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OZ78单剂口服治疗对小鼠体内日本血吸虫成虫超微结构的损害
目的 观察合成的螺金刚烷臭氧化物OZ78对日本血吸虫成虫所引起的超微结构变化.方法 10只小鼠每鼠感染40～60条日本血吸虫尾蚴,感染后35 d,取8只小鼠,每鼠口服单剂OZ78 400 mg/kg,治后24h、3d、7d和14d各剖杀2只小鼠,用灌注法收集血吸虫,并按常规方法固定和处置虫体,透射电镜观察.从另2只未治疗的感染小鼠体内取虫作对照.结果 感染鼠经OZ78治后24 h,雌、雄虫皮层的明显变化是因细胞质突起肿胀致使体表平坦、远端细胞质突起不规则膨大伴有杆状和盘状分泌体减少、皮层基质局灶性溶解、一些细胞质突起融合成大片状、基底膜破裂或消失,感觉器内部结构受损.在皮层下,肌束无或呈轻度肿胀,并查见肌束局灶性溶解,而肌层下的皮层细胞示核肿大、部分核膜模糊和染色质局灶性溶解形成小空泡,在核周胞质内出现变性线粒体.实质组织的主要变化是线粒体变性,以及一些小空泡与髓鞘样结构的形成.肠上皮细胞的明显变化是细胞核的不规则肿大、核仁轻度溶解和部分双层核膜融合、细胞质中的线粒体变性和微绒毛破溃.此时雌虫卵黄细胞明显的变化为许多卵黄滴破裂,卵黄球释出,继而溶解和融合.治后3～7 d,虫体受损的范围和程度加重.雄虫和雌虫的明显损害是细胞质突起的融合、受损细胞质突起剥落或破溃以致肌束显露、感觉器和皮层细胞的严重破坏、肌束局灶性或广泛肿胀和溶解、出现一些大片变性的实质组织和严重受损的肠上皮细胞.雌虫的卵黄细胞则示卵黄滴减少、细胞核局灶性溶解及卵黄细胞间实质组织的广泛溶解.经OZ78治后14d,存活雌、雄虫的受损皮层和皮层下组织均有一些恢复,而大多数肠上皮细胞和卵黄细胞仍示有明显损害. 结论 OZ78对日本血吸虫成虫的皮层和皮层下组织,包括皮层细胞、实质组织、肠上皮细胞和卵黄细胞具有广泛的损害作用.
关键词： 合成的螺金刚烷臭氧化物 OZ78 日本血吸虫 超微结构变化 透射电镜 -
可诱导共刺激分子信号介导的免疫应答对血吸虫性肝纤维化形成的影响
目的 探讨可诱导共刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)信号介导的Th2极化对日本血吸虫所致肝纤维化的影响. 方法 建立ICOS转基因(ICOS-Tg)小鼠及野生型FVB/NJ小鼠日本血吸虫病模型,分别于感染前(0周)和感染后4、7、12、16和20周采集小鼠血清、脾淋巴细胞和肝脏.脾淋巴细胞用可溶性虫卵抗原(SEA)诱导培养72 h后,应用ELISA法分别检测细胞培养上清中细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素12 (IL-12)、IL-4和IL-13水平,血清中SEA特异性抗体IgG及其亚类IgG1和IgG2a的水平,以及血清中透明质酸(HA)和羟脯氨酸(HYP)的含量.应用免疫组化法检测各期感染小鼠肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转移生长因子β1(TGF-β1)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen-Ⅰ)水平.分别应用苏木素-伊红(HE)染色法和胶原纤维Masson染色法动态观察感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿病变及纤维化程度. 结果 ICOS-Tg小鼠Th2细胞因子IL-4和IL-13水平自感染后7～20周均显著高于野生型小鼠(P＜0.05),Th1细胞因子IFN-γ和IL-12两组之间差异均无统计学意义(P＞0.05).ICOS-Tg小鼠的Th2分化指数亦高于野生型小鼠,在感染后7～20周差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).ICOS-Tg小鼠的SEA特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a水平均显著高于野生型小鼠(P＜0.05或P＜0.01,感染后4～7周IgG水平除外),IgG1/IgG2a比值均高于野生型小鼠,其中感染后12和16周(ICOS-Tg小鼠为5.75±0.94和4.96±0.98,野生型小鼠为4.31±0.81和3.41±0.83)差异有统计学意义(P＜0.05).ICOS-Tg小鼠血清中HA和HYP的水平均高于野生型小鼠,分别在感染后7～20周及12～20周两组差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).免疫组化结果显示,ICOS-Tg小鼠于感染后7～20周肝脏α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平均显著高于野生型小鼠(P＜0.05或P＜0.01)；collagen-Ⅰ的表达水平亦高于野生型小鼠,但仅在感染后20周两组差异有统计学意义(P＜0.05).肝组织HE染色结果显示,ICOS-Tg小鼠于感染后7、12和16周的单卵肉芽肿体积[分别为(28.72±6.68)×106、(20.47±5.09)×106和(12.77±4.86)×106μm3],均显著大于同期野生型小鼠[分别为(18.04±6.21)×106、(15.28±4.87)×106和(11.24±4.38)×106 μm3](P＜0.05).Masson染色结果显示,ICOS-Tg小鼠的肝脏纤维化程度较高,但两组的纤维化程度评分差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 感染日本血吸虫ICOS-Tg小鼠的Th2免疫应答显著上调,且其肝纤维化程度和相关指标均增强,表明ICOS信号介导的Th2极化与感染日本血吸虫导致的肝纤维化有关.
关键词： 日本血吸虫 可诱导共刺激分子信号 转基因小鼠 Th2极化 肝纤维化 -
日本血吸虫核糖体蛋白SjRibosomal_L18a及其B细胞表位的筛选和评价
目的 筛选获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核糖体蛋白(SjRibosomal_L18a)编码基因,预测其B细胞表位.克隆、表达重组蛋白SjRibosomal_L18a,并比较分析其与合成的B细胞表位的潜在诊断价值. 方法 利用B细胞表位预测软件筛选日本血吸虫蛋白质序列,获取函数打分值较高且抗原表位片段多的免疫原性蛋白,合成B细胞表位片段.生物信息学方法分析免疫原性蛋白基因及其编码蛋白的相对分子质量(M3、等电点、亲水性、信号肽、跨膜区和功能结构域等理化性质.制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA,逆转录PCR (RT-PCR)扩增目的基因,分析各虫期转录本丰度.将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a中,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BI21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标记亲和层析法纯化重组蛋白.ELISA法比较分析重组蛋白和合成的B细胞表位的潜在诊断价值. 结果 预测软件筛选出免疫原性核糖体蛋白SjRibosomal_L18a以及2个B细胞表位(P1和P2).SjRibosomal_L18a基因开放阅读框(ORF)由531个碱基组成,编码176个氨基酸,不含跨膜区和信号肽,为Mr20 741,等电点为11.12.RT-PCR结果显示,各虫期均检测到SjRibosomal_L18a的转录本,且转录水平均较高.成功构建重组表达质粒SjRibosomal_L18a/pET-28a,诱导表达获得包涵体形式的重组蛋白,约为Mr26 069.ELISA检测结果显示,重组蛋白、P1和P2检测15份慢性血吸虫病患者血清和15份健康人血清的敏感性和特异性分别为53.3％ (8/15)和100％ (15/15)、60％ (9/15)和100％ (15/15)、73.3％ (11/15)和100％ (15/15). 结论 获得重组蛋白SjRibosomal_L18a及其免疫原性较高的表位片段P1、P2,P1和P2用于血清诊断的敏感性均高于重组蛋白.
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群体水平日本血吸虫弹性蛋白酶遗传差异研究
目的 分析不同地理来源的日本血吸虫群体弹性蛋白酶基因的遗传差异,研究该基因是否受到自然选择. 方法 PCR扩增不同流行区的血吸虫成虫弹性蛋白酶基因并测序,分别计算血吸虫各群体遗传多态性指数(Watterson's θ和Tajima's π)、选择压力指数(dN/dS和Tajima's D)以及群体间分化指数(Fst),用Network软件进行系统进化分析. 结果 共获得73条来自不同群体的日本血吸虫弹性蛋白酶基因序列.分析发现:长江中下游地区(安徽铜陵和湖南岳阳)群体内遗传差异大,而菲律宾和湖北沙市的群体内无遗传差异；仅湖南岳阳日本血吸虫群体的Tajima's D＞0,其他群体均为负值；安徽铜陵群体dN/dS＞1,台湾群体dN/dS＜1,其他群体dS=0,但非同义突变数明显高于同义突变数；群体分化和系统进化分析均显示台湾群体与其他群体之间遗传距离远. 结论 不同地理来源的日本血吸虫群体在弹性蛋白酶基因上的遗传多态性有较大差异,特别是长江中下游群体之间；弹性蛋白酶基因在进化过程中可能受到了正向选择；台湾的日本血吸虫群体与其他群体的遗传分化大.
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7种抗疟药抑制疟色素形成及其体外、体内抗日本血吸虫作用的比较观察
目的 比较、观察7种抗疟药抑制疟色素(hemozoin)的形成,与其体外和体内抗血吸虫的作用. 方法 抑制疟色素形成是通过观察25 μmol/L磷酸氯喹、盐酸奎宁、奎尼丁、盐酸甲氟喹、磷酸咯萘啶和苯芴醇,以及100μmol/L蒿甲醚在pH 4.0～5.0的乙酸钠-高铁血红素(hematin)溶液中对β-hematin形成的抑制作用.用含10％小牛血清的RPMI1640培养基培养日本血吸虫成虫＝9、测定上述7种抗疟药的半数和95％致死浓度(LC50和LC95).观察奎宁、氯喹和咯萘啶伍用氯化血红素对体外培养血吸虫的致死作用,以及7种抗疟药口服或腹腔注射对感染日本血吸虫成虫小鼠的疗效. 结果 25 μmol/L咯萘啶对pH 4.4～5.0的乙酸钠溶液中的hematin具有明显抑制β-hematin形成的作用,抑制率为81.3％～97.0％.在pH为4.6的乙酸钠-hematin溶液中,25 μmol/L甲氟喹、氯喹或奎宁对β-hematin形成的抑制率分别为79.7％、72.8％和65.8％；在pH为4.8～5.0的乙酸钠-hematin溶液中,上述3种药物明显抑制β-hematin的形成,抑制率分别为83.1％～90.6％、41.9％～49.0％和53.2％ ～62.0％.25 μmol/L本芴醇在pH为4.6、4.8和5.0的乙酸钠-hematin溶液中分别有74.3％和40.4％～40.5％的β-hematin形成抑制率.在相同浓度下,奎尼丁在pH为4.8和5.0的乙酸钠-hematin溶液中对β-hematin形成的抑制率分别为53.4％和50.9％,而100 μmol/L蒿甲醚对pH 4.4～4.8的乙酸钠-hematin溶液中的β-hematin形成仅有轻度抑制作用,抑制率为16.6％～25.0％.甲氟喹、咯萘啶、奎宁和奎尼丁对体外培养血吸虫的LC50和LC95分别为4.93和6.123 μg/ml,37.278和75.703 μg/ml,93.688和134.578 μg/ml,101.534和129.957μg/ml;而血吸虫在含100或120μg/ml氯喹、本芴醇和蒿甲醚的培养液中培养3d,无或仅少数虫体死亡.用对血吸虫无效的奎宁50 μmol/L(20 μg/ml)和氯喹50 μmol/L(26 μg/ml)与氯化血红素153.4 μmol/L(100 μg/ml)伍用培养血吸虫,前者在培养的1～3 d内全部虫体死亡,而氯喹与氯化血红素伍用组仅18.8％ (3/16)的虫体死亡.相反,对血吸虫具有杀灭作用的咯萘啶50 μmol/L (46 μg/ml)与氯化血红素153.4 μmol/L (100 μg/ml)伍用示拮抗作用,无虫体死亡.感染血吸虫成虫的小鼠每天口服氯喹、咯萘啶和本芴醇400 mg/kg,连服3d,或前两者每天腹腔注射100 mg/kg,连续2～3 d,均无效.顿服蒿甲醚、奎宁和奎尼丁400 mg/kg或甲氟喹200 mg/kg均有明显疗效,减虫率为61.1％～98.1％. 结论 7种抗疟药抑制疟色素形成的作用与体外和体内抗血吸虫作用无明确的相关性.奎宁与氯化血红素伍用可明显增强其体外抗血吸虫的作用,而咯萘啶与氯化血红素伍用则示拮抗作用.
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日本血吸虫虫卵SjE16、SjPPIase和SjRobl基因的真核表达及其在诊断中的应用
目的 真核表达日本血吸虫虫卵蛋白,并评价其在血吸虫病免疫学诊断中的作用. 方法 提取日本血吸虫虫卵RNA,逆转录后获得cDNA.PCR扩增日本血吸虫虫卵特异性或高表达基因SJCHGC01695(SjE16)、SJCHGC00856 (SjIMA8)、SJCHGC06249(SjTOR)、SJCHGC06324 (SjP40)、SJEFTD02(SjSLP)、SJCHGC06679(SjPPIase)和SJCHGC06529 (SjRobl),亚克隆至真核表达载体pPIC9K.重组质粒电转至毕赤酵母GS115菌株后,甲醇诱导目的蛋白表达.镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化获取重组蛋白后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对其进行分析鉴定.以血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)、重组蛋白SjE16、SjPPIase和SjRobl单用,3个重组蛋白两两伍用,及全部伍用作为包被抗原,ELISA法检测血吸虫感染小鼠血清、急性血吸虫病和慢性血吸虫病患者血清中相应抗体的反应性. 结果 PCR扩增获得7个日本血吸虫虫卵高表达基因,经酵母重组表达和Ni-NTA亲和层析纯化后成功获得3个重组蛋白SjE16、SjPPIase和SjRobl.SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果显示,所获得的重组蛋白为目的蛋白.ELISA检测结果显示,血吸虫感染小鼠血清和血吸虫病患者血清中均可检测出被SjE16、SjPPIase和SjRobl识别的特异性IgM和IgG抗体.在急性血吸虫病患者中上述3种抗原IgM的检出率分别为80％、60％和80％,IgG检出率分别为40％、80％和70％.伍用组中,SjE16和SjRobl伍用抗原,检测急性血吸虫病患者血清中IgM抗体的敏感性为100％,高于其单独为抗原的敏感性. 结论 获得的3个日本血吸虫虫卵蛋白(SjE16、SjPPIase和SjRobl)均具有血吸虫病诊断的潜能,其中SjE16和SjRobl伍用抗原可提高急性血吸虫病诊断敏感性.
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甲氟喹对感染小鼠日本血吸虫虫卵肉芽肿形成影响的初步观察
目的 探讨甲氟喹对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响.方法 28只雌性昆明小鼠每鼠感染日本血吸虫尾蚴20条,其中17只小鼠于感染后35 d,用甲氟喹单剂200 mg/kg口服治疗,治疗后3、7、14、21、28和35 d(感染后38、42、49、56、63和70 d),各剖杀2～3只鼠,取肝脏,10％甲醛固定;余11鼠分别于上述时间同时剖杀1～2只,取其肝脏为治疗组的相应对照组.计数各组小鼠肝脏中单个中心含有成熟虫卵的肉芽肿,接目测微计测定其直径,并计算各组肉芽肿平均直径.肝脏切片用苏木素-伊红(HE)、Foot法和Mallory法染色,分别观察虫卵肉芽肿的病理变化、网状纤维和胶原纤维情况.结果 感染小鼠口服甲氟喹后3、7、14、21、28和35 d,肝脏单个虫卵肉芽肿平均直径分别为(161±19)、(175±13)、(195±9)、(171±40)、(180±13)和(145±25)μm,均小于各相应对照组[(189±18)、(197±11)、(211±12)、(208±19)、(203±16)和(207±36) μm] (P＜0.01或P＜0.05).HE染色结果显示,感染小鼠经甲氟喹治疗后,虫卵周围聚集以嗜酸粒细胞为主的炎细胞,可延续至治疗后14～21 d(感染后49～56 d),而对照组的虫卵肉芽肿在感染后42 d已成为纤维性的虫卵肉芽肿;治疗后28～35 d(感染后63～70 d),虫卵肉芽肿均为纤维性,但其边缘较相应对照组的规整.Foot法和Mallory法染色观察可见,经甲氟喹治疗后的14d内,网状纤维和胶原纤维在虫卵肉芽肿中出现的时间均迟于相应对照组的,纤维量亦明显少于相应对照组;治疗后21 d(感染后56d),部分虫卵肉芽肿的2种纤维增生情况与相应对照组的无明显差别;但治疗后28～35 d(感染后63～70d),则鲜见此2种纤维进一步增多和向外延伸.相应对照组的2种纤维则因持续增长而粗密,且向肉芽肿边缘伸展与邻近肉芽肿的纤维相互连接,并分隔肝组织形成网格化.结论 甲氟喹对日本血吸虫虫卵肉芽肿的形成具有抑制作用.
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日本血吸虫脱尾童虫表膜结合短肽的筛选与鉴定
目的 筛选噬菌体十二肽库中与日本血吸虫(Schistosomajaponicum)脱尾童虫表膜特异性结合而不与尾蚴表膜结合的短肽并鉴定. 方法 利用M13噬菌体十二肽库,经体外逆向差异筛选日本血吸虫尾蚴和脱尾活童虫,从第3轮回收的结合噬菌体中随机挑取15个克隆进行测序.获取目标噬菌体后,采用ELISA法、洗脱回收率实验(以M13KE为阴性对照)和免疫组织化学法检测日本血吸虫脱尾童虫、尾蚴与噬菌斑克隆的特异性结合.荧光显微镜观察人工合成的阳性噬菌体短肽与日本血吸虫脱尾童虫体外的特异性结合.构建目的片段pEGFP-C2质粒体外转染日本血吸虫脱尾童虫. 结果 经3轮逆向差异筛选后,噬菌体回收率从第1轮的3.50×105％到第3轮的3.20×10-2％,富集度明显提高.DNA测序结果表明,15个噬菌体克隆分别含有ZL6、ZL4和ZL1等3个不同的短肽序列.ELISA结果显示,M13噬菌体短肽ZL4 (MppZL4)、MppZL6和MppZL1分别与脱尾童虫膜蛋白结合后的P/N值为6.72,3.65和2.22,分别与尾蚴膜蛋白结合后的P/N值为1.58,5.15和1.20.洗脱同收率实验结果显示,MppZL4与脱尾童虫洗脱回收率[(4.60±0.27)×10-2％]远高于MppZL6 [(2.10±0.23) ×10-3％]、MppZL1[(1.20±0.28) ×10-3％]和M13KE[(1.30±0.60)×10-7％) (P＜0.01).免疫组化结果显示,日本血吸虫脱尾童虫与MppZL4特异性结合,阳性率为83.0％ (83/100).荧光显微镜检测结果显示,人工合成的RhB-ZL4可与日本血吸虫脱尾童虫体外特异性结合.构建的ZL4/pEGFP-C2质粒体外可成功转染日本血吸虫脱尾童虫. 结论 筛选获得的短肽ZL4能与日本血吸虫童虫表膜特异性结合,不与尾蚴表膜结合.
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金诺芬抗日本血吸虫活性机制及其细胞毒性的探讨
目的 探讨金诺芬对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)童虫和成虫作用效果的差异及其作用靶点,测定金诺芬对宿主细胞的毒性.方法 用二硫苏糖醇(DTT)/胰岛索还原法体外测定金诺芬对重组SjTrx-1酶活性的影响.用日本血吸虫尾蚴感染4～6周龄雌性昆明鼠(童虫组10只小鼠,600～800条/只；成虫组10只小鼠,80～100条/只),灌注法收集童虫(15d)和成虫(35 d).虫体经无菌生理盐水充分洗涤后,转移至预先添加培养基的12孔板中,分别加入金诺芬和吡喹酮至其终浓度为1、5和10 μg/ml,显微镜下观察化合物处理2、24、48和72 h后虫体的形态改变和死亡情况.CCK-8试剂盒测定金诺芬(5和10 μg/ml)对3种人源宿主细胞(Hep G2、293T和Hela)的毒性. 结果 10 μg/ml金诺芬作用下,40 min内重组SjTrx-1还原胰岛素的总量减少54.5％.5μg/ml金诺芬体外作用24 h后,成虫死亡率达75％,而童虫未见死亡；10 μg/ml金诺芬作用72 h后,童虫和成虫均全部死亡,但童虫死亡时间较成虫延迟.金诺芬和吡喹酮作用后,光镜下观察,虫体均出现颜色变灰暗、挛缩和卷曲等现象;电镜下可见虫体表被膜结构严重破坏.细胞毒性测试结果显示,5 μg/ml金诺芬可使细胞相对活力降低85％以上,而10 μg/ml时细胞几乎全部死亡.结论 SjTrx-1是金诺芬作用靶点之一.金诺芬具有较强的细胞毒性作用,对日本血吸虫成虫和童虫的作用效果存在差异,对成虫的作用效果更显著.
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日本血吸虫硫氧还蛋白-1的克隆、表达和功能分析
目的 克隆、表达日本血吸虫硫氧还蛋白-1(SjTrx-1)编码基因,测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性,分析SjTrx-1基因在血吸虫不同发育阶段的转录本差异,观察其在日本血吸虫成虫体内的组织分布情况. 方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑选SjTrx-1的基因序列,应用PCR技术对目的片段进行体外扩增,并克隆人原核表达载体pET28a,重组质粒转化E.coli BL21 (DE3)细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,二硫苏糖醇(DTT)/胰岛素还原法测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性.纯化的重组SjTrx-1蛋白免疫新西兰白兔,以制备的免疫兔血清作为抗体,应用免疫荧光定位技术检测SjTrx-1在日本血吸虫成虫体内的分布情况.制备日本血吸虫各虫期的总RNA样品,利用RT-PCR方法扩增目的片段,分析SjTrx-1基因在各发育阶段的转录本丰度. 结果 构建了重组表达载体SjTrx-1/pET28a,在E coli中实现了重组SjTrx-1蛋白的可溶表达,其相对分子质量(Mr)约为38000,与预测的融合蛋白大小相符.经组氨酸标签亲和层析法获得纯化重组蛋白SjTrx-1,并测定了其体外的酶催化活性.虫期转录特异性分析显示,该基因在各个虫期均存在转录,其中胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高,毛蚴和尾蚴中含量相对较低.荧光定位结果显示,SjTrx-1蛋白在虫体内分布广泛,且无组织特异性. 结论 SjTrx-1在日本血吸虫虫体内分布广泛,在胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高.
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日本血吸虫糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白的鉴定
目的 鉴定日本血吸虫的糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-AP). 方法 根据曼氏血吸虫的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白Sm200的编码基因(GenBank登录号为XM 002569560.1),运用生物信息学方法寻找日本血吸虫的同源基因,分析后选取基因蛋白质编码区(CDS)的部分基因序列(SjGPIs,长约933 bp)进行PCR扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli) BL21 (DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用镍柱Ni-NTA亲和层析纯化重组肽段SjGPIs.用纯化的重组肽段SjGPIs免疫新西兰大耳兔,以制备的重组肽段抗血清检测日本血吸虫GPI锚定蛋白.用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)鉴定检测到的蛋白在日本血吸虫虫体上的锚定方式.检测日本血吸虫感染小鼠的白细胞,确定其是否吞噬GPI锚定蛋白. 结果 日本血吸虫的基因组中存在与曼氏血吸虫GPI锚定蛋白Sm200基因的同源基因序列,经比对拼接后获得3495 bp含完整编码蛋白C末端的基因编码序列.以所选基因序列进行肽段原核表达,获得重组质粒pET-28a(+)-SjGPIs.通过对蛋白C末端序列分析、经蛋白质印迹(Western blotting)分析和PI-PLC酶切验证,发现日本血吸虫被膜存在以GPI形式锚定的蛋白,相对分子质量约为Mr 200000,命名为SjGPI200.感染日本血吸虫小鼠的白细胞中可检测到完整的SjGPI200蛋白. 结论 日本血吸虫存在锚定蛋白SjGPI200,并以GPI形式锚定于虫体被膜上.
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日本血吸虫感染小鼠肠系膜淋巴结Th17细胞的免疫应答
目的 观察C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后肠系膜淋巴结Th17细胞的免疫应答.方法 20只C57BL/6小鼠随机分为感染组和对照组,每组10只,感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴,每鼠(40±5)条.感染后5～6周分离小鼠肠系膜淋巴结的淋巴细胞,分别用抗小鼠CD3单克隆抗体(anti-CD3,1μg/ml)和抗小鼠CD28单克隆抗体(anti-CD28,1μg/ml)刺激,培养4h后收集细胞,RT-PCR检测小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞中白细胞介素17 (IL-17)和维甲酸相关孤独受体(ROR-γt) mRNA的转录水平；培养72 h后,ELISA检测细胞培养上清液IL-17和γ干扰素(IFN-γ)的含量.同时用佛波酯(PMA,10 ng/ml)和离子霉素(1μg/ml)刺激淋巴细胞5h后,胞内细胞因子染色,流式细胞术检测Th17细胞的含量和其他细胞因子的产生.结果 ELISA检测结果显示,感染小鼠肠系膜淋巴结培养物上清液中IFN-γ [(214.3±62.6) pg/ml]和IL-17[(176.8±62.1) pg/ml]的含量明显高于健康小鼠[(46.7±13.9)和0pg/ml] (P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,IL-17和ROR-γt mRNA转录水平也明显高于健康小鼠.感染小鼠肠系膜淋巴细胞CD4+T细胞中,Th17细胞的比例为(0.55±0.03)％,明显高于健康小鼠[(0.16±0.01)％] (P＜0.05).在CD4+T细胞中,IL-17+ IL-4+细胞占0.06％,IL-17+ IFN-γ+和IL-17+ IL-5+细胞各占0.02％,IL-17+ IL-9+细胞占0.01％,未检测到IL-17+ IL-10+和IL-17+Foxp3+细胞.结论 日本血吸虫感染C57BL/6小鼠的肠系膜淋巴结能诱导Th17细胞产生.Th17细胞能分泌IL-4,及少量的IFN-γ、IL-5和IL-9,不分泌IL-10,也不表达Foxp3.
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日本血吸虫含EF-手型结构域钙结合蛋白的克隆表达与免疫诊断分析
目的 克隆和表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)含EF-手型(EF-hand)结构域钙结合蛋白(SjEFCAB)的编码基因,纯化表达产物,鉴定重组蛋白的反应原性,初步评价其用于日本血吸虫病诊断的价值.方法 以日本血吸虫虫卵cDNA文库中免疫筛选所获阳性克隆删除环化后的pBluescript-SjEFCAB质粒为模板,扩增SjEFCAB基因,将目的基因片段与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签亲和层析法纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其反应原性.以SjEFCAB为包被抗原,采用间接ELISA方法检测日本血吸虫病(78份)、华支睾吸虫病(5份)、猪囊尾蚴病(10份)、卫氏并殖吸虫病(6份)和旋毛虫病(9份)患者血清,以及健康人血清(50份),评价该重组蛋白的免疫学诊断效果.结果 构建了重组质粒pGEX-4T- I-SjEFCAB,并在Ecoli BL21中高效表达,经亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白SjEFCAB.Western blotting分析结果显示,重组蛋白SjEFCAB能被感染兔血清和血吸虫病患者血清所识别,在相对分子质量(Mr)约为8 200处出现条带.间接ELISA检测日本血吸虫病患者血清的敏感性为82.1％(64/78),特异性为95.0％( 76/80).与华支睾吸虫病患者、猪囊尾蚴病患者和旋毛虫病患者血清的交叉反应分别为1/5、1/10和1/9,与卫氏并殖吸虫病患者血清无交叉反应(0/6).结论 日本血吸虫SjEFCAB重组抗原具有较高的免疫学诊断价值.
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日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫筛选和阳性克隆的鉴定
目的 寻找可用于日本血吸虫病诊断或疗效考核的抗原分子.方法 在安徽省安庆市某现场,采集经粪检(Kato-Katz法,2送6检)日本血吸虫卵阳性的10份患者血样,患者年龄13～64岁,EPG为4～172;并收集该10例患者经吡喹酮(60mg/kg×2d)治疗6个月后的血样,将吡喹酮治疗前和治疗后的血清各10份分别混合,分别筛选虫卵eDNA文库,将所获阳性克隆分类,测定阳性克隆插入片段的DNA序列,经BLAST程序分析同源性,并利用在线的生物信息学软件预测阳性克隆基因编码蛋白的结构和功能.结果 初次筛选共获得75个阳性克隆,其中46个阳性克隆吡喹酮治疗前和治疗后的日本血吸虫病患者血清反应一致(为Ⅰ类),21个阳性克隆吡喹酮治疗前的血清强于治疗后的(为Ⅱ类)；8个阳性克隆吡喹酮治疗后的血清强于治疗前的(为Ⅲ类).结合反应强度、分类和插入片段的大小选择了14个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,多数阳性克隆插入片段均属于虫卵毛蚴抗原家族,1个阳性克隆的插入片段与含EF-hand结构域的钙结合蛋白具有一定的同源性(分值=143),1个阳性克隆的插入片段与应激反应组分1前体具有较高的同源性(分值=487),其余阳性克隆的插入片段仅与假定蛋白有一定的同源性,蛋白功能无明确注释.结论 用吡喹酮治疗前后的日本血吸虫病患者血清筛选虫卵cDNA文库,获得的29个阳性克隆在吡喹酮治疗前后有差异.
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间质干细胞培养上清对日本血吸虫SEA诱导活化的巨噬细胞株RAW264.7的抑制作用
目的 观察大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)培养上清对日本血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)诱导活化的巨噬细胞的抑制作用.方法 用5、10、20和40 μg/ml SEA分别诱导巨噬细胞株RAW264.7 12 h,或用20 μg/ml SEA分别诱导小鼠巨噬细胞株(RAW264.7)4、8、12和24h后,用实时荧光定量PCR检测α肿瘤坏死因子(TNF-α)的mRNA水平,选择SEA的佳作用浓度和作用时间.将巨噬细胞分成5组,分别为阴性对照组、SEA组、SEA+MSC上清组(MSC组)、SEA+大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)上清组(NRK-52E组)和SEA+DMEM细胞培养基组(DMEM组).除阴性对照组外,其他各组给予20 μg/ml SEA诱导巨噬细胞活化12h后,MSC组、NRK-52E组和DMEM组换液撤SEA,分别给予MSC培养上清、NRK-52E细胞培养上清和DMEM培养液,继续培养.显微镜观察细胞上清培养12h后各组细胞形态.实时荧光定量PCR检测细胞上清培养12h和24h后TNF-αmRNA水平.蛋白质印迹(Western blotting)分析检测细胞上清培养12h后转化生长因子β1(TGF-β1)的蛋白表达水平.噻唑蓝比色法(MTT法)测定细胞上清培养24h和48 h后巨噬细胞增殖情况.结果 SEA活化巨噬细胞的佳浓度和时间分别为20 μg/ml和12h.镜下观察显示,MSC上清培养12h后,MSC组与SEA组、NRK-52E组和DMEM组相比,细胞变圆,体积明显较小,伪足较少.MSC上清作用12h和24h后,MSC组TNF-α mRNA水平分别为阴性对照组的(1.0±0.4)和(1.0±0.5)倍,显著低于NRK-52E组[分别为(10.4±3.9)和(16.5±5.0)倍(12h:P＜0.05; 24h:P＜0.01)]和DMEM组[分别为(6.0±2.1)和(2.4±0.7)倍(均P＜0.05)].MSC上清作用12h后,MSC组蛋白TGF-β1/GAPDH为0.3 1±0.10,显著低于NRK-52E组(0.88 ±0.10,P＜0.01)和DMEM组(0.58±0.06,P＜0.05).MSC上清作用48 h后,MSC组吸光度(A490值)为0.22±0.05,与NRK-52E组(0.53±0.02)和DMEM组(0.31±0.03)比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 MSC培养上清能抑制SEA诱导的巨噬细胞株RAW264.7活化.
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日本血吸虫感染适宜与非适宜宿主的免疫学特征初步研究
研究3种不同易感性宿主感染日本血吸虫后免疫应答特征的差异,初步探讨适宜和非适宜鼠类宿主感染血吸虫后免疫应答的机制.方法 C57BL/6小鼠、Sprague Dawley(SD)大鼠和东方田鼠(Microtus fortis)各12只,均随机分为感染组和未感染组,每组6只.C57BL/6小鼠、SD大鼠和东方田鼠的感染组每鼠经腹部皮肤分别感染日本血吸虫尾蚴20、200和1 000条.感染后42d,剖杀各组动物,观察门脉系统成虫寄生及肝脏肉芽肿情况.收集血清,ELISA法检测细胞因子白细胞介素10(IL-10)、γ干扰素(IFN-γ)和血清特异性抗体IgG、IgG2a及IgG1的水平.结果 感染日本血吸虫后42d,C57BL/6小鼠和SD大鼠均检获日本血吸虫成虫,并在宿主肝脏发现虫卵肉芽肿,而东方田鼠未检获血吸虫成虫及虫卵,肝脏正常.SD大鼠血清中IL-10的含量[(2.21±0.12) pg/ml]明显高于东方田鼠[(1.64±0.39) pg/ml](P＜0.05)和C57BL/6小鼠[(0.10±0.04) pg/ml)](P＜0.01),而东方田鼠也显著高于C57BL/6小鼠(P＜0.01);SD大鼠血清中IFN-γ的含量[(0.21±0.11) pg/ml]均高于东方田鼠[(0.11±0.03)pg/ml]和C57BL/6小鼠[(0.09±0.02) pg/ml](P＜0.05),而C57BL/6小鼠与东方田鼠组间差异无统计学意义(P＞0.05);SD大鼠IgG(1.53±0.31)、IgG1(1.48±0.44)、IgG2a(0.41±0.11)水平均显著高于东方田鼠各抗体亚类水平(0.48±0.14、0.15±0.03和0.12±0.06) (P＜0.01),C57BL/6小鼠IgG(1.21±0.16)和IgG1(0.88±0.31)水平也显著高于东方田鼠(P＜0.01),3种鼠血清抗体亚类均以IgG1占优势.未感染组C57BL/6小鼠、SD大鼠及东方田鼠均未检测出IL-10、IFN-γ及抗体亚类IgG、IgG1、IgG2a的表达.结论 与Th2型免疫应答主要相关的细胞因子IL-10在血吸虫非适宜宿主体内水平显著高于适宜宿主,可能在抗血吸虫机制中发挥重要作用.
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日本血吸虫P7抗原的克隆表达、虫期特异性分析以及早期诊断价值的研究
目的 克隆表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum) P7抗原片段(GenBank登录号为EU121231),研究各虫期中该目的 片段的转录和表达情况,初步评价其作为早期诊断抗原的潜力.方法 将日本血吸虫童虫cDNA文库中免疫筛选出的阳性克隆P7进行体外扩增,将目的 基因亚克隆至原核表达载体pET28a中.用双酶切的方法鉴定重组质粒,将阳性重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化.用蛋白质印迹(Western blotting)分析初步鉴定表达产物的免疫诊断价值.利用逆转录PCR和Western blotting分析检测P7片段在日本血吸虫各个虫期中的转录和表达情况.以P7重组蛋白为抗原用间接ELISA检测感染日本血吸虫后14 d的兔血清(18份),日本血吸虫病(28份)、华支睾吸虫病(30份)和卫氏并殖吸虫病(20份)患者血清,以及健康人血清(30份),计算特异性和敏感性.结果 成功构建了重组表达载体P7/pET28a,并在E.coli中表达.Western blotting分析结果显示P7重组蛋白能被感染日本血吸虫后14 d的小鼠血清和P7重组蛋白免疫的多抗兔血清识别,但不能被感染后42 d的小鼠血清识别,蛋白相对分子质量(Mr)约为20 100.采用逆转录PCR技术在尾蚴、童虫和成虫中均检测到了P7片段的mRNA.Western blotting分析结果显示,仅在童虫阶段检测到目的 蛋白.间接ELISA检测感染早期兔血清的检出率为83.3%(15/18),检测日本血吸虫病患者血清的敏感性为75.0%(21/28),特异性为93.8%(75/80),与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清的交叉反应分别为6.7%(2/30)和5.0%(1/20).结论 日本血吸虫P7抗原可能为潜在的日本血吸虫病早期诊断的靶分子.
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日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆、表达及虫期表达差异分析
目的 克隆和表达日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因1 (SjAPRT1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的转录和蛋白表达情况.方法 根据SjAPRT1基因序列(GenBank登录号为AAW24796)设计引物,RT-PCR扩增目的 基因,分析其在日本血吸虫各发育阶段转录本差异.将目的 基因亚克隆至载体pET28a(+),转化至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化结果.纯化的蛋白SjAPRT1免疫新西兰白兔制备免疫兔血清,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫反应性及其在日本血吸虫不同发育阶段表达的差异.结果 在虫卵、尾蚴、童虫和成虫期均检测到SjAPRT1转录本(561 bp),获得了重组SjAPRT1蛋白.Western blotting分析表明,纯化的重组蛋白SjAPRT1可被日本血吸虫感染兔血清识别,虫卵、童虫和成虫粗抗原可被SjAPRT1免疫兔血清识别,在Mr 25 000处有特异性条带.结论 日本血吸虫SjAPRT1蛋白在虫卵、童虫和成虫各期均有表达,并具有一定的免疫反应性.
关键词： 日本血吸虫 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 免疫反应性 -
衰老下调小鼠对日本血吸虫感染的免疫应答
目的 研究衰老对小鼠感染日本血吸虫后免疫应答的影响.方法 幼龄(2月龄)和老龄(18月龄)雌性BALB/c小鼠各8只,每鼠感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条.感染后6周剖杀小鼠,经门静脉灌注收集成虫,计数虫荷;KOH消化法收集肝脏中的虫卵,并计数.制作肝脏连续病理切片,测量两组小鼠肝脏增生期平均单卵肉芽肿的大小,计算单卵肉芽肿体积.常规法制备脾淋巴细胞悬液进行T淋巴细胞增殖实验,计算刺激指数(SI).ELISA法检测脾淋巴细胞中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的表达水平.结果 幼龄组小鼠体内的虫荷和每克肝组织虫卵数分别为26.00±2.42和(2.08±0.87)×104,老龄组虫荷和每克肝脏虫卵数分别为19.75±1.95和(1.59±1.05)×104,两组间的差异有统计学意义(P＜0.05).幼龄组肝脏单卵肉芽肿平均体积[(47.02±24.13)×10-3 mm3]明显大于老龄组[(30.13±10.97)×10-3 mm3](P＜0.05).T淋巴细胞增殖实验结果 显示,老龄组脾淋巴细胞对ConA的增殖反应(SI:1.08±0.12)低于幼龄组(SI:1.31±0.14),其脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的含量[(24.05±6.24)、(4.15±0.68) pg/ml]也明显低于幼龄组[(34.25±8.69)、(7.25±0.83) pg/ml] (P＜0.05).结论 衰老引起小鼠对日本血吸虫感染的免疫应答下降,从而减轻了日本血吸虫感染引起的免疫病理损害.
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日本血吸虫Mago nashi蛋白编码基因功能的研究
目的 研究日本血吸虫Mago nashi蛋白编码基因在虫体生殖器官发育方面的功能.方法 体外PCR法合成Mago nashi双链RNA(dsRNA),将SjMago nashi基因dsRNA产物和阴性对照lacZ基因dsRNA产物分别电击转染至机械脱尾的日本血吸虫童虫体内,将部分电击转染的童虫作体外培养,在培养后第1、3和5天以TRIzol法同时提取其总RNA和总蛋白.实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测Mago nashi基因和蛋白表达产物.电击转染的童虫注射入6只BALB/c小鼠体内,每鼠约1 000条,6周后取出虫体,盐酸卡红染色,在激光共聚焦显微镜下观察虫体内部各器官形态特征,测量虫体相关指标.结果 在电击转染后的第1、3和5天,SjMago nashi dsRNA组目的 基因的转录水平较阴性对照组分别下降了22%、69%和80%,蛋白质水平较阴性对照组分别下降了12%、39%和56%.激光共聚焦显微镜观察发现,SjMago nashi dsRNA组中的雄虫睾丸内有较多精子,呈泛雄性化表现,而雌虫的卵巢和卵黄腺无明显特征变化.与阴性对照组相比,SjMago nashi dsRNA组的雄虫的体宽、睾丸长和睾丸宽,雌虫的体宽、卵巢长和卵巢宽均明显缩小(P＜0.05).结论 SjMago nashi dsRNA可特异性抑制日本血吸虫靶基因及其编码蛋白的表达,SjMago nashi基因为日本血吸虫生殖相关基因,在生殖系统器官的正常发育中起一定作用.
关键词： 日本血吸虫 生殖 双链RNA RNA干扰 Mago nashi基因
