔、透明、有韧性.结论:新生牛跟腱胶原蛋白海绵,对Vero细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤原代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸原代细胞无毒性,3种细胞均能在其上良好生长,但在体内是否会引起免疫排斥反应,还有待进一步研究.新生牛跟腱有望成为医用胶原蛋白海绵产品新的原材料.
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脂多糖刺激对牛单核细胞由来的巨噬细胞Toll样受体表达的影响
目的:研究牛末梢血中单核细胞由来的巨噬细胞在受到LPS刺激后细胞表面Toll样受体表达的变化.方法:试验采取3头日本黑牛外周血,进行分离得到外周血单核细胞,并用Repcell进行巨噬细胞的分离培养,7天后用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激细胞24小时后,通过RT-PCR测定巨噬细胞表面Toll样受体mRNA的表达以及细胞因子mRNA的表达.结果:在LPS刺激24小时后,IL-6、 TNF-α和IL-1βmRNA的表达量显著升高(P＜0.05),与此同时IL-8和IL-12p40 mRNA的表达量相对提高;TLR1和TLR10的转录物显著下降(P＜0.05),然而TLR2、4和6保持稳定.结论:巨噬细胞在受到病原刺激后通过提高IL-6、 TNF-α和IL-1β mRNA的表达量,从而提高了天然免疫的作用.该研究为探讨巨噬细胞在无然免疫中的作用奠定了基础.
关键词： 单核细胞由来的巨噬细胞 牛 Toll样受体 天然免疫 -
吉林省畜间布氏菌病动态模型
目的:研究吉林省羊和牛的布氏菌病的动态规律.方法和结果:分别建立并得到了1953～2000年羊阳性数(率)、1956～2000年牛阳性数(率)的自回归模型,以及羊阳性数(率)与羊免疫数(率),牛阳性数(率)与牛免疫数(率)的直线和指数回归模型.结论羊(牛)的免疫数(率)越高,羊(牛)的阳性数(率)越低.
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牛带绦虫病4例
带绦虫俗称寸白虫,是人体常见的绦虫,寄生于人体的带绦虫主要为猪带绦虫和牛带绦虫.猪带绦虫和牛带绦虫感染主要与生食或半生食猪肉或牛肉有关[1].
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科尔沁牛乳腺炎临床分离无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白2基因的克隆及序列分析
目的 克隆内蒙古东部地区科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白2(ancillary protein 2,AP2)基因片段,并进行序列分析.方法 根据GenBank中登录的牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因序列,使用生物信息学软件Primer 5.0设计1对特异性引物,以内蒙古东部地区乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板,扩增AP2基因片段,与pMD18-T Vector连接,转化至感受态E.coli JM109中,提取质粒,进行PCR及单、双酶切鉴定;将质粒pMD 18-T-AP2转化感受态E.coli JM109后,利用DNAStar分析测序结果,并对其推导的氨基酸序列进行抗原可及性分析,ProtScale在线程序分析其疏(亲)水性.结果 质粒pMD18-T-AP2经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;扩增的AP2基因序列长度为699 bp,编码233个氨基酸残基,与GenBank中登录的无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因核苷酸序列相似性达99％,有3个碱基出现变异(402:C→A;563:C→T;467:A→T),氨基酸序列有两处出现变异,分别为178氨基酸(V→A)和216氨基酸(E→V);该序列二级结构α螺旋分布C-末端较多,β折叠较丰富,分布较均匀,无规则卷曲分布在两端,亲水性指数相对较高,抗原性较好.结论 成功克隆出内蒙古东部地区科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因,为进一步研究AP2基因编码蛋白的抗原性奠定了基础.
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牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕的制备及裂解条件的优化
目的 制备牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕,并对裂解条件进行优化.方法 将裂解质粒pHH43电转入牛肠产毒素性大肠埃希菌中,37℃培养至A600值为0.6时,升温至42℃诱导裂解,制备菌蜕.同时对起始诱导A600值(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2)和培养基成分含量(2/3、3/4、4/5和正常含量)进行优化,并计算裂解效率.结果 在起始诱导A600值为0.6,培养基营养成分为正常含量的3/4时,裂解效率高,达99.93％.结论 成功制备了牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为进一步开展对其免疫效果和佐剂效应等研究奠定了基础.
关键词： 牛 产肠毒素性大肠埃希菌 菌蜕 裂解 -
牛乳腺炎无乳链球菌表面免疫相关蛋白及磷酸甘油酸激酶对奶牛的免疫保护作用
目的 分析牛乳腺炎无乳链球菌表面免疫相关蛋白(surface immunogenic protein,SIP)及磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)对奶牛的免疫保护作用.方法 制备SIP、PGK、SIP+PGK 3种亚单位抗原乳化免疫制剂,并设无乳链球菌全菌体裂解疫苗免疫组.均经科尔沁奶牛乳房基部乳上淋巴结附近皮下免疫,于初免后第0、14、42、56、70、84天,经颈静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测各组血清抗体滴度;初免后第43天,利用无乳链球菌临床分离株进行乳头感染试验,同时设未免疫对照组.结果 SIP抗原、PGK抗原及全菌体裂解疫苗组初免后第56天抗体滴度均达到峰值,分别为1∶6 600、1∶6 400和1:4 100;而SIP+PGK抗原组在初免疫后第70天达到峰值,为1∶9 600;SIP+ PGK混合抗原的免疫保护率达83.3％,与SIP抗原、PGK抗原及全菌体裂解疫苗组(免疫保护率分别为33.3％、41.6％和58.3％)相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 牛乳腺炎无乳链球菌SIP+PGK混合抗原的免疫保护率优于两种抗原的单独免疫效果,可免疫奶牛预防无乳链球菌性乳腺炎.
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水牛干扰素α的可溶性原核表达、纯化及其抗病毒活性
目的 在E coli中高效表达可溶性水牛干扰素α(recombinant bovine interferon alpha,rBoIFNα),纯化后检测其抗病毒活性.方法 采用RT-PCR方法从水牛肝脏总RNA中扩增IFNα基因,插入原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-IFNα,转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测后,使用HisTrapTM HP镍离子亲和层析柱进行纯化,并采用细胞病变抑法,在水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)/MDBK细胞滴定系统上检测其抗病毒活性.结果 核酸测序结果显示,rBoIFNα基因全长498 bp,与GenBank报道的牛IFNα C亚型基因核苷酸序列同源性为100％;表达的rBoIFNα蛋白主要存在于破碎菌体的上清中,表达量约占菌体总蛋白的63.8％;纯化的rBoIFNα纯度高达98.52％,能与牛IFNα多克隆抗体特异性结合,比活性为(3.6±0.2 5)×106U/mg.结论 成功在E.coli中高效表达了可溶性rBoIFNα蛋白,纯化的蛋白具有较强的抗病毒活性,为其临床应用奠定了基础.
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牛心肌肌钙蛋白T的提取、纯化及其单克隆抗体的制备
目的 提取、纯化牛心肌肌钙蛋白T( Cardiac troponin T,cTnT),并制备其单克隆抗体.方法 采用组织匀浆、蛋白层析技术提取、纯化牛cTnT,紫外分光光度法检测其浓度；SDS-PAGE检测其纯度；间接ELISA法检测其反应特性.将纯化的牛cTnT免疫小鼠,进行细胞融合,间接ELSIA法筛选阳性杂交瘤细胞株,采用小鼠体内法制备腹水.结果 纯化的两批牛cTnT浓度分别为0.246和0.336 mg/ml；相对分子质量约为37 000,纯度分别为86.02％和93.77％；纯化的cTnT蛋白可与鼠抗牛cT-nT单克隆抗体结合.共获得5株分泌抗牛cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,阳性杂交瘤细胞株3B10腹水抗体效价达1∶10240.结论 已成功提取、纯化了牛cTnT,并建立了稳定分泌抗牛cTnT单抗的杂交瘤细胞株,为cTnT检测试剂盒的国产化奠定了基础.
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牛视网膜微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究
目的:探讨牛视网膜微血管内皮细胞(bovine retinal capillary endothelial cells,BRECs)体外分离、培养方法,为研究视网膜血管性疾病提供一定的实验基础.方法:无菌条件下取出视网膜并剪碎,经筛网过滤、胶原酶消化获取视网膜微血管内皮细胞,接种于明胶包被的培养瓶中,原代培养时用不同的培养基筛选细胞,并在传代时利用差速黏附法以获得较纯BRECs,通过形态学观察和免疫组化方法鉴定BRECs.结果:用此法原代培养BRECs纯度达98%,混有的血细胞及神经组织细胞碎片在换液和传代过程中逐渐被去除,成纤维细胞和周细胞的污染可分别用不同的培养基和差速黏附法纯化去除.结论:该方法简单有效,获得的BRECs纯度高,生长状态良好,为研究眼部血管性疾病提供良好平台.
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牛颈静脉组织工程带瓣管道实验研究
目的:培养犬骨髓间充质干细胞,标记后种植于去细胞牛颈静脉,构建组织工程带瓣管道.方法:去除牛颈静脉细胞作为支架材料,评价去细胞效果.分离、培养和扩增犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为种子细胞,体外再细胞化牛颈静脉,构建组织工程带瓣管道.结果:去细胞处理后,牛颈静脉辩叶及血管壁内皮细胞、成纤维细胞去除完全,细胞外基质纤维呈波浪状排列整齐,结构完整.由犬骨髓分离出的BMSCs,SH2、Vimentin、α-SMA呈阳性;对CD34、Ⅷ因子、Laminin呈阴性,能满足组织工程种子细胞的需求.采用Hoechst荧光标记的种子细胞,可传入子代细胞,其荧光亮度无明显衰减.种子细胞种植7d后,细胞已经贴附于去细胞牛颈静脉上,部分深入到瓣叶支架内部.结论:犬骨髓间充质干细胞Hoechst标记后种植于去细胞牛颈静脉,构建组织工程带瓣管道,方法简单、可行.
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环氧化合物交联牛颈静脉带瓣管道的体内抗钙化性能评价
目的:探讨环氧化合物交联的牛颈静脉带瓣管道的体内抗钙化性能.方法:取新鲜牛颈静脉带瓣管道16根,分为环氧化合物交联组、戊二醛交联组,经二种不同的方法处理后,建立犬右室肺动脉重建动物模型,观察10个月,采用原子吸收光谱法测定牛颈静脉的组织钙含量;von kossa 钙盐染色观察组织钙化情况;并对比研究重建后牛颈静脉的组织结构变化.结果:经环氧化合物交联的牛颈静脉管道的钙化程度轻,管壁及瓣膜的抗钙化性能比经戊二醛固定处理的均有明显提高.结论:环氧化合物交联方法与传统的戊二醛交联方法相比较,能较好的提高牛颈静脉体内抗钙化性能.
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青海省大通种牛场和三角城种羊场布鲁杆菌病调查分析
青海省是布鲁杆菌病(简称布病)重流行省份,致病菌株主要以牛种、羊种为主.为掌握和控制种畜布病流行状况及对人群的危害,于2006年3-10月对青海省大通种牛场、三角城种羊场进行了布病调查.
