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非瑟素抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化
目的 研究非瑟素对过氧化氢(H2O2)诱导的SH-SY5Y细胞损伤及tau蛋白异常磷酸化的影响,并初步探讨其可能的作用机制.方法 CCK-8法测定SH-SY5Y细胞存活率;Western blot检测tau蛋白磷酸化水平、p-mTOR及其下游p-p70 S6K、p-4E-BP1蛋白表达变化.结果 非瑟素可提高H2O2损伤的SH-SY5Y细胞的活力,同时抑制了H2O2诱导的tau蛋白过度磷酸化,并能下调p-mTOR、p-p70 S6K、p-4E-BP1蛋白的表达.结论 非瑟素对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤具有保护作用,同时可抑制tau蛋白异常过度磷酸化,其作用机制可能是通过下调mTOR信号通路实现的.
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真核翻译起始因子4E结合蛋白1
真核翻译起始因子4 E结合蛋白1 ( eIF4 E-bind-ing protein 1 ,4 E-BP1 )是一种高度保守的小分子蛋白,在蛋白翻译起始途径选择中发挥重要的功能.4 E-BP1通过与脚手架蛋白eIF4 G竞争性结合转录起始因子eIF4E,抑制 eIF4E 的功能及帽依赖性蛋白质翻译起始. 4 E-BP1 受 PI3 K/AKT/mTOR、MEK/ERK/MAPK等多种信号通路的调节,4E-BP1发生磷酸化修饰后与eIF4 E解离. 除负调控蛋白翻译起始功能外, 4 E-BP1 还通过调节 cyclinD1 的翻译、与PLK1相互作用等,从而影响细胞周期进程.mTOR/4 E-BP1通路还参与调节线粒体依赖性凋亡通路. 临床研究还发现, 4 E-BP1 与肿瘤细胞侵袭力、肿瘤对化疗耐药性和肿瘤预后有关.
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抑制mTOR信号通路对幼鼠肺损伤时p-AKT1分子的影响及意义
目的:探讨抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在高体积分数氧(高氧)致SD幼鼠肺损伤时对磷酸化AKT1(p-AKT1)分子的影响和意义.方法:72只SD幼鼠(3周龄)随机分为空气+生理盐水组、高氧+生理盐水组、高氧+OSI-027组及高氧+雷帕霉素组(n=18),分别构建动物模型.高氧选择90％氧气持续干预,生理盐水、OSI-027和雷帕霉素干预分别在观察期第1、3、6、8、10和13天时经腹腔注射给药.在造模第3、7和14天时取各组幼鼠进行体重测量、肺湿干重比(wet/drg weight ratio,W/D)计算、肺组织病理学检查、肺泡间隔宽度测定和肺损伤评分,肺组织免疫组化和Western blot检测磷酸化S6K1(p-S6K1)和p-AKT1的分布与水平.结果:与空气组比较,高氧组幼鼠体重明显下降(P<0.05),肺损伤急性期肺W/D增高(P<0.05),肺泡间隔宽度及肺损伤评分明显增加(P<0.05),肺组织p-S6K1阳性细胞增多(P<0.05),肺组织p-AKT1阳性细胞减少(P<0.05),p-S6K1蛋白显著升高(P<0.01),p-AKT1蛋白明显减低(P<0.01);与高氧组比较,高氧+OSI-027组的肺组织损伤减轻,肺组织p-S6K1阳性细胞减少(P<0.05),p-AKT1阳性细胞增多(P<0.05),p-S6K1蛋白水平显著降低(P<0.05),p-AKT1蛋白水平增加(P<0.05);高氧+雷帕霉素组的肺损伤进一步加重(P<0.05),p-S6K1阳性细胞减少(P<0.05),p-AKT1阳性细胞增加(P<0.05),p-S6K1蛋白水平显著降低(P<0.05),p-AKT1蛋白水平显著增加(P<0.05).与高氧+雷帕霉素组比较,高氧+OSI-027组的肺组织损伤减轻(P<0.05),肺组织p-AKT1阳性细胞减少(P<0.05),p-AKT1蛋白水平降低(P<0.05).结论:p-AKT1参与了高氧肺损伤的发生发展,其调控机制可能与抑制mTOR信号通路的活化有关.高氧肺损伤时,p-AKT1蛋白水平下降,mTOR抑制剂能增加p-AKT1蛋白水平,但只有mTORC1/2双重抑制剂OSI-027能减轻高氧所致SD幼鼠的肺损伤及纤维化.
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穿心莲内酯对人肝癌细胞MHCC97H增殖的影响及其机制研究
[目的]观察穿心莲内酯(Andro)对人肝癌细胞MHCC97H增殖的影响及作用机制,探讨其体外抗肝癌作用.[方法]采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Andro不同浓度(5、10、20、30、40、50 μmol/L)及不同处理时间(24、48、72 h)对MHCC97H细胞增殖的影响;采用Annexin V-碘化丙啶(PI)双染法、Hoechst 33342染色法观察细胞凋亡;采用流式细胞术检测细胞周期分布;采用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测凋亡相关蛋白如Bax、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、裂解型胱天蛋白酶3 (cleaved-caspase-3)、剪切型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-PAPR),周期相关蛋白如周期素B1 (cyclin B1)、周期素依赖性激酶1(CDK1)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白如mTOR、p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)的表达.[结果]穿心莲内酯5、10、20、30、40、50 μmol/I组24、48、72 h MHCC97H细胞增殖率下降,且随着Andro浓度、处理时间的增加而逐渐降低.Andro 25、50 μmol/L组12、24、48 h MHCC97H细胞凋亡率均升高,呈浓度和时间依赖性.Andro 50μmol/L组48 h MHCC97H细胞发生G2/M期阻滞.与溶剂对照组比较,Andro 50 μmol/L组中促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达升高(P＜0.05或P＜0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P＜0.01),周期蛋白cyclinB1和CDK1表达及mTOR信号通路蛋白mTOR、p70S6K的磷酸化水平均下降(P＜ 0.05或P＜0.01或P＜0.001).[结论]Andro可能通过调控MHCC97H细胞凋亡相关蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bcl-2及周期相关蛋白cyclinB1、CDK1的表达及抑制mTOR-p70S6K信号通路的激活,促进细胞凋亡及细胞周期阻滞,从而发挥体外抗肝癌作用.
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雷帕霉素靶蛋白及其下游因子在大鼠脊髓背角和背根神经节的表达与分布
目的 观察雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其下游因子真核细胞起始因子4E结合蛋白l(4E-BPl)、p70核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)及其磷酸化形式在脊髓背角和背根神经节(DRG)的表达和分布.方法 以逆转录-聚合酶链反应、Western blot确定mTOR、4E-BP1和p70S6K及其磷酸化形式在DRG和背角的表达.免疫组化染色确定mTOR、4E-BP1和p70S6K及其磷酸化形式在DRG和背角的定位,并定量分析.结果 mTOR、4E-BP1和p70S6K分布在整个脊髓背角和DRG,特别是在脊髓背角的外层,而磷酸化形式在脊髓背角和DRG表达都非常低,没有检测到.在脊髓背角,mTOR、p70S6K和4E-BPI表达于神经元细胞,在星形胶质细胞和小胶质细胞没有表达.在DRG,mTOR和p70S6K表达于神经元细胞,(26.1±3.2)％呈mTOR表达阳性,(19.1±1.9)％呈p70S6K表达阳性;4E-BP1则表达于卫星胶质细胞.结论 mTOR、p70S6K和4E-BP1在脊髓背角和DRG表达丰富,而它们的磷酸化活化形式表达非常低.
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盐霉素及mTOR信号通路对前列腺癌DU145干细胞的影响
目的 探讨盐霉素对前列腺癌DU145干细胞的影响及其可能的机制,为盐霉素的临床应用提供理论依据.方法 盐霉素处理DU145细胞,以ALDH为肿瘤干细胞标记物,用流式细胞仪检测处理后ALDH阳性的DU145干细胞的百分比.盐霉素处理DU145细胞后,用Western Blot法检测mTOR信号通路相关蛋白m-TOR、p-70s6k、p-p70s6、p-s6等的表达变化.盐霉素结合mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素处理DU145细胞,利用流式细仪检测ALDH阳性的DU145干细胞百分比.结果 盐霉素显著性抑制ALDH阳性的DU145干细胞(抑制率为77.78%),是紫杉醇的2倍(抑制率为38.64%).盐霉素抑制mTOR信号通路相关分子m-TOR、p-70s6k、p-p70s6、p-s6等蛋白的表达,具有时间依赖性和剂量依赖性.盐霉素结合雷帕霉素能够抑制ALDH阳性的DU145干细胞比例(抑制率为77.95%).结论 盐霉素可能通过抑制mTOR通路信号来发挥抑制肿瘤干细胞的作用.
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mTOR信号通路在17-DMAG克服EML4-ALK阳性肺癌细胞株H3122对alectinib耐药中的作用机制研究
目的 观察mTOR信号通路在17-DMAG克服旁路信号通路激活诱导棘皮动物微管相关蛋白样4与间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因阳性肺癌细胞株H3122(以下简称“H3122细胞”)对alectinib耐药中的变化,并探讨其内在的调控机制.方法 加入100 ng/mL转化生长因子α(transforming growth factor-α,TGF-α)和100 ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导H3122细胞对alectinib耐药,观察加入17-DMAG后上述耐药能否被克服.采用CCK-8法检测不同处理方式下H3122细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测不同处理方式下细胞中ALK、EGFR及其磷酸化蛋白的表达,观察其下游mTOR信号通路关键蛋白及活化水平的表达情况.结果 alectinib作用72 h后H3122细胞增殖率随药物浓度升高而下降,IC50为0.042 μmol/L;联合TGF-α或EGF后H3122细胞对alectinib耐药,IC50远大于10μmol/L;单药17-DMAG处理后H3122细胞增殖率随药物浓度升高而下降,IC50为0.245 μmol/L;联合TGF-α或EGF后H3122细胞增殖率亦被17-DMAG抑制,且呈剂量依赖性,IC50分别为0.251 μmol/L和0.301 μmol/L.经0.05 μmol/L alectinib作用72 h后H3122细胞凋亡率为(30.01±0.92)％,alectinib联合TGF-α或EGF后细胞凋亡率分别为(6.36±0.14)％和(6.13±0.21)％,显著低于alectinib单药处理(P＜0.001);经0.3 μmol/L 17-DMAG单药或联合TGF-α、EGF作用72 h后H3122细胞凋亡率分别为(28.37±1.75)％、(26.69±1.2)％和(26.62±0.72)％,差异无统计学意义(P＞0.05).alectinib可抑制H3122细胞中p-ALK、p-mTOR的表达,也可抑制mTOR上、下游关键蛋白的活化状态;EGF可明显增加细胞中p-EGFR、p-mTOR及mTOR上、下游关键蛋白的活化水平表达;alectinib可抑制p-ALK表达,但联合EGF后不能抑制mTOR及mTOR上、下游关键蛋白活化水平的表达;即使联合EGF后,17-DMAG亦能抑制H3122细胞中ALK、EGFR、mTOR信号通路蛋白及其活化状态蛋白的表达.结论 旁路信号通路激活介导EML4-ALK融合基因阳性肺癌细胞株H3122对alectinib耐药的方式具有可行性,mTOR信号通路在17-DMAG克服旁路信号通路激活引起alectinib的获得性耐药过程中有一定作用.
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mTOR抑制剂雷帕霉素的抗肿瘤作用
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是参与生命活动的多条信号通路的下游因子,其中就包括PI3K/Akt/mTOR信号通路,在细胞生长、分化、转移和存活中地位显著,已成为癌症治疗的一个重要靶标.第一代mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)初作为一种新型的免疫抑制药物在器官移植领域应用广泛.随着对该药物及mTOR信号通路的深入研究,人们慢慢地认识到RAPA除免疫抑制外还具有诱导肿瘤细胞凋亡、阻断细胞周期、抑制信号传导、影响基因转录水平及其对表观遗传学的调控作用.本文主要综述了近年来雷帕霉素在抗肿瘤方面的研究进展,同时讨论了雷帕霉素抗肿瘤的局限性.
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雷帕霉素靶蛋白信号通路及其抑制剂在肝细胞癌中的研究进展
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)家族下游的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.该激酶在肝细胞癌发生和发展中起着重要作用.临床前数据表明mTOR信号通路效应物的失调表达存在于40％～ 50％的肝细胞癌中,并且mTOR通路的激活与较低分化的肿瘤、较早的肿瘤复发和较差的生存预后相关.现对mTOR信号通路及其抑制剂在肝细胞癌中的研究进展进行综述.
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槲皮素活化mTOR信号通路对L929成纤维细胞增殖的影响
目的:探讨槲皮素(Quercetin,QU)对L929成纤维细胞增殖的影响及其分子机制.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测QU对L929细胞增殖的影响,荧光素酶报告基因法检测QU对蛋白质翻译调控的影响、Western blot法检测QU 对 mTOR介导的蛋白质翻译调控通路关键基因mTOR、P-4E-BP1(翻泽起始因子4E的结合蛋白)的磷酸化,细胞周期调控蛋白cyclin D1的表达及mTOR通路阻断实验.结果:MTF法检测结果显示在36 h干预点,浓度为1×10-4、1.5×10-4、2×1O-4、2.5×10-4 mol/L时,QU可明显促进L929细胞增殖(P＜0.01);荧光素酶报告基因检测系统结果显示:在36 h干预点,2.5x10-4 mol/L QU与对照组相比,RLU(相对光单位)值明显增加(P＜O.001);Western blot法检测结果显示,mTOR、cyclin、D1和P-4E-BP1的表达明显增加.100 ng/ml的雷帕霉素作用36 h后,与对照组相比,QU组P-4E-BP1、nTOR、cyclin D1蛋白表达明显增加,雷帕霉素组明显减少,雷帕霉素+QU组蛋白表达明显增加,但较QU组有所减少.结论:QU可通过诱导mTOR信号通路活化,进而促进细胞周期调控蛋白cyclin D1的表达,诱导L929细胞的增殖.
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三七总皂苷抑制K562细胞mTOR信号通路活性的实验研究
目的 探讨三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对体外培养K562细胞mTOR信号通路相关分子表达及活性的影响.方法 不同浓度的PNS(50～800 μ,g/mL)干预体外培养K562细胞24 ～ 72 h后,MTT比色法检测PNS对K562细胞增殖的抑制作用;AO/EB双荧光染色法观察细胞死亡及凋亡状况;RT-PCR检测mTOR、p70S6K、4E-BP1 mRNA表达变化;Western blot检测mTOR、p70S6K、4E-BP1及p-mTOR、p-p70S6K、p-4E-BP1蛋白表达量的变化.结果 与对照组相比,浓度为100～ 800 μg/mL的PNS能够抑制K562细胞增殖(P＜0.05),促进K562细胞凋亡及死亡(P＜0.05),PNS对K562细胞72 h的IC50为(229.07±2.36) μg/mL;100、200、400 μg/mL PNS作用于K562细胞72 h后mTOR蛋白表达量及mRNA表达量降低(P＜0.05),且磷酸化蛋白p-mTOR (Ser2448)、p-p70S6K (Thr229/389)及p-4E-BP1(Thr37/46)表达水平也随着药物浓度的增加而降低(P＜0.05).结论 PNS能够抑制K562细胞mTOR信号通路的活性,这可能是PNS抑制K562细胞增殖的机制之一.
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mTOR信号通路介导黄芩苷抑制人结肠癌细胞的增殖
目的 探讨黄芩苷抑制人结肠癌细胞(HCT116)增殖的分子机制.方法 采用MTT比色法检测不同浓度的黄芩苷(0.01～ 100 μg/ml)对体外培养的HCT116细胞增殖的抑制作用；采用Western blot分析检测被黄芩苷干预的HCT 116细胞的增殖相关蛋白的表达.结果 与对照组比较,浓度为1～ 100 μg/ml的黄芩苷处理组明显抑制HCT 116细胞的增殖(P＜0.05).用100μg/ml黄芩苷处理后,增殖相关的蛋白mTOR、p70S6K、S6、eIF4E表达明显下调(P＜0.05),4E-BP1表达明显上调.p-mTOR(Ser2448)、p-S6(Ser235/236)、p-4E-BP1(Thr37/46)的磷酸化水平下降(P＜0.05).结论 黄芩苷能通过抑制mTOR信号通路来抑制人结直肠癌HCT116细胞的增殖.
关键词： 黄芩苷 人结直肠癌HCT116细胞 增殖 mTOR信号通路 -
川芎嗪抑制mTOR信号通路介导的帽依赖性翻译而诱导HRPC细胞凋亡
目的 明确川芎嗪(Ligustrazine,TMP)对激素抵抗性前列腺癌(hormone-refractory prostate cancer,HRPC)细胞PC-3的促凋亡效应并探讨其分子机制,评价TMP对正常前列腺上皮细胞RWPE-1的影响.方法 分别用不同终浓度的TMP处理PC-3细胞和RWPE-1细胞48、72 h后,行MTT实验及Annexin V/PI染色法评价TMP对这两种细胞活性及凋亡的影响;Western blot检测TMP对PC-3细胞中mTOR信号通路活化情况及凋亡相关蛋白表达的影响;pull-down及荧光素酶报告基因实验研究TMP对PC-3细胞中翻译起始复合物形成及帽依赖性翻译的影响.结果 TMP对RWPE-1细胞的活性及存活无显著影响,但以剂量依赖及时间依赖的方式抑制PC-3细胞的活性,当TMP浓度≥25μmol/L时,差异具有统计学意义(P＜0.05);与0 μmol/L处理组相比,50、100 μmol/L TMP处理24h即可显著上调PC-3细胞中Bax/Bcl-2比值及Caspase-3的表达,处理后48 h检测发现PC-3细胞发生明显的凋亡(P＜0.01);与0 μmol/L处理组相比,50、100 μmol/L TMP显著抑制PC-3细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及mTOR下游关键蛋白4EBP1和p70S6K的磷酸化,影响翻译起始复合物eIF4F的形成,进而抑制相关蛋白质的帽依赖性翻译及合成.结论 TMP可通过抑制mTOR信号通路的活化来降低HRPC细胞中增殖及抗凋亡相关蛋白的帽依赖性翻译,进而促进其凋亡.
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PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在结外NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义
目的 探讨PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL-N)中的发病机制.方法 通过免疫组织化学EnVision法检测PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR在51例ENKTCL-N及20例反应性增生淋巴结患者中的表达.收集患者临床资料,回顾性分析其临床特征、疗效及预后,采用Kaplan-Meier法进行生存分析.结果 PTEN在EN-KTCL-N患者中的阳性率低于反应性增生淋巴结患者,p-AKT、p-4EBP1的阳性率高于反应性增生淋巴结患者,差异均有统计学意义(P＜0.05);p-mTOR在ENKTCL-N患者中的阳性率高于反应性增生淋巴结患者,但差异无统计学意义(P＞0.05).PTEN阳性患者生存率高于PTEN阴性者,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在ENKTCL-N中存在异常激活,可能与其发病机制相关;PTEN阳性患者预后可能较佳.
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三七总皂苷联合三苯氧胺对人乳腺癌细胞的抑制作用及对PI3K-AKT-mTOR信号通路的影响
目的:探讨三七总皂苷联合三苯氧胺对人乳腺癌细胞的抑制作用及对PI3K-AKT-mRNA信号通路的影响.方法:70只裸鼠于右胸部皮下接种乳腺癌LCC2细胞,选取造模成功的66只裸鼠随机分6组,每组11只,分别为模型对照组,单纯三苯氧胺组,三七总皂苷100 mg/kg、200 mg/kg组及三苯氧胺联合三七总皂苷100 mg/kg、200 mg/kg组,单纯三苯氧胺组腹腔注射三苯氧胺5mg/kg,三七总皂苷100 mg/kg、200 mg/kg组分别灌胃给予三七总皂苷,三苯氧胺联合三七总皂苷100 mg/kg、200 mg/kg组均腹腔注射三苯氧胺5 mg/kg,并分别灌胃给予三七总皂苷100 mg/kg及200 mg/kg,模型对照组给予等体积生理盐水(NS),每日一次,连续给药30天,每周记录肿瘤抑制率,瘤体重量,给药结束后分离瘤体,观察瘤体病理学结果,免疫组化法检测HER-2,GST-л,Caspase-3的表达情况.结果:与三苯氧胺组相比较,三苯氧胺联合三七总皂苷100 mg/kg、200 mg/kg组肿瘤抑制率均明显大于单纯三苯氧胺治疗组,HER-2及GST-л表达量显著低于模型对照组,Caspase-3表达显著高于模型对照组.结论:三七总皂苷能显著协同增加三苯氧胺抗乳腺癌的作用,其机制可能与调控mTOR信号通路,逆转三苯氧胺耐药有关.
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糖皮质激素诱导破骨细胞产生自噬及β-蜕皮甾酮的保护作用
目的:观察超生理剂量糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)对体外培养破骨细胞产生自噬及牛膝活性成分β蜕皮甾酮(β-Ecdysone,β-Ecd)的保护作用,以探讨糖皮质激素引起骨质疏松的部分分子机制及β-脱皮甾酮对其的保护作用.方法:由骨髓干细胞分化培养破骨细胞,用地塞米松(Dexamethasone,Dex)10-5 mol/L浓度作用细胞,将细胞分为7组:(1)正常对照组；(2)1×10-5 mol/L GC模型组:(3) GC+ 10-5mol/L抑制剂Ru486组；(4)GC+ 10-5mol/L阿仑磷酸钠(Alendronate,ALN)组；(5) GC+ 10-5mol/Lβ蜕皮甾酮组；(6)GC+ 10-6mol/Lβ蜕皮甾酮组；(7) GC+ 10-7mol/Lβ蜕皮甾酮组.实时荧光定量PCR(Real time PCR)检测相关基因mRNA表达,Western Blot检测LC3(Ⅰ、Ⅱ)蛋白表达.结果:(1) 10-5 mol/L GC使破骨细胞AKT1、mTOR、p70S6K mRNA表达下降(P＜0.05),10-5 mol/L、10-6mol/L、10-7mol/Lβ蜕皮甾酮能不同程度保护细胞降低的基因mRNA表达水平.(2) 10-5mol/L GG使破骨细胞LC3(Ⅰ、Ⅱ)蛋白表达升高(P＜0.05),10-5mol/Lβ蜕皮甾酮能抑制GC对细胞的影响.结论:超生理剂量糖皮质激素可能通过影响mTOR信号通路引起破骨细胞产生自噬现象；一定剂量β蜕皮甾酮则能不同程度地保护糖皮质激素对破骨细胞的影响.
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观察炎症状态和高脂状态对mTOR/S6K/IRS1-Ser和IRS1-Tyr信号通路表达的影响
目的 观察在体内外炎症状态下哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-70S核糖体蛋白s6激酶(S6K)-胰岛素受体底物1(IRS1)信号传导通路异常磷酸化表达对胰岛素抵抗的影响.方法 体外实验,将HepG2分为4组:对照组、高脂组[给予100 mg/L低密度脂蛋白(LDL)b理]淡症介入组[给予20 μg/L肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理]、联合干预组(给予20μg/L TNF-α+100 mg/L LDL处理).采用实时定量PCR和Western blotting方法检测mTOR、S6K和IRS1 mRNA及蛋白表达水平；体内实验,8周龄c57BL/6J小鼠随机分为4组(正常饮食组、正常饮食加炎症组、高脂饮食组和高脂饮食加炎症组),分别给予隔日皮下注射生理盐水和酪蛋白建立炎症模型,8周后将实验小鼠于深度麻醉下处死并检测其肝脏组织中mTOR、S6K和IRS1 mRNA及蛋白表达水平.结果 体内外实验均显示与对照组相比,炎症组与高脂组mTOR、S6K和IRS 1-Ser mRNA及蛋白表达增加,而联合干预组表达明显增高,IRSITyr mRNA及蛋白表达下降,联合干预组表达明显降低.结论 炎症及高脂状态激活mTOR/s6k/IRS 1-Ser信号通路,而抑制IRs1-Tyr信号通路,从而加重胰岛素抵抗.
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食管鳞状细胞癌和外周T淋巴细胞mTOR的表达
目的 观察mTOR及其信号通路分子在食管鳞状细胞癌和外周T淋巴细胞的表达.方法 收集40例食管鳞状细胞癌术后癌组织、癌旁组织和外周T淋巴细胞,运用免疫组化、实时定量聚合酶链反应及流式细胞术检测mTOR、raptor及p-TSC2的表达量.结果 癌组织mTOR和raptor表达量明显高于癌旁组织.临床Ⅲ～Ⅳ期mTOR蛋白的阳性表达率明显高于临床Ⅰ～Ⅱ期.患者外周血T淋巴细胞p-mTOR、p-TSC2的表达量高于正常人.结论 食管鳞状细胞癌及外周T淋巴细胞中mTOR信号通路活化程度强于正常人.
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雷帕霉素干预TRALI大鼠肺组织mTOR信号通路下游蛋白p70s6k/p-p70s6k表达与肺病理变化研究
目的 建立SD大鼠输血相关急性肺损伤(TRALI)模型,探讨雷帕霉素干预TRALI大鼠肺组织mTOR信号通路下游蛋白p70s6k/p-p70s6k表达与对肺损伤病理变化的影响.方法 SD大鼠30只随机分成3组(10只/组),TRALI模型组:LPS 2 mg/kg腹腔注射+人血浆5 mL/kg静脉注射;雷帕霉素干预组(Rapa组):Rapa 10 mg/kg连续3 d灌胃+TRALI模型;对照组:假手术处理.观察各组大鼠临床症状、肺组织病理变化及p70s6k/p-p70s6k蛋白表达情况.结果 TRALI大鼠的主要临床表现为呼吸困难及内毒素样等症状,症状出现率TRALI组较对照组明显增加(P＜0.05),Rapa组较TRALI组无明显变化(P＞0.05).TRALI组、Rapa组和对照组大鼠肺损伤病理综合评分分别为9.30±2.21 vs 6.60±1.78 vs 2.60±1.82(P ＜0.01).TRALI组、Rapa组和对照组大鼠肺组织的磷酸化蛋白p-p70s6k表达的Western blot条带半定量结果分别为0.566 4±0.032 9 vs 0.114 2±0.006 4 vs 0.438 4±0.022 1(P＜0.01).结论 TRALI病程中mTOR信号通路明显活化,应用Rapa可有效抑制mTOR信号通路过度活化状态,并能部分缓解肺组织病理损伤程度.
关键词： 输血相关性急性肺损伤 mTOR信号通路 雷帕霉素 动物模型 大鼠 -
几个转移相关基因的评估
目的 围绕实验室筛选鉴定的MAG-1,MAG-2,I4-3-3ζ和PAR1等转移相关基因进行分析比较,对其在肿瘤转移的功能和作用机理进行评估.方法 MAG-1,MAG-2,14-3-3ζ是利用抑制消减杂交技术(Sup-pression subtractive hybridization,SSH),以同源性人巨细胞肺癌细胞系PLA-801亚克隆得到的一对具有不同转移能力的细胞株为模型,结合cDNA微阵列(cDNAmicroarry)得到了99条在高转移性细胞株中高表达的序列和98条在低转移细胞株中高表达的序列.从高转移性细胞株中高表达的序列中选择具有自主创新性的肿瘤转移相关新基因MAG-1,MAG-2;从低转移细胞株中高表达的序列选出已知基因14-3-3ζ.PAR1是凝血酶受体基因.对以上基因通过生物信息学分析,分子克隆和基因转染表达于肺癌细胞株,结合正反义和RNA干涉技术,检测细胞的生物学功能变化.并对其可能涉及的相关分子及信号传导路径进行分析.并结合临床标本进行验证.结果 MAG-1、MAG-2基因和PAR1能影响人肺巨细胞癌高、低转移潜能细胞株PLA-801D、PLA-801C的生长、粘附、侵袭等特性以及与肿瘤细胞转移相关的某些分子的表达相关,是可能的肿瘤转移相关基因.MAG-1为溶血磷脂酸酰基转移酶家族成员之一(LPAAT theta),可通过其丝苏氨酸激酶受体活化mTOR信号通路影响其促进癌细胞的侵袭转移.MAG-2与PAR1作用机理均可能与细胞内Ca<'2+>通路有关.14-3-3ζ的高表达可能抑制肺癌细胞转移,其低表达与肿瘤高转移行为相关.以上几个基因均在临床标本的检测中得到证实.结论 几个本研究室筛查并深入探索的基冈确实是肿瘤转移调控的相关基因.但由于转移的发生是多阶段、多因素、多基因的复杂过程,迄今为止远不能从根本上阐明肿瘤转移的机理问题.以上研究却从另外一个角度加深了人们对转移复杂性的认识程度.
