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不同周期新辅助化疗后乳腺癌干细胞的分离培养和体外增殖特性
背景：接受不同周期新辅助化疗的乳腺癌组织中是否都存在乳腺癌化疗微球体以及其对乳腺癌干细胞分离培养的影响尚不清楚。
目的：探讨不同周期新辅助化疗后乳腺癌组织乳腺癌干细胞的体外增殖特性。
方法：从不同周期新辅助化疗后的乳腺癌组织中分离微球体，绘制细胞生长曲线，免疫细胞化学检测乳腺癌干细胞标记物ALDH1表达情况。
结果与结论：从新辅助化疗1个周期的标本中无法获得微球体，化疗2，3，4个周期的部分标本中可以培养出微球体。在培养的前3 d，化疗3个周期和化疗2个周期细胞数差异无显著性意义，但在3 d 之后，化疗3个周期的细胞增殖速度显著快于化疗2个周期，6 d 之后，化疗2个周期的细胞生长曲线呈现出平缓的状态，化疗3个周期则呈现出迅速上升的状态。化疗3个周期标本的乳腺癌干细胞微球体中ALDH1阳性细胞比例大于化疗2个周期。结果表明化疗2、3个周期的乳腺癌干细胞均具有一定的增殖和分化能力，从化疗后的乳腺癌组织中分离乳腺癌干细胞宜选取化疗3个周期及以上的标本。 -
CyclinD1、P27、CK19、ALDH1A1在乳腺病变中表达及意义
目的 探讨细胞周期D1(CyclinD1)、P27、细胞角蛋白19(CK19)、ALDH1A1在乳腺病变中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组化法检测79例乳腺组织标本(包括正常乳腺、乳腺增生、乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌)中CyclinD1、P27、CK19、ALDH1A1的表达情况,分析其与乳腺癌干细胞增殖及乳腺病变组织分化程度之间的关系.
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基底型和HER2过表达型BCSCs裸鼠移植瘤生物学特性的比较
目的 建立基底型及HER2过表达型乳腺癌干细胞(BCSCs)裸鼠移植瘤模型,比较两亚型BCSCs生物学特性.方法 以临床乳腺癌组织标本为研究对象,通过无血清悬浮培养筛选原代BCSCs；有限稀释法检测BCSCs自我更新能力；体内裸鼠移植瘤实验比较两亚型BCSCs成瘤时间、瘤体体积及瘤体质量,绘制生长曲线；Western blot检测肿瘤组织E-cadherin、N-cadherin、MMP2及MMP7蛋白表达.结果 无血清悬浮培养能有效筛选出BCSCs；有限稀释实验显示HER2过表达型及基底型BCSCs含量分别为(4.55±0.19)％和(0.90±0.04)％,前者是后者的5.0倍；两亚型BCSCs成瘤率均为100％；HER2过表达型移植瘤生长速率、瘤体体积和质量均高于基底型乳腺癌(P＜0.05).Western blot显示HER2过表达型乳腺癌间质样标志物N-cadherin及侵袭相关标志物MMP2、MMP7蛋白表达明显上调(P＜0.05),上皮样标志物E-cadherin蛋白表达明显下调(P＜0.05).结论 成功建立基底型及HER2过表达型乳腺癌裸鼠移植瘤模型,HER2可能通过调控EMT增强HER2过表达型BCSCs体外自我更新能力、体内致瘤性及侵袭性.
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乳腺癌干细胞的研究进展
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤.随着乳腺癌发生、发展研究的不断深入,乳腺癌干细胞日益受到研究者们的重视.乳腺癌干细胞是首次分离出来的实体干细胞,研究表明,它是一群未分化、具有多种分化和自我更新能力的细胞.正常情况下,乳腺干细胞的分化、更新能力受激素及信号转导通路的严格控制,一旦这种机制被破坏或发生异常,干细胞就会异常分化,变成乳腺癌干细胞,并无限生长形成肿瘤.乳腺癌干细胞具有放、化疗抵抗性,高致瘤性及高侵袭转移性,其在乳腺癌的发生、发展及复发、转移过程起到非常重要的作用.因而,要想更好地治疗乳腺癌就需要寻找针对这些干细胞的靶标,从而为临床靶向治疗乳腺癌提供依据.本文对乳腺癌干细胞在乳腺癌研究及治疗中的新进展进行综述.
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乳腺癌干细胞Caspase通路及中药干预凋亡机制的研究进展
乳腺癌为女性死亡率高的癌症之一,复发转移率高,主要原因之一是放化疗手段无法彻底根除乳腺癌干细胞.许多研究主要致力于乳腺癌干细胞的药物干预,但对于乳腺癌干细胞的中药干预凋亡方面涉及较少且分散.本文旨在综述目前科学领域对于乳腺癌干细胞Caspase通路的研究,分析Caspase通路与其他通路的相互作用,并总结中药干预乳腺癌干细胞凋亡的研究工作,希望为乳腺癌的治疗提供新的思路.
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染色质重塑蛋白MORC2通过调节ALDH1A3表达促进乳腺癌细胞的干性
背景与目的:染色质重塑蛋白MORC家族CW型锌指结构蛋白2(microrchidia family CW-type zinc finger 2,MORC2)在DNA介导的基因转录及DNA损伤修复等基本生物学过程中发挥重要作用,但其对乳腺癌细胞生物学行为的影响目前尚无相关报道.乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)家族成员ALDH1A3(alde-hyde dehydrogenase family 1 member A3,ALDH1A3)是一种公认的乳腺癌干细胞的标志物,但其在乳腺癌细胞中的调控机制目前尚不清楚.该研究拟探讨敲低MORC2基因对ALDH1A3表达以及对乳腺癌细胞干性的影响.方法:利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的基因沉默方法构建稳定敲低MORC2基因的乳腺癌细胞系;利用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)分析敲低MORC2基因对ALDH1A3表达的影响;利用微球体形成实验和流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)分析敲低MORC2对乳腺癌干细胞亚群的影响.结果:Western blot和RTFQ-PCR分析结果显示,敲低MORC2基因显著下调ALDH1A3蛋白及mRNA水平;微球体形成实验显示敲低MORC2基因显著抑制MCF-7细胞的成球能力;FACS分析显示敲低MORC2基因显著下调ALDH1A3阳性乳腺癌干细胞亚群,而对CD44+CD24-乳腺癌干细胞亚群没有明显影响.结论:MORC2通过调节ALDH1A3的表达促进乳腺癌干细胞表型.
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不同表型的乳腺癌干细胞研究现状及其临床应用价值
肿瘤干细胞理论认为肿瘤起源于小部分具有干细胞特性的肿瘤细胞。乳腺癌干细胞是乳腺癌细胞中极少数具有自我更新、多向分化潜能和高致瘤性的细胞亚群，与乳腺癌复发、侵袭转移、放化疗抵抗及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等密切相关。就近年来乳腺癌干细胞的研究进展予以综述。
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呼肠孤病毒诱导乳腺癌微球体细胞凋亡
目的:探讨呼肠孤病毒对乳腺癌微球体细胞凋亡的影响.方法:以干细胞培养液培养乳腺癌细胞MCF-7和BT474,形成微球体,分别用呼肠孤病毒和表柔比星处理微球体,FCM检测MCF-7、BT474微球体细胞中CD44+ CD24-/low细胞的比例,TUNEL法检测微球体细胞的凋亡,Western blotting检测MCF-7细胞及其微球体细胞中Ras的表达.结果:呼肠孤病毒对乳腺癌MCF-7和BT474微球体细胞的感染率显著高于亲本细胞(均P＜0.05).表柔比星作用下MCF-7和BT474微球体细胞中CD44+ CD24-/low细胞比例明显升高[(8.1±0.4)％ vs(18.0±4.5)％,P＜0.01；(0.6±0.2)％ vs(0.9±0.13)％,P＜0.05].呼肠孤病毒感染后MCF-7和BT474微球体细胞中CD44+ CD24-/low细胞比例明显下降[(8.1±0.4)％ vs(0.8±0.2)％,(0.6±0.2)％vs(0.2±0.1)％；均P＜0.05].MCF-7和BT474微球体细胞在呼肠孤病毒感染后凋亡率明显增加[(1.90±0.21)％vs(5.0±1.4)％,P＜0.05;(0.20±0.1)％ vs(1.0±0.16)％,P＜0.05].MCF-7细胞及其微球体细胞均高表达Ras,且两者水平相似.结论:与表柔比星相比,呼肠弧病毒对乳腺癌微球体细胞的抑制作用明显,还可明显诱导乳腺癌微球体细胞凋亡.
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乳腺癌生物治疗的研究进展
乳腺癌的发病率近年呈上升趋势,生物治疗是继手术、放疗和化疗之后治疗乳腺癌的又一手段.曲妥珠单抗作为一线治疗药物,联合化疗治疗血清Her-2+的转移性或晚期乳腺癌患者有显著的临床效果,可以在疾病恶化之前提升总反应率和疾病进展时间；但该单抗药物有心脏毒性,心脏病患者应谨用,如左心室射血分数≤50％应考虑停药.一种新的曲妥珠单抗与细胞毒药物的复合制剂可以增加疗效,降低不良反应.正在研究的乳腺癌生物治疗方法包括树突状细胞治疗、溶瘤病毒治疗、细胞因子治疗、干细胞治疗和基因治疗等.
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5-FU对小鼠乳腺癌4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞的富集作用
目的:探讨以氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)处理并通过荷瘤小鼠模型体内传代的方法富集乳腺癌干细胞样细胞的可行性,为靶向肿瘤干细胞治疗奠定基础.方法:以乳腺癌细胞株4T1皮下接种小鼠制备荷瘤模型,以一定剂量5-FU腹腔注射4周；处死小鼠后取肿瘤组织制成细胞悬液,并接种小鼠制备下一代小鼠荷瘤模型,5-FU处理及再次传代方法同上,共传4代.对照组小鼠给予生理盐水注射,其余处理同模型组.流式细胞术检测各代肿瘤组织中CD44+ CD24-/low细胞比例,Hoechast 33342染色法检测侧群(side population,SP)细胞的比例,免疫组化法检测CD55和ALDH1蛋白的表达,倒置显微镜观察乳腺癌细胞微球体的形成,小鼠致瘤实验检测不同肿瘤细胞的致瘤能力.结果:各代对照组小鼠模型肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例为(11.5±0.9)％,SP细胞比例为(9.7±1.3)％,ALDH1表达阴性,CD55强阳性表达细胞数为(0.6±0.3)％,乳腺癌细胞微球体比例为(0.5±0.2)％；5-FU处理组4代小鼠模型肿瘤组织中CD44+ CD24-/low细胞比例分别为(49.8±1.2)％、(56.8％±1.7)％、(66.4±1.5)％、(69.0±1.6)％,SP细胞比例分别为(25.0±1.2)％、(42.6±2.8)％、(58.4±2.1)％、(61.3±2.6)％,ALDH1阳性表达细胞比例为(3.8±0.7)％、(14.1±2.4)％、(25.2±3.1)％、(27.5±2.7)％,CD55强阳性细胞比例为(7.8±1.6)％、(10.1±2.0)％、(15.6±1.4)％、(17.3±1.9)％,乳腺癌细胞微球体形成比例为(5.9±0.4)％；两组各相应指标之间差异均具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).5-FU作用后富集了肿瘤干细胞的第3代肿瘤细胞的致瘤作用显著强于对照组细胞(P＜0.05).结论:5-FU作用并通过荷瘤小鼠体内传代能够富集小鼠乳腺癌4T1细胞株中的肿瘤干细胞样细胞.
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阻断PI3K/Akt信号通路对低氧微环境中BCSCs微球体细胞增殖的影响
目的:探讨LY294002特异性阻断磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K) /Akt信号通路对低氧条件下乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)微球体细胞增殖的影响.方法:通过无血清悬浮培养技术从人乳腺癌MCF-7细胞中筛选BCSCs微球体,应用免疫荧光染色检测BCSCs相关标志物CD44及CD133的表达,MTT法检测不同浓度LY294002处理后BCSCs微球体细胞的增殖情况,RT-PCR法检测BCSCs微球体细胞中缺氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α)mRNA的表达,蛋白质印迹法检测BCSCs微球体细胞中HIF-2α、PI3K和磷酸化Akt (phospho-Akt,p-Akt)蛋白的表达.结果:筛选获得的微球体细胞高表达BCSCs相关标志物CD44和CD133.LY294002能有效抑制低氧条件下BCSCs微球体细胞的增殖,抑制效应在药物作用后72～96 h为明显(P＜0.05).与低氧组比较,低氧+LY294002组微球体细胞中HIF-2α mRNA及PI3K、p-Akt和HIF-2α蛋白表达水平均明显下调,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:LY294002通过特异性阻断PI3K/Akt信号通路而有效抑制低氧条件下BCSCs微球体细胞的体外增殖能力.
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乳腺癌靶向治疗的新策略
目前,乳腺癌的常规治疗手段如化疗、放疗等存在严重的全身副作用,为此,开展乳腺癌的靶向治疗研究具有重大意义.本文综述了乳腺癌靶向治疗的3个研究领域:抗体介导的靶向、微载体介导的靶向、乳腺癌干细胞靶向,并阐述这些治疗策略的基本研究思路,分析这些新的治疗策略面临的一些问题,从而提出解决这些问题的相关见解.
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乳腺癌干细胞的富集及相关基因表达
目的 通过微球体培养富集乳腺癌干细胞,并检测其相关基因的表达. 方法 将MCF-7乳腺癌细胞进行第一代微球体培养,7 d后消化微球体获得单细胞悬液,取部分细胞进行第二代微球体培养,另一部分细胞则在胶原底物进行分化培养.于培养第11天收集第二代微球体细胞、分化细胞,采用流式细胞术进行干细胞比例分析;同时应用Real-time PCR技术检测β-catenin、CXCR4、SOX2、ALDH3A1 mRNA 表达. 结果 流式细胞分析显示,微球体细胞和分化细胞的侧亚群细胞比例分别为(7.36±0.54)%和(4.32±0.42)%(P<0.05),CD55high比例分别为(17.41±1.09)%和(4.47±0.33)%(P<0.05).Real-time PCR检测结果表明,微球体细胞与分化细胞相比,β-catenin、CXCR4、SOX2及ALDH3A1 mRNA表达分别上调了约1.5、5.0、4.0和5.7倍(P<0.01). 结论 微球体细胞富集了较高比例的乳腺癌干细胞,且β-catenin、CXCR4、SOX2、ALDH3A1 mRNA呈现高表达.
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E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒对乳腺癌干细胞的作用
目的 研究E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒(E1B-- OLV)对乳腺癌干细胞的作用. 方法 E1B- OLV感染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞(实验组),常规培养MCF-7细胞作为对照组.两组细胞分别行流式细胞仪(FCM)分析CD44+CD24-细胞的表型比例.两组细胞同时行微球体培养,观察微球体形成的大小及数量,计算微球体形成率(MFE),用FCM分析微球体CD44+CD24-细胞的比例. 结果 实验组MCF-7细胞的CD24-、CD44+和CD44+CD24-比例分别为43.90%、63.26%和22.19%,对照组为6.74%、88.30%和2.30%.实验组中微球体成球时间早于对照组,球体体积大于对照组,MFE高于对照组(1.26%和0.9%);实验组和对照组微球体中CD44+CD24-细胞的比例分别为38.08%和23.35%. 结论 ElB-- OLV在短期内杀死MCF-7细胞,但主要是乳腺癌分化细胞,可能促进了乳腺癌干细胞的生长,加快了其自我更新和分化速率.
关键词： 溶瘤腺病毒 乳腺癌干细胞 微球体培养 CD44+CD24-细胞 -
微小RNA与乳腺癌干细胞的关系
乳腺癌是女性较常见的恶性肿瘤,同时也是一种严重影响患者身心健康甚至危及生命的恶性肿瘤.研究表明,微小RNA(miRNAs)在人类的癌症中扮演着至关重要的角色,可起到癌基因或抑癌基因的作用[1].近几年,随着分子研究领域技术水平的提高以及癌干细胞学说的提出,关于miRNAs在乳腺癌干细胞中的表达的实验研究逐渐深入.本研究对miRNAs、乳腺癌干细胞及两者相关的表达、基因调控等内容进行综述.
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乳腺癌的靶向治疗研究进展
作为严重危害女性身心健康的恶性肿瘤,乳腺癌的发病率在我国女性恶性肿瘤中居首位.针对乳腺癌发生、发展有关的信号通路进行靶向药物的开发与临床应用成为乳腺癌治疗研究的新热点.本文主要介绍了目前针对各种分子分型的乳腺癌进行的临床靶向治疗和正在开展的靶向药物研发,同时对乳腺癌干细胞靶向治疗的新进展进行综述.
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MEK/ERK信号通路活性表达与乳腺癌干细胞增殖和凋亡的关系
目的 探讨MEK/ERK信号通路在乳腺癌干细胞增殖和凋亡中的作用.方法 体外培养乳腺癌干细胞,采用MEK抑制剂PD98059抑制MEK/ERK信号通路表达,Western blot检测PD98059对p-ERK1/2表达的影响,进一步应用MTT法测定PD98059对乳腺癌干细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期变化;同时,TUNEL荧光染色分析、Histone/DNA ELISA和流式细胞术检测评价细胞凋亡.结果 PD98059可有效下调p-ERKl/2表达,抑制乳腺癌干细胞生长,诱导G0/G1期抑制;TUNEL荧光染色,Histone/DNA ELISA检测和流式细胞术检测分析显示PD98059可有效诱导乳腺癌干细胞凋亡.结论 MEK/ERK信号通路在乳腺癌干细胞增殖和凋亡中发挥重要作用.
关键词： 乳腺癌干细胞 细胞外信号调节蛋白激酶 增殖 凋亡 -
乳腺癌干细胞亚群比例的改变与芳香化酶抑制剂耐药的相关性
目的 分析乳腺癌干细胞(BCSCs)亚群比例的改变与芳香化酶抑制剂(AIs)耐药之间的相关性.方法 采用流式细胞术检测对AIs耐药的人源性乳腺癌细胞株MCF-7(MCF-7/AI)及野生型人源性乳腺癌细胞株MCF-7中CD44+ CD24-细胞的数量,比较MCF-7/AI和MCF-7中CD44+CD24-细胞的比例.结果 MCF-7/AI和MCF-7中CD44+ CD24-细胞的平均比例分别为( 13.15±5.50)％和(0.39±0.22)％(P＜0.05).结论 MCF-7/AI中BCSCs亚群的比例显著高于MCF-7,提示AIs耐药和BCSCs之间可能存在着一定的相关性,BCSCs亚群比例的改变可能是AIs耐药的重要标志之一.
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源于乳腺癌干细胞的内皮细胞参与肿瘤血管形成的实验研究
目的：肿瘤干细胞是肿瘤细胞中表达干细胞相关标志的亚群，具有高增殖能力和多向分化潜能。文中探讨源于乳腺癌干细胞的内皮细胞是否参与了乳腺癌的血管形成过程，为乳腺癌发病机制提供部分理论基础。方法收集人乳腺癌组织样本，免疫组化法和免疫荧光法检测肿瘤血管中突变型P53、CD31、VEGF的表达，荧光原位杂交方法检测Her-2扩增情况；制备乳腺癌单细胞悬液，采用免疫磁珠分选方法分选出CD44＋／CD24－／low细胞，以培养体系为EGM-2内皮细胞培养基培养，流式细胞检测其内皮细胞表面标志CD31和CD105的表达和摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力，体外进行三维胶培养，观察其脉管样结构。结果乳腺癌组织样本的石蜡切片中均可观察到CD31、VEGF、突变型P53的表达，并沿着血管腔或血管球排列；免疫荧光显示乳腺癌组织血管内表达CD31和DAPI信号；在分离成功的乳腺癌干细胞进行免疫磁珠分选，分选前、后细胞中CD44＋细胞比例分别为（7．5±2．6）％、（94．3±4．7）％；分选前、后细胞中CD24＋细胞比例分别为（48．2±9．4）％、（4．3±1．6）％， CD24＋细胞比例越低则CD24－／low细胞比例越高；乳腺球细胞中CD105＋细胞比例为（4．5±0．9）％，CD31＋细胞比例为（6．2±1．3）％；经内皮细胞培养体系持续培养3代后，CD105＋和CD31＋细胞比例明显提高分别为（79．6±9．3）％和（84．1±10．7）％；经内皮细胞培养体系培养后的细胞能吞噬DiL-Ac-LDL，说明该细胞具有内皮细胞类的功能；内皮细胞组可见有脉管样结构形成，而脂肪细胞无脉管样改变的趋势。结论乳腺癌干细胞来源的内皮细胞可分化为血管内皮细胞，在体外培养中可参与肿瘤血管的形成。
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RAd-p53、E1B--OLV及紫杉醇对乳腺癌干细胞的作用
[目的]研究重组p53腺病毒(RAd-p53)、E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒(E1B--OLV)及化疗药物紫杉醇对乳腺癌干细胞的作用.[方法]分别用RAd-p53、E 1B--OLV、紫杉醇感染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,并常规培养MCF-7细胞.流式细胞仪(FCM)分析CD44+CD24-细胞的表型比例,及行微球体培养,观察微球体大小,用FCM分析微球体CD44+CD24-细胞的比例.[结果] RAd-p53感染MCF-7细胞的CD24-,CD44+,CD44+CD24-比例为(3.670±0.577)％,(53.300±0.580)％,(0.930±0.116)％(P＜0.05)；E1B--OLV感染组为(24±1)％,(60±1)％,(10.670±1.528)％ (P＜0.05);紫杉醇组为(14±1)％,(3.670±0.577)％,(2.330±1.528) ％(P＞0.05),对照组为(14±1)％,(50±1)％,(2.270-0.643)％.RAd-p53感染组及E1B--OLV感染组的微球体大小与对照组相仿,成球时间早于对照组,紫杉醇组的微球体小于对照组,成球时间则晚于对照组.RAd-p53组微球体中CD24-,CD44+,CD44+CD24-的比例为(3.670±0.577)％,(44.670±0.577)％,(17±1)％(P＜0.05)；E1B--OLV组为(24.670±0.577)％,(29.670±1.528)％,(23.5±0.5)％(P＜0.05)；紫杉醇组为(77.330±1.528)％,(1.100±0.361)％(P＜0.05),(19±1)％(P＞0.05)；对照组为(11±1)％,(50±1)％,(20.330±1.528)％.[结论]RAd-p53促进BCSCs分化成增殖祖细胞,减少了CD44+CD24-细胞比例.E1B--OLV病毒杀伤MCF-7细胞,加快BCSCs自我更新,促进其分化成干细胞性质的子代.紫杉醇能杀死MCF-7细胞,对BCSCs无杀伤或促进其分化作用.
关键词： 溶瘤病毒 化疗 乳腺癌干细胞 微球体 CD44+CD24-细胞
