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孕妇HBsAg阳性对新生儿初次免疫后三年内乙肝表面抗体稳定性的影响
目的 探讨孕妇HBsAg阳性对其新生儿出生后3年内乙肝表面抗体(HBsAb)稳定性的影响,观察定期检查和及时加强/重复免疫对维持儿童乙肝疫苗免疫效果的作用.方法 对20例HBsAg阴性孕妇及24例HBsAg阳性孕妇分娩的新生儿初次全程乙型肝炎基因疫苗免疫效果进行3年的随访,对儿童中有HBsAb滴度下降至低于保护性滴度或转阴者(即不稳定者)及时复种,比较两组儿童HBsAh不稳定者所占比例,比较初次免疫后1个月及3岁时HBsAb的阳性率.结果 孕妇HBsAg阴性及孕妇HBsAg阳性两组儿童HBsAb不稳定者所占比例分别为[20.0%(4/20)和79.2%(19/24,),P<0.05];两组HBsAb阳性率在7月龄时分别为100.0%(20/20)和62.5%(15/24)(P<0.05),3岁时分别为85.0%(17/20)、91.7%(22/24)(P>0.05).结论 孕妇HBsAg阳性将降低其新生儿初次全程免疫后3年内HBsAb稳定性,通过每间隔半年至一年的定期检查和及时加强/重复免疫可维持乙肝疫苗免疫效果.
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足月新生儿母源性抗-HBs及其亚型的特性
目的 分析了解足月新生儿母源性乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)及其亚型的特性.方法 2006年12月至2007年02月在南京大学附属鼓楼医院住院分娩的单胎足月孕妇及其新生儿为研究对象,AxSYM全自动免疫分析仪定量检测63例抗-HBs阳性的单胎足月孕妇及其新生儿脐血婴儿和1月龄时的血清抗-HBs浓度,用固相酶联免疫法检测孕妇和脐血中抗-HBs 4种IgG亚型的含量,及其中和乙型肝炎患者血清中HBsAg的能力.结果 63例抗-HBs阳性孕妇分娩的新生儿脐血抗-HBs均为阳性,几何平均浓度为195.4 mIU/ml,明显高于孕妇平均水平141.6 mIU/ml(P<0.01).脐血抗-HBs浓度与母体水平高度相关(rs=0.976,P<0.01).无论是接种还是自然感染获得的抗-HBs,其4种IgG亚型均可通过胎盘,均以IgGl为主.1月龄婴儿抗-HBs平均浓度是脐血的64%,推测被动获得的抗-HBs衰减半衰期约41 d.脐血抗-HBs可中和乙型肝炎患者血清中HBsAg,其中和作用与抗-HBs浓度有关.结论 IgG型抗-HBs及其四种亚型均可通过胎盘,以IgG1为主.母源性抗-HBs可保护新生儿免受HBV感染.
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HBV感染与hTERT基因表达在肝细胞癌组织中的相关性研究
目的:研究hTERT基因在HBsAg阳性与阴性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者组织中表达的差异,探讨HBV病毒感染与hTERT基因表达在HCC中的相关性.方法:应用免疫组化(SP法)和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测73例HCC患者组织中hTERT蛋白及其mRNA的表达情况,其中HBsAg阳性53例,HBsAg阴性20例,比较二者表达的差异.结果:hTERT蛋白在HBsAg阳性HCC组织中的阳性表达为48/53,在HBsAg阴性HCC组织中阳性表达为12/20,两组病例hTERT蛋白表达阳性率差异有统计学意义,P<0.01;hTERT mRNA在HBsAg阳性HCC组织中阳性表达为46/53,hTERT mRNA在HBsAg阴性HCC组织中阳性表达为11/20,两组病例hTERTmRNA表达阳性率差异有统计学意义,P<0.05;统计学分析显示,HCC中HBsAg与hTERT mRNA的表达有显著关联性,与hTERT蛋白的表达强度成系统性的线性趋势,P<0.01.结论:HBsAg阳性HCC组织中hTERT基因表达的阳性率和阳性强度均明显高于HBsAg阴性HCC组织,差异有统计学意义,P<0.05;HCC中HBV病毒感染与hTERT基因表达之间具有相关性,提示在HCC发生发展中可能存在二者的相互作用.
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HBsAg阴性患者HBV隐匿性感染:110例临床分析
目的 分析隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)患者的临床特征.方法 纳入2012年3月-2014年1月于重庆医科大学就诊的HBsAg阴性、HBV DNA在检测值以下的乙肝患者110例.采用高纯度病毒核酸检测试剂盒提取血清HBV DNA,采用巢式PCR对HBV基因组C、S、X区进行扩增.对不同性别、年龄及血清学模式[单独抗-HBc(+)及抗-HBs(+)/抗-HBc(±)]患者,以及不同病因所致肝损害患者的OBI发生率进行分析.结果 以巢氏PCR结果2个或2个以上区段同时阳性判定为OBI,110例入选患者OBI阳性率为23.6％(26/110);不同性别、年龄段、血清学模式患者OBI发生率差异无统计学意义.肝功能异常组OBI发生率明显高于正常组(35.1％vs 11.3％),两者比较差异有统计学意义(P＜0.01);不明原因肝损害及有明确病因肝损害的OBI发生率分别为31.0％(9/29)和39.3％(11/28),差异无统计学意义.结论 在HBsAg阴性患者中,OBI更易发生在有肝功能损害的患者.当HBsAg阴性患者肝损害原因不明时,应及时采用高灵敏HBV DNA检测方法以排除HBV隐匿性感染.
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乙肝病毒相关的慢性肝病中病毒血清标志物状态分析
目的 调查分析乙肝病毒(HBV)相关的慢性肝病(CLD)[包括慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)]中HBV血清标志物不同状态的构成比及其临床意义.方法 对2006年1月-2007年12月于广州南方医院住院的2482例CLD患者的临床资料进行统计分析.结果 1226例CHB中,HBeAg阳性、HBeAg阴性的病例分别占64.4%、35.6%;362例LC和894例HOC中,HBeAg阳性、HBeAg阴性、HBsAg阴性的病例分别占27.1%、66.0%、6.9%和16.4%、75.1%、8.5%.对每一种CLD而言,血清标志物不同状态的男女构成比无显著差异;HCC的男女比值显著高于CHB和LC.CHB中,HBeAg阴性患者的平均年龄显著高于HBeAg阳性者;而LC、HCC中,不同血清标志物状态的患者平均年龄均无显著性差异.HBeAg阴性与HBeAg阳性的CHB病例中,丙氨酸转氨酶(ALT)各区段构成比无显著性差异;而在LC、HCC中,随着HBeag阳性、HBeAg阴性、HBsAg阴性方向的变迁,ALT低水平区段的构成比均逐渐增加.结论 HBV血清标志物状态在慢性肝病中存在着不同的构成比并具有相应的临床意义.
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抗HBs Fab-IFNα融合蛋白的制备与初步鉴定
目的 构建抗HBsAg的pComb Fab-IFNα载体,原核表达具双重生物活性的抗HBs Fab-IFNα融合蛋白.方法 以pBAD-Fab和pBAD IFNα作为模板,分别扩增Fd、λ和IENα基因,经相应的限制性内切酶酶切后分3次克隆人pComBHss质粒,转化XL-1 Blue大肠埃希菌.限制性酶切和测序鉴定重组质粒,免疫蛋向印迹(Western blotting)和斑点印迹(Dot blotting)鉴定融合蛋白的表达及抗原结合活性.结果 重组载体的酶切、电泳及测序表明抗HBs Fab-IFNα基因克隆正确.表达产物经12%SDS-PAGE电泳、转印,Western blotting显示该融合蛋白分子量约为65kD,Dot blotting显示其与HBsAg具有结合能力.细胞病变抑制法测定IFNα生物学活性为7.8×104～5.1×105U/ml.结论 该原核系统成功表达了抗HBs Fab-IFNα融合蛋白,表明其既具有抗HBsAg结合能力,又具备IFNα的生物活性,为进一步的系统表达和应用研究提供了条件.
关键词： 免疫球蛋白Fab碎片 干扰素α 肝炎表面抗原 乙型 肝炎病毒 -
人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达
目的 构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvapr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况.方法 通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3'端连人6×His标签.先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvapr+.将重组质粒Lipofectamine~(TM) 2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的 基因的表达.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致.RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的 条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达.结论 实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制.
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非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数
目的测定完全人源化基因工程抗体HBsAg Fab的亲和常数.方法采用非竞争性ELISA固相法,经确定佳抗原包板浓度、佳抗原包板时间及佳抗原与抗体结合反应时间后,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAg Fab及完整抗体抗HBsAg IgG的抗原抗体结合反应曲线,计算出抗HBsAg Fab及抗HBsAg IgG的亲和常数.结果人源基因工程抗体抗HBsAg Fab的功能性亲和常数在107～108M-1水平,比完整抗HBsAg IgG仅仅小约1个数量级(108～109M-1).结论该基因工程抗体与抗原结合能力较强,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础.
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隐匿性乙型肝炎病毒感染患者S基因突变特点分析
目的 分析1例血清HBV DNA长期阳性但HBsAg阴性的隐匿性乙型肝类病毒感染(OBI)患者HBV S基因突变特点,揭示S基因突变与OBI发生及肝脏疾病进展的关系.方法 收集该患者不同时间点的4份血清样本,扩增HBVS基因并进行克隆测序,挑选代表性突变株病毒基因构建重组载体并进行表型分析.结果 从该患者4份血清样本中检出多种S基因突变形式,包括前S1区大片段缺失、s126-127“RPCMNCTI”插入突变、sQ129N、s131-133 TSM→NST和经典的sG145R突变等,其中s131-133 TSM→NST在前后4份动态样本的检测病毒克隆中所占比例分别为0％、26％、59％和74％;前S1区大片段缺失在4份样本检测病毒克隆中始终存在,所占比例分别为26％、17％、15％和21％.表型分析发现,sQ129N和s131-133 TSM→NST可以降低抗体对HBsAg的亲和力,增加病毒分泌;与野生株相比,前S1区大片段(nt 3046-3177)缺失病毒株复制力下降了43.7％,表面抗原启动子Ⅱ(SPⅡ)活性下降了97.2％;sG145R可降低病毒的分泌能力.结论 此例HBV感染患者的长期OBI临床表现是由于其感染有多种S基因突变病毒株引起,其中一些S基因突变可以影响病毒的表型特点,可能与肝脏疾病进展密切相关.
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人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析
目的 筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析.方法 利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列.结果 从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A90值高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A190为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VH Ⅰ亚群,轻链可变区(VL)属于Vk Ⅰ和VkⅢ亚群.结论 从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsng噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础.
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1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测
目的 制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型.方法 采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠；采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法 检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况.结果 共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%.共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%.共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%.血清荧光定量PCR结果 显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102～103拷贝/ml；经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%.血清荧光定量PCR结果 显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102～103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果 均为阳性,且肾脏表达高于肝脏.结论1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代.
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热休克蛋白65增强小鼠对HBV DNA 疫苗免疫反应的研究
目的:观察热休克蛋白65的真核表达载体(pHSP65)对HBV DNA疫苗诱导BALB/c小鼠(H-2d)免疫应答的调节作用.方法:肌内注射空载体pcDNA3,HBV DNA疫苗加HSP65佐剂(pHBVS2S+pHSP65)或不加佐剂(pHBVS2S); ELISA法测定血清抗HBs抗体; ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;4 h 51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTLs活性.结果:HBV DNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度虽高于不加佐剂组,但无显著性差异;其IgG1/IgG2a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.395与10.佐剂组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞量是不加佐剂组的2～3倍.CTLs细胞杀伤活性(E∶ T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:(53.68±7.5)%、(42.81±7.7)%,差异显著(P<0.05).结论:HBV DNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTLs反应;HSP65佐剂能够有效提高小鼠对DNA疫苗的细胞免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂.
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抗HBsAg单克隆抗体杂交瘤的建立与临床应用
目的制备分泌抗HBsAg单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立快速诊断HBsAg的方法奠定了基础. 方法通过细胞融合建立了能稳定分泌抗HBsAg单抗的杂交瘤细胞株,利用ELISA技术测定单抗的特异性,并用此单抗对临床标本进行初步检测. 结果细胞株分泌的单抗可与HBsAg特异性结合,与乙肝病毒E抗原和核心抗原无交叉反应,经免疫扩散试验分析为IgG1型,将此单抗用辣根过氧化物酶标记后可与HBsAg阳性的病人血清反应. 结论筛选出了一株适合临床应用的单抗杂交瘤细胞株.
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飞行员注射乙肝疫苗后血清HBsAg、抗-HBs追踪观察
2002年我们对注射过乙型肝炎(简称乙肝)疫苗的408名飞行员进行了HBsAg、抗-HBs检测,报告如下:
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胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原的应用评估
目的 对胶体金免疫层析法(GICA)检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的特异性、灵敏度、重复性、试条渗透性、固相膜均匀性等技术参数进行试验比较和评价,为此技术应用提供可靠的依据.方法 采用GICA和酶联免疫吸附试验法(ELISA)对定值的HBsAg质控品和520份血清标本同时测定,再结合物理试验,并对结果进行评价.结果 GICA检测HBsAg的灵敏度为2ng/ml,ELISA为0.5ng/ml;GICA对HBsAg的检出率为ELISA的98%,两种方法间差异无显著性(P＞0.05);未发现前带反应和假阳性,重复性和稳定性好.结论 GICA简便、快速、可单份测定,虽灵敏度略低于ELISA,仍是一种较好的快速初筛方法.
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河南滑县农村地区成人乙型肝炎表面抗原检出率及相关因素分析
目的:描述河南省滑县农村地区乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigens,HBsAg)流行特征并探索其危险因素,为当地乙型肝炎防控工作提供科学依据.方法:依托安阳食管癌队列研究现场,采用整群抽样选取河南省滑县5个行政村25～ 65岁居民作为研究对象,分别进行问卷调查及血清学检测.采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析.结果:在接受调查的5 104名(参检率92.05％)居民中,HBsAg总体检出率为5.17％,男性高于女性(6.54％ vs.3.87％,P＜O.001),且男、女性均在25～29岁及55 ～ 59岁两个年龄组出现感染高峰.此外,非在婚状态(OR=1.80,95％ CI:1.00～3.25)及每周性交频率高(Ptrend=0.049)也是HBsAg阳性的危险因素.结论:河南省滑县农村地区成人乙型肝炎流行情况总体略低于同期全国平均水平,但25 ～ 29岁及55 ～ 59岁男性人群及性活跃人群为当地乙型肝炎感染的高危人群,应有针对性地对其开展预防接种及相关健康教育工作,从而进一步降低该人群中乙型肝炎总体流行水平.
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乙型肝炎病毒表面抗原-乳酸/乙醇酸共聚物缓释微球的制备、释放和免疫学研究
目的:研究重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)微球的制备工艺、聚合物降解、微球释放及小鼠皮下单剂量注射后的体内免疫应答水平.方法:采用正交设计,复乳法制备疫苗微球,测定PLGA及微球的理化性质和微球的体内免疫应答水平.结果:聚乙烯醇(PVA)浓度是影响微球粒径的的显著因素(P＜0.05);HBsAg释放主要靠微球中PLGA的溶蚀;将3种处方的微球混合单剂量免疫小鼠,抗体应答水平与现行的铝佐剂疫苗相当.结论:将不同释药行为的HBsAg-PLGA微球混合作为单剂量控释给药疫苗,具有很好的潜在优势.
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乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因的克隆及其在P815细胞中的表达
1 材料与方法1.1 质粒的构建pCP10质粒含有ayw亚型HBV全基因组.该质粒作为扩增S蛋白基因的模板,上、下游引物含BglⅡ的酶切位点.
