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钩藤总生物碱的含量测定研究
目的：建立测定钩藤总生物碱含量的方法。方法：用紫外分光光度法测定钩藤总生物碱提取物中的钩藤总生物碱含量。采用高效色谱法测定钩藤总生物碱提取物中的钩藤碱含量。结果：钩藤碱的进样量0.168～0.840μg，其峰面积与进样量具有良好的线性关系(r=0.9995)，平均回收率98.98%，RSD=1.31(n=5)。结论：该方法灵敏、准确，可用于钩藤总生物碱的含量测定。
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钩藤总生物碱增强自噬降低氧化应激诱导的内皮细胞炎性反应
目的:探讨钩藤总生物碱调控细胞自噬对氧化应激诱导的内皮细胞炎性反应的影响.方法:将HUVECs随机分为6组:正常对照组、oxLDL组、DMSO组、雷帕霉素(Rap)组、钩藤总生物碱组、钩藤总生物碱+3-MA组.以oxLDL诱导氧化应激并进一步诱导产生炎性反应.透射电镜和免疫荧光进行自噬形态学检测,Western blot检测LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1、p62以及核转录因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)表达,ELISA法检测培养上清中细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)含量,流式细胞技术评价细胞凋亡情况.结果:oxLDL明显上调NF-κB、TNF-α、CRP表达和ICAM-1、VCAM-1含量(P＜0.05).同时oxLDL组自噬小体增多,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值、Beclin-1的表达显著上调,p62表达下调(P＜0.05).与oxLDL组比较,钩藤总生物碱明显促进了自噬小体的产生,显著上调LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值、Beclin-1的表达,下调p62表达(P＜0.05).同时减少NF-κB、TNF-α、CRP的表达及ICAM-1、VCAM-1含量(P＜0.05),减轻了细胞凋亡,3-MA在一定程度上抑制了其作用效果.结论:钩藤总生物碱能够通过增强细胞自噬而降低氧化应激诱导的内皮细胞炎性反应,减轻细胞凋亡.
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钩藤生物碱对自发性高血压大鼠胸主动脉成纤维细胞凋亡／增殖及FN、LN的影响
目的 研究钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)胸主动脉血管外膜成纤维细胞(vascular adventitial fibroblasts,VAF)凋亡、增殖及Bcl-2、Bax、c-Fos、c-Myc、层黏连蛋白(laminin,LN)、纤维层黏连蛋白(fibronectin,FN)的影响.方法 选择8周龄雄性SHR 40只,随机分为模型组、卡托普利组( 17.5 mg/kg)、异钩藤碱组(5.0 mg/kg)、钩藤碱组(5.0 mg/kg)和钩藤总生物碱组(50.0 mg/kg),每组8只.另选取8周龄雄性Wistar大鼠8只作为正常组.模型组和正常组灌胃给予等容量生理盐水.各组给药容积为每次10 mL/kg,每周给药6天,连续8周,随体重变化调整给药量.采用Annexin VFITC结合PI染色、流式细胞术分析胸主动脉VAF凋亡率；免疫组化法检测胸主动脉VAF Bcl-2、Bax、c-Myc、c-Fos、FN及LN蛋白表达；原位杂交法检测胸主动脉VAF转化生长因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)mRNA表达.结果 与模型组比较,各用药组干预4、8周大鼠尾动脉收缩压均降低,胸主动脉VAF凋亡率、Bax蛋白均升高,Bcl-2、c-Fos、FN、LN蛋白及TGF-β1 mRNA均降低,钩藤碱组、异钩藤碱组及钩藤总生物碱组c-Myc蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(P ＜0.05,P＜0.01).与卡托普利组比较,钩藤碱组、异钩藤碱组及钩藤总生物碱组大鼠尾动脉收缩压、c-Fos蛋白表达及TGF-β1mRNA差异无统计学意义(P＞0.05)；胸主动脉VAF凋亡率升高,Bcl-2、c-Myc及LN蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(P ＜0.05,P＜0.01)；钩藤碱组、异钩藤碱组Bax蛋白表达均升高,差异均有统计学意义(P ＜0.05,P＜0.01)；异钩藤碱组FN蛋白表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05).钩藤碱组、异钩藤碱组及钩藤总生物碱组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱可能通过调节原癌基因Bcl-2和Bax蛋白表达,促进SHR胸主动脉VAF凋亡,通过下调c-Fos、c-Myc蛋白和TGF-β1 mRNA表达途径抑制SHR胸主动脉VAF增殖,并通过下调FN和LN蛋白表达而减轻细胞外基质的沉积,从而改善胸主动脉外膜重塑,降低尾动脉收缩压.
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钩藤总生物碱缓释滴丸制备工艺考察
目的：考察钩藤总生物碱缓释滴丸的制备工艺。方法正交试验法优选钩藤总生物碱缓释滴丸成型的佳工艺条件。结果以药物与基质的比例为1：2，硬脂酸与PEG6000的比例为1：4，料温为70℃，滴速为45滴/min为佳工艺条件。结论优选的滴丸制备方法简便，工艺可行。
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钩藤和莱菔子生物碱抗高血压血管内皮细胞损伤效应
目的 探讨钩藤总生物碱配伍莱菔子水溶性生物碱抗高血压大鼠血管内皮细胞损伤的效应及初步机制研究.方法 采用腹腔注射N-硝基左旋精氨酸(L-NNA)方法制备大鼠高血压模型；采用无创性套尾法测定大鼠清醒状态下尾动脉收缩压；采用酶联免疫吸附法测定大鼠血浆血管性血友病因子(vWF)、内皮素-1(ET-1)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)和P选择素(P-S).结果 钩藤总生物碱配伍莱菔子水溶性生物碱对LNNA诱导的高血压大鼠有显著降压效用(P＜0.05),并能降低高血压大鼠血浆vWF、ET-1、ICAM-1、VCAM-1和P-S水平(P＜0.05).结论 钩藤总生物碱配伍莱菔子水溶性生物碱具有良好降压和血管内皮保护效应,其机制与抑制血管内皮细胞分泌黏附因子、减轻血管壁炎症反应有关.
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钩藤总生物碱对腹腔粘连大鼠内皮功能、炎性介质和粘连组织相关因子表达的影响
目的 观察钩藤总生物碱对大鼠腹腔粘连形成、炎性介质和腹腔粘连组织羟脯氨酸(OHP)、可溶性细胞间黏附分子-1 (sICAM-1)及转化生长因子-β1 (TGF-β1)表达的影响.方法 按随机数字表法将60只清洁级Wistar大鼠分为6组:假手术组、模型组、钩藤总生物碱低、中、高剂量组及对照组.假手术组仅开腹,其余组大鼠开腹并建立腹腔粘连模型.造模后,钩藤总生物碱各剂量组腹腔注射钩藤总生物碱(低剂量:25 mg/kg,中剂量:50 mg/kg,高剂量:100 mg/kg),对照组给予腹腔注射10 mg/kg地塞米松磷酸钠注射液,假手术组与模型组给予腹腔注射同体积的生理盐水,均为一日1次.各组均持续治疗4周.观察大鼠腹腔粘连程度,并对比纤维蛋白原(FIB)、纤维蛋白降解产物(FDP)、OHP、sICAM-1、TGF-β1及其他相关指标的变化.结果 ①腹腔粘连率和粘连程度分级:与假手术组对比,模型组的腹腔粘连等级评分升高(P＜0.01);与模型组对比,钩藤总生物碱各剂量组的腹腔粘连等级评分均降低(P＜ 0.05或P＜ 0.01);②血象:与假手术组对比,模型组的白细胞计数(WBC)、FIB、OHP均明显升高,FDP降低(P＜0.01);与模型组对比,钩藤总生物碱各剂量组的WBC、FIB、OHP均有所降低,FDP升高(P＜0.05或P＜0.01);③腹腔粘连组织sICAM-1、TGF-β1:与假手术组对比,模型组的sICAM-1、TGF-β1均明显升高(P＜0.01);与模型组对比,钩藤总生物碱各剂量组的sICAM-1、TGF-β1均有所降低(P＜0.05或P＜0.01);④炎性介质:与假手术组对比,模型组的血清超氧化物歧化酶(SOD)降低,丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、白介素(IL)-1β、基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、基质金属蛋白-9(MMP-9)均明显升高(P＜0.01):与模型组对比,钩藤总生物碱各剂量组的血清SOD升高,MDA、TNF-α、NO、IL-1β、TIMP-1、MMP-9均有所降低(P＜0.05或P＜ 0.01);⑤内皮功能:与假手术组对比,模型组的血清血管内皮生长因子(VEGF)、CD34均明显升高(P＜0.01);与模型组对比,钩藤总生物碱各剂量组的血清VEGF、CD34均有所降低(P＜ 0.05或P＜0.01).结论 钩藤总生物碱能够改善腹腔粘连大鼠的腹腔粘连程度,可能与调控FIB、sICAM-1、TGF-β1的水平,改善内皮功能及抑制炎性反应密切相关.
关键词： 腹腔粘连 钩藤总生物碱 转化生长因子-β1 可溶性细胞间黏附分子-1 -
钩藤总生物碱干预大鼠血管内皮细胞衰老研究
目的 探讨钩藤总生物碱对血管紧张素Ⅱ、D-半乳糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞增殖、衰老的抑制效应及相关机制.方法 分别建立血管紧张素Ⅱ、D-半乳糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞增殖、衰老模型,分别通过MTT法、流式细胞术观察钩藤总生物碱对其增殖、细胞周期的影响.结果 钩藤总生物碱呈浓度依赖性抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠主动脉内皮细胞增殖;在钩藤总生物碱作用下,D-半乳糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞处于G0/G1期细胞数减少,S期细胞数增多.结论 钩藤总生物碱可剂量依赖性地抑制AngⅡ的促内皮细胞增殖效应,对D-半乳糖介导的内皮细胞衰老具有明显的抑制作用.
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钩藤中钩藤总生物碱的含量测定
目的:建立一种钩藤中钩藤总生物碱的含量测定方法.方法:采用紫外分光光度法的对照品比较法,测定波长为246nm.结果:钩藤碱在0.003152～0.025216mg/ml范围内线性关系良好(r=0.9997),平均回收率为97.9％,RSD为1.68％.结论:该方法灵敏度高、结果准确、简便、重复性好,可用于钩藤药材的质量控制.
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钩藤生物碱对自发性高血压大鼠胸主动脉平滑肌细胞凋亡和增殖的影响
目的 研究钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱对SHR胸主动脉平滑肌细胞凋亡和增殖的影响.方法 分别给予SHR钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱,并以Wistar大鼠作为正常对照.用流式细胞仪检测胸主动脉平滑肌细胞凋亡,用免疫组化法检测胸主动脉Bcl-2、Bax、c-myc、c-fos蛋白表达,采用原位杂交法检测胸主动脉平滑肌细胞PDGF mRNA及凋亡平滑肌细胞mRNA的表达.结果 钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱均能促进SHR胸主动脉平滑肌细胞凋亡,增强Bax蛋白及凋亡平滑肌细胞mRNA表达,抑制c-fos蛋白、c-myc蛋白和PDGF-B mRNA表达；其中异钩藤碱能抑制胸主动脉Bcl-2表达.结论 钩藤碱、异钩藤碱和钩藤总生物碱可能通过调节原癌基因Bcl-2和Bax蛋白表达,促进自发性高血压大鼠动脉平滑肌细胞凋亡,并能通过抑制c-fos蛋白、c-myc蛋白和PDGF-B mRNA表达途径抑制自发性高血压大鼠胸主动脉细胞增殖,从而改善胸主动脉壁重塑.
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钩藤总生物碱有效部位质量控制研究
目的:建立钩藤总生物碱有效部位质量控制方法.方法:采用酸性染料染色法测定钩藤总生物碱的含量,采用高效液相色谱法测定有效部位中钩藤碱的含量,采用高效液相色谱法建立钩藤总生物碱有效部位的指纹图谱.结果:钩藤总生物碱的含量均在50％以上,钩藤碱在5.75～ 92 μg/mL之间线性关系良好,平均回收率为98.82％,通过指纹图谱相似度评价,不同批次的钩藤总生物碱有效部位的化学成分存在差异.结论:本研究建立的质量控制方法可有效控制钩藤总生物碱有效部位的质量.
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钩藤总生物碱和芥子碱硫氰酸盐组分配伍对血管内皮细胞的变化作用和机制
目的 研究中药组分钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐及其配伍对肿瘤坏死因子α(TNF-α)导致的血管内皮细胞的变化作用和机制.方法 体外培养大鼠血管内皮细胞,以TNF-α建立血管内皮细胞炎症模型.采用扫描电镜技术观察细胞形态的变化,采用ELISA测定细胞分泌内皮素1(ET-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1),RT-PCR测定ICAM-1、VCAM-1和ET-1的mRNA表达,硝酸还原酶法测定细胞分泌血管内皮舒张因子一氧化氮(NO)水平.结果 TNF-α(5μg/L)可在体外诱导血管内皮炎症模型.钩藤总生物碱与芥子碱硫氰酸盐配伍可改善细胞形态结构,降低ET-1、ICAM-1和VCAM-1分泌,与钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐差异无显著性(P＞0.05)；提高细胞NO分泌,优于钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐(P＜0.05)；下调细胞ICAM-1 mRNA表达,优于钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐(P＜0.05)；下调细胞VCAM-1和ET-1 mRNA表达,优于芥子碱硫氰酸盐(P＜0.05).结论 钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐及其配伍具有保护TNF-α致血管内皮细胞炎症的作用.
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钩藤总生物碱对HepG2细胞增殖和凋亡的影响及机制研究
目的:研究钩藤总生物碱(TAU)对体外培养HepG2细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法:MTT法检测不同浓度TAU对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术检测不同浓度TAU对HepG2细胞周期和凋亡的影响;Western Blot法分析其可能的分子机制.结果:TAU对HepG2细胞有显著的增殖抑制及促凋亡率作用,其作用呈浓度依赖性;中、高浓度TAU处理后HepG2细胞发生周期阻滞,Go/G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高;Bcl-2、Casepase-3、Casepase-7、Casepase-9及PARP蛋白表达量显著下调,Bax、cleaved-Casepase-3、cleaved-Casepase-7、cleaved-Casepase-9及cleaved-PARP蛋白表达量显著上调.结论:钩藤总生物碱对HepG2细胞有明显的增殖抑制作用,并能诱导HepG2细胞凋亡,细胞周期阻滞可能是其作用机制之一,线粒体调节通路可能是其调节细胞凋亡的重要途径.
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Cocktail探针药物法评价钩藤总生物碱对大鼠CYP450亚型的影响
目的 建立同时测定细胞色素P450(CYP450)亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4活性的Cocktail探针药物溶液的高效液相色谱(HPLC)检测方法,并利用该方法研究口服钩藤总生物碱(TAU)对上述4种亚酶活性的影响.方法 以咖啡因、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和氨苯砜分别作为CYP1 A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的探针底物,以卡马西平作为内标物质,建立了乙腈-0.5％甲酸的梯度洗脱法同时测定4种探针药物的血药浓度,并对该方法进行方法学考察.雄性SD大鼠随机分为3组,分别给予空白溶剂(0.5％羧甲基纤维素)以及40、80 mg/kg的TAU,连续灌胃给药10 d,在第11天给予Cocktail探针药液后于不同的时间点采集大鼠血样.利用HPLC测定大鼠血浆中该4种探针药物浓度,血药浓度-时间数据采用DAS2.0软件进行药动学分析.结果 与空白对照组比较,80 mg/kg的TAU给药组灌胃10 d后,咖啡因的AUC0-t、AUC0-∞、MRT0-t、MRT0-∞和t1/2z均显著减小,CLz/F均显著增大;甲苯磺丁脲的AUC0-t和AUC0-∞均显著减小,CLz/F显著增大;氯唑沙宗的AUC0t、AUC0-∞、MRT0-tMRT0-∞和t1/2z减小,CLz/F增大,但差异无统计学意义;氨苯砜的药代学参数基本无变化.40 mg/kg的TAU给药组与空白组比较,该4种探针底物的药动学参数基本无变化.结论 本方法准确,灵敏度较高,适用于同时评价药物对CYP1A2、CYP2C9/11、CYP2E1和CYP3A4该4种亚酶的影响.80 mg/kg的TAU给药组给药10 d后对大鼠肝药酶CYP1 A2、CYP2C9和CYP2E1均存在不同程度的诱导作用,对CYP3A4的活性基本无影响,而40 mg/kg的TAU给药组对以上4种亚酶基本无影响.提示TAU在临床使用过程中,尤其是与其他药物联用时,应注意调整用药剂量,防止药物相互作用可能造成的不良反应;本文为临床合理配伍使用该药提供参考.
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贵州中药材钩藤主要有效成分总生物碱含量的测定
目的:生物碱类成分是中药钩藤中的主要药效成分[1],其含量的高低直接影响钩藤的质量,通过总生物碱的含量测定,可鉴别钩藤药材的质量.方法:在pH=3.4的醋酸-醋酸钠缓冲液条件下,用溴甲酚氯酸性染料显色后于410nm处采用分光光度计测定[2].结果:酸性染料与生物碱形成的络合物较为稳定,钩藤碱在0.68～5.69μg·ml-1范围内线性关系良好,平均回收率为100.07％,RSD为2.02％(n=6);结论:该方法简便可靠,可作为钩藤中总生物碱含量的测定方法.
