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细菌感染患者早期病原学分子诊断技术
目的 建立细菌感染患者早期病原及耐药性分子诊断技术,以便尽早实施有效的抗感染治疗方案,改善患者预后.方法 扩增细菌23S rRNA基因序列,同时扩增多种耐药基因,设计探针,通过基因芯片杂交技术识别其差异序列,鉴别细菌,检测耐药基因,用于病原早期诊断和耐药谱测定;收集血培养标本223份,脑脊液、胸水、腹水标本339份,尿液标本514份,比较所建立方法与传统方法的一致性,验证所建立技术的可靠性.结果 基因诊断方法可正确检出常见病原菌,并检测其是否携带mecA、SHV、CTX-M-1组和CTX-M-2组耐药基因.检测血、尿及脑脊液等无菌体液标本时,所建立的快速检测方法与常规方法的符合率分别为96.4%、99.8%和99.7%,总体符合率为99.1%,耐药性检测与传统药物敏感结果的符合率为95.7%,其准确性与常规方法相当,检测时间比常规方法平均减少(2.09±1.15)d.结论 多重PCR-基因芯片杂交技术可用于耐药菌感染的病原早期诊断和耐药感染的同步检测,应用于临床可望改善患者的预后.
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枸橼酸杆菌中质粒介导喹诺酮耐药基因的检测
目的 了解枸橼酸杆菌中质粒介导喹诺酮耐药(PMQR)基因的分布,以期发现新型PMQR基因.测定临床分离的PMQR基因阳性枸橼酸杆菌对临床常用抗菌药物的敏感性.方法 收集安徽医科大学第一附属医院检验科2009年临床分离的枸橼酸杆菌,PCR扩增qnr、aac(6′)-Ib-cr和qepA基因,产物纯化测序,测序结果在GenBank上比对并行转移接合实验.对收集的PMQR基因阳性枸橼酸杆菌及其接合子,采用琼脂对倍稀释法进行临床常用抗菌药物的药物敏感试验.结果 收集的枸橼酸杆菌共31株,8株菌株扩增出qnr,qnr基因阳性率为25.8％；其中6株扩增出qnrB.4株qnr阳性菌株的qnr基因转移接合成功.在qnr阳性的枸橼酸杆菌中,测序发现1种PMQR基因新亚型,命名为qnrB24.所有qnr阳性临床菌株对喹诺酮类药物的耐药率为87.5％,对头孢噻肟、阿米卡星、头孢他啶、头孢吡肟和庆大霉素的耐药率分别为75.0％、7.5％、62.5％、37.5％和87.5％,所有qnr阳性菌株对亚胺培南耐药表型为敏感.喹诺酮类药物对qnr阳性的接合子低抑菌浓度升高10～23倍,敏感性下降.结论 安徽地区枸橼酸杆菌中qnr基因型的检出率较高,以qnrB基因型为主,qnr阳性枸橼酸杆菌对常用抗菌药物耐药性较高.
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严重感染性休克患者血中分离的一株Klebsiella variicola菌株的鉴定
目的 对一株临床分离的Klebsiella variicola疑似菌株进行鉴定.方法 扩增该临床分离菌株的rpoB、gyrA、mdh、infB、phoE和nifH六个基因序列,并测序,构建进化树,分析该菌与Klebsiella variicola以及肺炎克雷伯菌序列的差异性.结果 该菌六个基因的进化树中待测菌株分别与Klebsiella variicola各参比株形成一簇,与肺炎克雷伯菌稳定区分.结论 在感染性休克患者血流中分离到1株Klebsiella variicola,其基因进化与健康人所携带的肺炎克雷伯菌显著不同.
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肺炎链球菌临床分离株PBP2b基因序列分析及其应用探索
目的 通过分析肺炎链球菌PBP2b基因转肽酶编码区的序列差异,建立可区分对青霉素敏感肺炎链球菌(PSSP)与青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSSP)的分子生物学方法.方法 检测青霉素对肺炎链球菌的低抑菌浓度(MIC),对菌株PBP2b转肽酶编码区进行PCR扩增和序列分析,根据序列差异设计相应引物和探针,并采用PCR-反向杂交方法区分PSSP与PNSSP.结果 43株肺炎链球菌(42株临床分离株及1株标准株)中8株为PSSP,30株为青霉素中介株(PISP),5株为青霉素耐药株(PRSP).经PBP2b基因限制性片段长度多态性分析(RFLP)及测序分析,PSSP与PNSSP(PISP+PRSP)存在谱型及序列差异.根据序列差异建立的检测方法可正确区分PSSP与PNSSP.结论 肺炎链球菌PSSP和PNSSP菌株的PBP2b基因转肽酶编码区之间存在可供鉴别的序列差异,据此可建立快速、特异的分子生物学方法,有望为该菌耐药基因的快速诊断提供客观依据.
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广西狂犬病野毒株N基因的测序与分析
目的 对广西狂犬病野毒株N基因进行测序和分析,了解其遗传特点和进化规律.方法 2003至2004年从广西各地采集595份动物脑材料,经RT-PCR法确定16份为阳性.对此16株狂犬病野毒株N基因全序列进行RT-PCR扩增、克隆和测序分析.结果 广西狂犬病病毒株属于Ⅰ型,可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群.GX01、GX08、GX09、GX014、GX091、GX195、GX260、GXLA、GXHX和GXSL株的同源性在97.6%～99.8%,为Ⅰ群,它们与其他毒株的同源性为89.0%～89.7%;GX219、GX074、GX304、GXBM和GXPX株的核苷酸同源性在98.4%～99.9%,为Ⅱ群,它们与其他各株的同源性为88.6%～89.7%;GXN119株为Ⅲ群,与泰国的8738THA株核苷酸同源性为95.3%.遗传进化分析表明,389位磷酸化位点、主要的4个抗原区及Th细胞表位区非常保守.N蛋白上的氨基酸变异主要集中在42、90、110、128、135、332、379和397位氨基酸上,这些氨基酸的变异与同源性分群结果一致.结论 根据基因同源性、遗传进化树及氨基酸变异分析,广西狂犬病野毒株分3群,呈地区性分布.
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胃癌组织人类表皮生长因子受体2基因扩增与蛋白表达的一致性
目的 检测胃癌组织中人类表皮生长因子受体2(HER2)基因扩增与蛋白表达结果的一致性.方法 收集2010年至2012年120例胃癌患者的胃癌组织标本,其中100份为手术标本,20份为胃镜活组织检查标本.应用免疫组织化学(IHC)方法检测120份标本的HER2蛋白表达情况.根据IHC检测结果,选取IHC切片中HER2阳性部位制作成组织芯片进行荧光原位杂交(FISH),检测HER2的基因扩增情况.对IHC检测灶性(+++)(≤10％的肿瘤细胞强染色)的标本进行不同着色强度部位对比FISH检测.统计学处理采用Kappa检验.结果 120份胃癌组织中,IHC检测显示77份为不同强度阳性染色,其中16份为(+++),6份为灶性(+++),37份为(++),18份为(+),IHC检测HER2蛋白表达阳性率为18.3％(22/120).FISH检测显示41份阳性,HER2基因扩增率为34.2％,其中21份IHC检测为(++),15份为(+++),5份为灶性(+++).IHC与FISH联合检测HER2阳性率为35.0％(42/120).IHC与FISH检测的符合率为91.6％(76/83).Kappa系数为0.960(P＜0.01).对5份FISH阳性且IHC检测为灶性(+++)标本的不同着色强度部位进行对比FISH检测,发现全部扩增.结论 组织芯片技术与IHC技术在胃癌组织中检出HER2具有一致性,并可提高HER2的检出率.
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胃癌中HER-2/neu基因扩增和蛋白表达的多中心研究
目的 观察中国人胃癌HER-2/neu基因扩增和蛋白表达状况,探讨两者间关系及与患者临床病理参数间的关系.方法 前瞻性研究中挑选胃腺癌蜡块270例,回顾性研究中挑选蜡块277例,分别用显色原位杂交(CISH)和免疫组化法(IHC)检测HER-2/neu基因扩增和蛋白表达状况.结果 胃癌前瞻性病例中HER-2/neu基因扩增率为14.8%,蛋白过表达率为11.9%.肠型胃癌HER-2/neu基因扩增率和蛋白过表达率分别为25.4%和18.8%,明显高于弥漫型胃癌的4.7%和5.5%(P值均＜0.01).高、中度分化胃癌HER-2/ned基因扩增率和蛋白过表达率均明显高于低分化胃癌(P值均＜0.01).回顾性、前瞻性研究及汇总后的总结果中HER-2/neu蛋白CISH和IHC检测结果符合率分别为77.0%、89.2%、83.2%,两者显著相关(P值均＜0.01).结论 HER-2/neu基因扩增、蛋白过表达可能与中国人胃癌发生有关,基因扩增可能是其蛋白过表达的主要分子机制,HER-2/ned基因扩增和蛋白过表达与肠型胃癌和高中度分化胃癌相关.
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mdm2和p53基因在贲门癌中的作用及临床病理意义
mdm2/p53负反馈调节机制异常与许多肿瘤的发生有关,然而该机制异常与贲门癌是否有关,目前国内外尚未见报道.虽然,近在中晚期胃癌已检测到mdm2基因的过表达..,但由于贲门癌在发生、组织病理学和致病危险因素方面与胃其他部位的肿瘤有显著差异,因而仍难就此推测该机制与贲门癌是否有关.本研究,用PCR-SSCP法和差别dPCR法,分别对38例贲门癌组织的p53基因突变和mdm2基因扩增进行检测,并分析了这两种基因异常之间及其与贲门癌各项因素之间的相关性,旨在探讨dm2和p53与贲门癌发生发展的关系,进一步阐明其发生机制,为其预后估计、基因诊断、基因治疗和预防提供理论依据.
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食管癌中表皮生长因子受体基因扩增的研究
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因定位于7 p12,长110kb,25个外显子[1].EGFR基因过度表达初表现在鳞状细胞癌细胞系A431中,以后在不同恶性肿瘤中发现EGFR具有高比例的过度表达,其重要原因之一是基因扩增[2,3].为探讨EGFR基因扩增与食管癌发生的相关性和意义,我们应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术,检测食管癌组织中EGFR基因扩增状态.
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鼻咽癌患者HER-2/neu基因扩增和表达及其临床意义
目的:研究鼻咽癌HER-2/neu基因扩增、表达及其临床意义.方法:采用原位荧光杂交、逆转录多聚链式反应和免疫组化技术检测鼻咽癌组织HER-2/neu基因扩增、表达.结果:HER-2/neu基因在鼻咽癌中无扩增,但有过表达,其原因是由于mRNA高表达所致; 这种过表达与鼻咽癌预后之间未显示有相关性. 结论: HER-2/neu基因在鼻咽癌无扩增, 有过表达, 这种过表达未显示预后意义.
关键词： 鼻咽癌 Her-2/neu基因 基因扩增 基因表达 -
核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其表达
目的:构建人核心蛋白聚糖(decorin,DCN)真核表达载体,并在人结直肠癌HCT-8细胞中进行表达,以研究其抗肿瘤作用.方法:以克隆有完整人DCN基因片段的质粒pBluescript为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因片段.真核表达载体pcDNA3及PCR产物经Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌JM109,获得重组载体pcDNA-DEC,进行酶切鉴定和测序鉴定.脂质体lipofectamine介导重组载体转染HCT-8细胞,经G418(800 μg/mL)筛选建立稳定转染细胞株.采用免疫组化法检测转染后HCT-8细胞中DCN的表达.MTT法检测HCT-8细胞的增殖活力.结果:PCR扩增获得与预期大小一致、约1000 bp的特异性DNA片段;重组载体pcDNA-DEC经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中.免疫组化结果显示在稳定转染的HCT-8细胞株中可见DCN蛋白表达.细胞生长曲线显示转染DCN的HCT-8细胞生长较对照组减慢.结论:成功构建DCN真核表达载体pcDNA-DEC,并获得稳定转染的HCT-8细胞株,为进一步研究DCN抗肿瘤作用奠定基础.
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S期激酶相关蛋白2在食管癌中的表达及其意义
目的:探讨S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-interacing protein 2,SKP2)在食管癌组织中的扩增、表达状态及其临床意义.方法:应用荧光原位杂交、RT-PCR、Western印迹和免疫组织化学方法检测SKP2在食管癌组织中的扩增和表达水平,结合临床病理资料进行统计学分析.结果:食管癌组织中SKP2的扩增频率为46.0%,SKP2扩增与肿瘤淋巴结转移和临床分期具有显著相关性(P<0.05).在SKP2扩增的食管癌组织中SKP2 mRNA和蛋白的表达水平均明显升高.免疫组织化学检测结果表明,食管癌组织中SKP2蛋白的过表达与肿瘤淋巴结转移和肿瘤分期有显著相关性(P<0.05),与预后无相关性(P>0.05).结论:SKP2可能具有癌基因的潜能,在食管癌的发生、发展和淋巴结转移中发挥一定作用.
关键词： 食管肿瘤 S期激酶相关蛋白质类 基因扩增 免疫组织化学 -
PCR基因扩增分析前的质量保证
医学检验的目的是为临床提供可靠的实验诊断依据,为了保证检验结果的准确性,必须对检测的全过程(分析前、分析中、分析后)进行质量控制.
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人胃癌相关蛋白VRG107基因的扩增及组织表达初步研究
以正常人肝脏cDNA文库为模板,采用PCR方法扩增出编码胃癌相关蛋白VRG107基因片段,应用半定量RT-PCR和Northern印迹分析研究它在人体组织中表达的分布.结果表明VRG107基因编码区为297 bp,与文献报道完全相同.该基因在肝、胃、结肠、肾、乳腺等多种组织(包括肿瘤组织)中均有不同程度的表达.在肝癌组织中表达量明显少于癌旁组织(P<0.01),而在结肠癌组织中表达也少于癌旁组织.提示VRG107基因是一个组织分布广泛的基因,在部分肿瘤组织中表达量明显减少.
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肾癌KI67基因扩增分析及其临床意义
目的 分析肾癌患者KI67基因扩增情况及其临床意义. 方法 收集47例肾癌患者的石蜡包埋组织样本,应用实时定量PCR法检测KI67基因扩增情况,收集患者的临床病理资料进行统计分析. 结果 KI67基因在47例样本中的扩增率为48.9％(23/47).KI67基因扩增患者中肿瘤浸润厚度＞4mm比例为72.7％(8/11),明显高于无扩增患者的27.3％(3/12),差异有统计学意义(Fisher精确概率法,P=0.039). 结论 肾癌患者KI67基因扩增率较高,且预示患者存在不良预后因素.
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广州市青少年学生乙型肝炎病毒感染状况及危险因素调查
目的了解推广使用乙型肝炎疫苗后,广州市青少年学生乙型肝炎病毒感染状况和感染危险因素. 方法选取广州市29所中学的初一和高一学生共14 744人作为调查对象,检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和抗体(抗-HBs),HBsAg与抗-HBs同时阳性者作乙型肝炎病毒S基因扩增和DNA序列分析.以统一的问卷对HBsAg阳性者进行流行病学调查. 结果检出HBsAg阳性者424人,阳性率为2.9%.抗-HBs阳性者12 201人,阳性率为82.8%.4人HBsAg、抗-HBs同时阳性,其中1人S基因"a"决定族第126位的异亮氨酸(ATT)变为苏氨酸(ACT),第143位由丝氨酸(TCG)变为苏氨酸(ACG),第145位由甘氨酸(GGA)变为精氨酸(AGA),另外3人未检出S基因"a"决定簇氨基酸变异.流行病学调查提示部分学生问卷可能通过母婴传播以及日常生活密切接触感乙型肝炎病毒. 结论乙型肝炎疫苗是预防乙型肝炎的有效制剂.病毒S基因"a"决定簇变异可使乙型肝炎疫苗保护失败,但目前的发生率较低,无须改变疫苗的制备及免疫策略.
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乳腺癌HER-2基因荧光原位杂交检测的临床应用
目的 研究荧光原位杂交(FISH)用于乳腺癌HER-2检测的临床应用及HER-2基因扩增与乳腺癌临床病理的相关性.方法 应用FISH技术和免疫组化(THC)技术检测40例乳腺浸润性导管癌石蜡包埋标本,对比分析.结果 IHC检测cerbB-2(3+)/(2+)/(1+或0),其FISH阳性率分别为85.7%、50%、5.9%.24例腋窝淋巴结阳性者,其FISH检测HER-2基因扩增10例(P=0.0399).ER/PR阴性8例,其HER-2基因扩增6例(P>0.05).结论 IHC检测HER-2蛋白有很高的假阳性及假阴性,FISH有效性及准确性显著高于IHC,可在临床广泛推广应用.HER-2基因扩增与腋窝淋巴结阳性相关.
关键词： 荧光原位杂交(FISH) 免疫组化(IHC) HER-2基因 乳腺癌 基因扩增 -
日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因的体外扩增克隆及序列分析
目的分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区(VH)基因并测定其序列.方法根据鼠免疫球蛋白重链可变区基因FR1和FR4序列的保守性,化学合成体外扩增Ig重链可变区基因的数对引物.以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板,扩增VH基因,将其克隆入pUC19载体,重组子用Sanger＇s双脱氧链终止法测定序列,将序列与Gene Bank中已发表的抗体序列比较.结果 VH基因全长357 bp,属鼠免疫球蛋白重链第Ⅱ亚类,由种系基因V、Dsp2.8与JH4重排而来.该VH基因序列已被Gene Bank收录(accession No AF282622).结论该VH基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因.
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聚合酶链反应检测梅毒螺旋体的应用进展
梅毒的诊断主要依据临床表现,血清学检测和梅毒螺旋体暗视野检查.随着人们对梅毒螺旋体基因组的认识,已经建立了多种基于梅毒螺旋体特异性基因序列的聚合酶链反应检测方法,常规聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、反转录聚合酶链反应、多重聚合酶链反应和实时荧光聚合酶链反应可以检测多种不同类型的临床标本,用于梅毒螺旋体的基因检测.聚合酶链反应扩增的靶基因有tpp47、polA、bmp、tmpA、arp、tpr等,其中tpp47、polA为常用的靶基因.皮损拭子、血液、脑脊液、病理组织、羊水等均可进行聚合酶链反应检测.
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颌骨肿瘤中骨形成蛋白-2基因扩增的RT-PCR研究
目的 探讨颌骨肿瘤中骨形成蛋白(BMP)-2基因的扩增与颌骨肿瘤的发生、发展及生物学行为之间的关系.方法 采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测9类87例新鲜颌骨肿瘤标本中BMP-2基因扩增结果.结果 含肿瘤性硬组织的全部42例颌骨肿瘤(骨肉瘤、软骨肉瘤、牙源性纤维瘤、骨化性纤维瘤、化牙骨质纤维瘤)和部分颌骨成釉细胞瘤(27/31)均显示人BMP-2特异性扩增条带,而不含肿瘤性硬组织的其他颌骨肿瘤(牙源性钙化上皮瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤)均未见特异性扩增条带.结论 颌骨肿瘤中BMP-2基因扩增存在差异,BMP-2基因扩增与肿瘤性硬组织的形成有关,与某些颌骨肿瘤的发生、发展及生物学行为之间存在一定关系.
