首页 > 文献资料
-
四种刺激剂对日本血吸虫感染小鼠脾脏CD8+T细胞内细胞因子及表面分子CD62L的影响
目的 探讨4种常用刺激剂佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,P)、离子霉素(ionomycin,I)、布雷非德菌素A (brefeldin A,B)和莫能霉素(monensin,M)对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)感染小鼠脾脏CD8+T细胞内细胞因子及表面分子CD62L的影响.方法 21只C57BL/6雌性小鼠腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴, (20±2)条/鼠.感染后第8周和第12周,分别取小鼠脾脏制备单细胞悬液,用P(50ng/ml) +I(1μmol/L)+M(2μmol/L)体外刺激4h,采用流式细胞术检测分泌γ干扰素(IFN-γ)的CD8+T细胞比例,同时检测细胞表面CD62L的表达情况.制备感染后4周的小鼠脾脏单细胞悬液,按I组(1μmol/L)、P组(50 ng/ml)、B组(1 μg/ml)、M组(2μmol/L)、P+I组、P+I+M组、P+I+B组、P+I+M+B组分组,用对应刺激剂体外刺激4h后,利用细胞因子微球检测法检测各组培养上清中白细胞介素4(IL-4)、IL-17A、IFN-γ、IL-10、IL-1β和集落刺激因子(G-CSF)等细胞因子水平,同时用流式细胞术检测CD8+T细胞表面CD62L的表达情况,计算平均荧光强度(MFI).结果 流式细胞术检测结果显示,小鼠感染日本血吸虫后第8周和第12周,产生IFN-γ的CD8+T细胞比例分别降至(1.3±0.8)％和(0.7±0.2)％,均低于未感染对照组的(5.6±0.8)％(P＜0.05),但两者差异无统计学意义(P＞0.05).健康对照组和感染组小鼠CD8+T细胞表面均未检测到CD62L阳性群.不同组合刺激剂作用感染后4周,小鼠脾脏细胞培养上清细胞因子的检测结果显示,P+I组和P+I+M组的IL-4水平分别为(177.2±56.0)和(13.7±2.2) pg/ml;P+I组和P+I+M组的IL-17A浓度分别为(361.8±81.3)和(33.7±2.9) pg/ml;P+I组和P+I+M组上清中的IFN-γ浓度分别为(1 534.0±316.6)和(135.3±16.1) pg/ml;P+I组、P组和I组上清中IL-10的浓度分别为(705.5±179.6)、(34.8±13.9)和(43.1±13.9) pg/ml;P组和P+I组中G-CSF的浓度为(44.6±8.0)和(21.7±2.9) pg/ml;P组、I组和P+I+M组中IL-1β的浓度分别为(3.9±1.0)、(6.4±0.2)和(3.7±0.3) pg/nl;上述各组与其对应的对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).流式细胞术检测结果显示,P+I组、P+I+B组、P+I+M组和P+I+B+M组中CD62L峰较对照组明显左移,MFI分别为2.7±0.1、2.6±0.2、2.5±0.1、2.5±0.1,低于对照组(P＜0.01).结论 日本血吸虫感染晚期,小鼠脾脏细胞产生IFN-γ的CD8+T细胞比例减少,经P+I刺激后,CD62L表达明显下调.
-
环介导等温扩增法检测粪样中日本血吸虫虫卵DNA的效果评估
目的 评估环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)法检测粪样中日本血吸虫(Schistosoma japonicum)虫卵DNA的效果,并评价其检测流行区现场牛野外粪样的效果.方法 取1g新鲜的日本血吸虫虫卵阴性牛粪,分别加入5个新鲜日本血吸虫虫卵、50 μ1日本血吸虫虫卵排泄分泌产物(eggsecretion product,ESP)制备人工模拟阳性粪样.用粪DNA提取试剂盒分别提取加入虫卵的未经研磨或研磨2 min后的人工模拟阳性粪样、加入虫卵ESP的粪样和阴性粪样的DNA,以日本血吸虫28S核糖体DNA (rDNA)为检测靶基因,用LAMP法、PCR法检测,评估LAMP法检测粪样中日本血吸虫虫卵DNA的效果.收集2012-2014年湖南、湖北、江西、安徽等4省日本血吸虫病流行区的牛野外粪样221份,研磨后同法提取DNA,用LAMP法检测,并与PCR法、孵化法的检测结果进行比较,评价其检测流行区现场野外粪样的效果.结果 LAMP法检测加入虫卵粪样并经研磨后提取的DNA、加入虫卵ESP粪样提取的DNA均为阳性反应,呈绿色;而加入虫卵粪样未经研磨提取的DNA、阴性粪样DNA则为阴性反应,呈棕色;PCR检测的结果与LAMP法检测结果相近.LAMP法、PCR法和孵化法检测血吸虫病流行区牛野外粪样的阳性率分别为5.43％(12/221)、4.52％(10/221)、0.90％ (2/221).LAMP法的阳性率明显高于孵化法(P＜0.05),LAMP法与PCR法阳性率差异无统计学意义 (P＞ 0.05).结论 LAMP法可用于检测流行区现场野外粪样的日本血吸虫虫卵DNA,其现场应用价值有待进一步验证.
-
可溶性虫卵抗原和成虫抗原刺激日本血吸虫感染小鼠肠系膜淋巴结Th17细胞的免疫应答
目的 研究可溶性虫卵抗原(SEA)和可溶性成虫抗原(SWA)刺激日本血吸虫(Sc histosoma japonicum)感染小鼠肠系膜淋巴结(MLN) Th17细胞的免疫应答. 方法 新西兰大白兔2只,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(约1 000条/兔),45 d后收集成虫及虫卵,制备SWA和SEA.20只C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为感染组和健康组(10只/组),感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴, (40±5)条/鼠,感染后5～6周ELISA检测血清中SEA和SWA特异性IgG抗体.分离两组小鼠MLN中的淋巴细胞,均给予4种不同条件刺激:无刺激组(A组),SEA(100 μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml) (B组),SWA(100 μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml) (C组),抗-CD3 mAb(1μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml) (D组).培养9h后,流式细胞仪检测Th17细胞;培养72 h后,ELISA检测细胞培养上清中的白细胞介素(IL-17)和γ干扰素(IFN-γ).结果 ELISA检测结果显示,感染组小鼠血清SEA、SWA特异性IgG抗体的吸光度(A450值)分别为2.66±0.20和1.68±0.66,高于健康组的0.19±0.05和0.25±0.12 (P＜ 0.01).流式细胞术检测结果显示,B组刺激后,感染组淋巴细胞中CD4+IL-17+和CD4+IFN-γ+细胞分别占0.43％和0.56％,高于健康组的0.05％和0.20％ (P＜0.05);C组刺激后则分别占0.39％和0.76％,高于健康组的0.04％和0.19％ (P＜0.05).两组小鼠的淋巴细胞体外经SEA (B组)刺激后,感染组淋巴细胞产生的IFN-γ和IL-17分别为(49.13±14.71)和(41.73±2.42) pg/ml,高于健康组的(3.27±0.33)和(9.22±0.58) pg/ml (P＜0.01);经SWA(C组)刺激后则分别为(46.92±16.73)和(36.14±4.82) pg/ml,高于健康组的(3.38±0.34)和(8.78±0.93) pg/ml (P＜ 0.01).B组的IL-17含量高于C组(P＜0.05). 结论 SEA和SWA能体外诱导日本血吸虫感染C57BL/6小鼠肠系膜淋巴结的淋巴细胞分泌IL-17和IFN-γ,SEA刺激淋巴细胞产生IL-17的含量明显高于SWA;SEA和SWA均能诱导淋巴细胞分化为CD4+IL-17+细胞和CD4+IFN-γ+细胞.
-
慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫体内的表达和检测
目的 验证外源绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫(Schistosoma japonicum)体内能否成功表达并产生绿色荧光. 方法 采用荧光显微镜观察日本血吸虫不同虫期虫体的背景荧光情况.利用含有由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的绿色荧光蛋白zsGreen基因的慢病毒载体感染体外培养的14 d童虫,未感染对照组采用不含慢病毒的RPMI 1640培养液(含10％胎牛血清)培养.感染后48 h,提取童虫基因组DNA和总RNA,合成cDNA,PCR检测zsGreen基因是否整合入基因组以及绿色荧光蛋白mRNA的转录表达情况.在感染后24和48 h,以及换为不含慢病毒的RPMI 1640培养液后的不同时间点,使用荧光显微镜观察被感染童虫发出的绿色荧光,并判断其是否为绿色荧光蛋白基因在虫体内表达而产生的绿色荧光信号. 结果 荧光显微镜观察可见,日本血吸虫童虫无明显自发荧光现象,成虫可自发明显荧光.感染组童虫基因组DNA和总cDNA PCR检测结果显示,均扩增出大小为173 bp的阳性条带,与zsGreen基因片段一致,且测序结果正确.荧光显微镜观察可见,而感染组童虫在感染后24h,肠道内出现绿色荧光亮点,但疑似食物残渣.感染后48 h,童虫肠道发出均匀的绿色荧光,其亮度高于慢病毒培养液的背景荧光亮度.更换为不含慢病毒的RPMI 1640培养液3d后,童虫肠道内绿色荧光变弱,一周后绿色荧光消失.重新更换为含慢病毒的RPMI 1640培养液感染童虫,2d后在肠道内再次发现均匀绿色荧光.未感染对照组童虫未出现绿色荧光. 结论 外源绿色荧光蛋白可在日本血吸虫体内表达,但荧光显微镜下观察到的绿色荧光信号还有待进一步确认.
-
日本血吸虫重组抗原rSj26的磁分离酶联免疫分析的建立及其在低感染度血清抗体检测中的应用
目的 建立基于重组日本血吸虫抗原Sj26(rSj26)的磁分离酶联免疫分析(rSj26-MEIA),并将其用于检测低感染度的日本血吸虫病患者的血清抗体. 方法 将重组质粒pET28a-Sj26转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,用0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析法纯化后,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)检测分析rSj26.将纯化后的rSj26与磁珠偶联(100 μg抗原/mg磁珠),优化反应条件,建立rSj26-MEIA方法.用rSj26-MEIA和ELISA分别检测58份低密度感染的日本血吸虫病患者血清、30份非血吸虫病流行区阴性血清和6份并殖吸虫病患者血清,并比较两者的检测结果. 结果 纯化后的重组蛋白含量测定结果显示,rSj26浓度为2.5 mg/ml.SDS-PAGE结果显示,rSj26相对分子质量约27 000,主要以可溶性的形式表达.Western blotting结果显示,rSj26可被感染日本血吸虫的兔血清和小鼠血清特异识别.rSj26-MEIA优化反应条件结果显示,采用rSj26-磁珠0.2 mg(含rSj26 10 μg)、血清稀释度为1∶100时,阳性血清平均吸光度(A550值)/阴性血清平均A550值(P/N)大,为3.97.rSj26-MEIA和rSj26-ELISA检测低密度感染日本血吸虫病患者血清的结果显示,两者的阳性检出率均为24.14％ (14/58),两者P/N分别为3.61和2.56;相关分析结果表明,两者检测的抗体A550值间存在正相关关系(r=0.658,P＜0.01).rSj26-MEIA和ELISA检测6例并殖吸虫病患者血清和30例非血吸虫病流行区阴性血清,均未出现阳性反应. 结论 rSj26-MEIA可作为检测低密度感染日本血吸虫血清抗体的一种新技术.
-
重组病毒rAAV2-MfE77.43转导小鼠对日本血吸虫攻击感染的抵抗作用
目的 探讨东方田鼠(Microtus fortis)骨髓E77.43基因片段(MfE77.43)对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)攻击感染的抵抗作用. 方法 将MfE77.43构建至重组腺相关病毒(AAV2)载体上,磷酸钙共沉淀法转染HEK293细胞,纯化重组病毒rAAV2-MfE77.43后,提取转染后细胞总RNA,RT-PCR检测E77.43基因表达情况,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析rAAV2-MfE77.43纯度.将18只昆明小鼠随机分为3组,每组6只,实验组每鼠于第0、3、7天肌内注射生理盐水稀释5倍的rAAV2-MfE77.43病毒液400μl,阴性对照组和空白对照分别注射等量pAAV空载体和生理盐水.每次注射前取小鼠尾静脉血,斑点ELISA法检测小鼠血浆中E77.43表达情况.末次注射后,用日本血吸虫尾蚴经小鼠腹部贴片进行攻击感染,40条/鼠.感染后第41天,剖杀小鼠,分别收集各组小鼠的肝脏和小鼠体内的血吸虫成虫,计数成虫数和每克肝脏虫卵数(LEPG),计算减虫率和减卵率,HE染色观察肝脏虫卵肉芽肿病理特征. 结果 RT-PCR检测获得约330 bp的目的DNA片段.SDS-PAGE分析结果显示,重组病毒rAAV2-MfE77.43外壳蛋白可见3条特征性蛋白条带,相对分子质量(尬)分别为87 000、72 000、62 000,且杂带较少,病毒纯度较好.斑点ELISA法检测结果显示,小鼠注射rAAV2-MfE77.43后第3天,血浆中E77.43蛋白开始表达,且稳定表达至第41天.实验组小鼠体内日本血吸虫成虫数和LEPG分别为20.16±3.93和19 800±2 715,均低于阴性对照组的29.16±2.44和28 000±2 192 (P＜0.01);实验组的减虫率和减卵率分别为27.3％和26.2％.HE染色可见,实验组小鼠肝脏虫卵周围嗜酸粒细胞和浸润炎性细胞较少,并以单个肉芽肿较为多见. 结论 东方田鼠E77.43基因对血吸虫感染具有一定的预防保护效果,提示E77.43基因可能参与东方田鼠天然抵抗日本血吸虫感染.
-
吡喹酮治疗后日本血吸虫感染小鼠滤泡辅助性T细胞及其表面分子的研究
目的 观察日本血吸虫(Schistosoma japonicum)感染小鼠肝脏、脾脏的病变情况及经吡喹酮治疗后小鼠外周血及脾脏中滤泡辅助性T细胞(Tfh)及其表面分子的变化. 方法 将15只6～8周龄C57BL/6雌性小鼠随机分为吡喹酮治疗感染组(治疗组)、未治疗感染组(未治疗组)和未感染组,每组5只.治疗组和未治疗组每只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴20条;治疗组小鼠于感染后6周给予200 mg/(kg·d)吡喹酮灌胃治疗,连续3d;未感染组和未治疗组不治疗.于治疗后4周解剖各组小鼠,观察小鼠肝脏和脾脏病变情况,计算减虫率和肝脏减卵率.采用流式细胞术检测各组小鼠外周血和脾脏Tfh占CD4+T细胞的比例,检测其表面分子可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)和程序性死亡受体1(PD-1)的表达情况.采用ELISA检测小鼠血清中可溶性虫卵抗原(SEA)特异性IgG抗体水平. 结果 与未治疗组比较,治疗组小鼠的肝脏和脾脏病变明显较轻,减虫率和肝脏减卵率分别为84.1％和69.1％ (P＜0.01).治疗组、未治疗组和未感染组外周血和脾脏Tfh细胞的比例分别是14.7％～18.0％和15.6％～25.0％、13.7％～16.7％和12.4％～18.2％、2.5％～6.8％和4.9％～8.0％,治疗组和未治疗组明显高于未感染组(P＜0.01),治疗组和未治疗组差异无统计学意义(P＞0.05).治疗组、未治疗组和未感染组外周血和脾脏中ICOS的表达水平分别为0.7％～1.1％和1.8％～6.8％、1.3％～3.2％和4.1％～7.0％、0.2％～0.3％和0.5％～0.8％,未治疗组高于治疗组和未感染组(P＜0.01);治疗组脾脏ICOS的表达水平明显高于未感染组(P＜0.01),而外周血的表达水平与未感染组差异无统计学意义(P＞0.05).治疗组、未治疗组和未感染组外周血和脾脏中Tfh细胞PD-1水平分别为0.5％～1.5％和4.5％～8.9％、0.8％～1.9％和4.1％～10.7％、0.4％～0.8％和1.2％～1.8％,未治疗组明显高于未感染组(P＜0.01),治疗组与未治疗组差异无统计学意义(P＞0.05).吡喹酮治疗后4周,治疗组、未治疗组和未感染组的SEA特异性IgG水平(A450值)分别为2.015±0.061、1.969±0.038和0.139±0.128,治疗组与未治疗组差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 吡喹酮治疗后,日本血吸虫感染小鼠肝脏、脾脏组织病变明显减轻,外周血和脾脏Tfh细胞ICOS的表达比未治疗组显著降低.
-
细菌脂多糖诱导小鼠B细胞对日本血吸虫发育的影响
目的：研究细菌脂多糖诱导 BALB/c 小鼠 B 淋巴细胞对日本血吸虫发育的影响。方法取 T 细胞缺陷的BALB/c nude 小鼠18只，以及T/B 细胞联合缺陷的 BALB/c SCID 小鼠23只，每鼠感染日本血吸虫尾蚴（30±1）条。用细菌脂多糖（LPS）腹腔注射诱导（100μg/ml，0.2 ml/只，2周1次，共2～3次） nude 小鼠（NL组，9只）和SCID 小鼠（ SL 组，12只）。同时设置对照组，即以 PBS 处理 nude 小鼠（ N 组，9只）和 SCID 小鼠（S 组，11只）。感染后28 d、36 d，分别解剖 N、 NL、 S 和 SL 各组小鼠（n=4/5，4/5，5/6，6/6），肝门静脉灌注法收集血吸虫成虫，计算成虫检获率，测量体长，记录雌雄合抱数。取肝组织经5% KOH 溶液消化后，计数虫卵，计算每克肝组织虫卵数。摘除眼球取血，检测外周血中转化生长因子（ TGF-β）、γ干扰素（ IFN-γ）和白介素10（ IL-10）水平。取脾组织制备脾细胞悬液，检测脾淋巴细胞中调节性 B 细胞（ regulatory B cells ， Bregs ）所占比例。结果感染后28 d， NL、 N 组雄虫体长分别为（7.66±2.85） mm 和（5.28±1.64） mm （P<0.01），雌虫体长分别为（9.64±1.99） mm 和（7.49±1.63） mm （P<0.01）。感染后36 d， NL 组每克肝组织虫卵数（1088±297）明显高于 N 组（715±404）（P<0.05）， SL 组的（217±33）明显低于 S 组（573±160）（P<0.01）。感染后28 d、36 d， N 组脾淋巴细胞中 CD1dhiCD5+CD19+Bregs 所占比例分别为（12.73±0.96）%和（37.15±3.04）%（P<0.05），与 NL 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。感染后28 d， N、 NL 组血清中 TGF-β水平分别为（101.75±46.72） pg/ml 和（260.90±45.34） pg/ml， IFN-γ水平分别为（7.91±1.62） pg/ml 和（14.11±3.72） pg/ml，两组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。感染后36 d， S、 N 组血清中 IL-10分别为（41.85±3.14） pg/ml、（66.25±4.16） pg/ml， SL、 NL 组分别为（44.48±3.87） pg/ml、（72.22±17.76） pg/ml，两种小鼠比较差异具有统计学意义（P<0.01），但 LPS 处理组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 LPS 可诱导日本血吸虫感染 BALB/c小鼠B 细胞释放TGF-β等细胞因子，促进日本血吸虫雌雄成虫的早期发育。
-
日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究
目的 探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力. 方法 利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(SjCTRL)基因(GenBank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系.采用整体原位杂交法定位SjCTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位.利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的SjCTRL基因转录水平.制备SjCTRL-dsRNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化.设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至pET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli) BL21 (DE3)后进行原核表达.将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验.同时设对照组.感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率. 结果 原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道.SjCTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度.SjCTRL-dsRNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7％ (P＜0.05),但未有可观察到的形态学变化.构建了pET-28a/ SjCTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白.免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4％,减卯率为80.5％. 结论 初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低SjCTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数.
-
氯硝柳胺在小鼠血浆中的代谢及抗日本血吸虫尾蚴侵袭作用
目的 通过观察氯硝柳胺口服后血药浓度变化,了解药物在小鼠血浆中的代谢情况,并对其抗日本血吸虫尾蚴侵袭的效果进行观察.方法 将24只雌性昆明小鼠随机分成8组,每组3只.每鼠灌胃给药0.2 ml/20 g,剂量为120 mg/kg体重.于给药后0.25、0.5、1、2、4、8、16和24 h眼眶采血,收集血浆,采用高效液相色谱法(HPLC)测定不同时间点的血药浓度,计算药峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、平均滞留时间(MRT)和消除半衰期(T1/2)等药代动力学参数.另取30只昆明小鼠,随机分成6组,每组5只,分别灌胃给药40、80、120、160和200 mg/kg,余下1组作为对照组.给药1h后进行尾蚴攻击感染,每鼠(40±2)条.再取35只昆明小鼠,随机分成7组,每组5只,灌胃给药200mg/kg,余下1组作为对照组.于给药后0.25、1、4、8、12和24 h进行尾蚴攻击感染,每鼠(40±2)条.各组小鼠均于感染后35 d处死,计数体内血吸虫成虫数,计算减虫率. 结果 120 mg/kg氯硝柳胺灌胃给药后0.25 h,小鼠血药浓度即达到(0.40±0.28)μg/ml,1h时达到大值(0.91±0.34) μg/ml,到2h时已降至(0.49±0.38) μg/ml,之后继续下降,16h后趋近于0;MRT为(6.78±1.47)h,T1/2为(6.80±7.05)h.氯硝柳胺不同剂量组35 d后检获虫数与对照组差异均无统计学意义(P＞0.05).200 mg/kg氯硝柳胺给药后0.25 h进行尾蚴攻击,35 d后检获虫数显著少于对照组(P＜0.05),减虫率为79.1％,其他各组与对照组间差异无统计学意义(p＞0.05).结论 氯硝柳胺灌胃给药后,血药浓度迅速上升,1h可达到峰值.200 mg/kg氯硝柳胺给药后0.25 h时对尾蚴侵袭有一定抵抗效果.
-
光诱导金丝桃素体外抗日本血吸虫雄虫作用的观察
目的 观察光诱导后的金丝桃素对日本血吸虫雄虫的体外杀伤作用. 方法 80只昆明小鼠经腹部皮肤感染由单只阳性钉螺逸出的日本血吸虫尾蚴60～80条,6周后剖检,收集雄虫置入含有3 ml DMEM培养液的平皿内(10条/皿).每批次实验均分为:金丝桃素提取物或金丝桃素纯品(以下简称金丝桃素)不同浓度(0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μmol/L)光照组以及不同浓度非光照组,二甲基亚砜(DMSO)对照组和空白对照组.各实验均重复2～5次.将金丝桃素提取物或金丝桃素纯品及DMSO液分别加入含有血吸虫的培养皿中,恒温避光共孵育6h,再分别照射30、60、90和120 min后,37℃避光培养过夜(16 h).次晨,洗涤、更换无药物新鲜培养液,继续避光培养48 h,观察光诱导后的金丝桃素对血吸虫的杀伤作用.选取1.0、2.5和5.0 μmol/L金丝桃素光照60 min组虫体在解剖镜下观察并摄像;2.0 μmol/L金丝桃素光照60 min组虫体进行扫描电镜观察. 结果 各浓度金丝桃素纯品光照组的虫体均有不同程度的死亡,0.1 μmol/L金丝桃素纯品光照30 min组,虫体死亡率为20％;2μmol/L金丝桃素纯品光照90 min组和2.5 μmol/L金丝桃素纯品光照60 min组,虫体均100％死亡.相应的金丝桃素纯品各浓度无光照组、DMSO对照组和空白对照组,虫体均100％存活.解剖镜下观察,1.0、2.5和5.0 μmol/L金丝桃素纯品光照60 min组虫体均出现显著的痉挛性麻痹现象,表现为不同程度的缩短卷曲、体态僵硬和活动终止等改变;扫描电镜观察,2.0 μmol/L金丝桃素纯品光照60 min组虫体皮层出现肿胀、空泡形成、破裂、糜烂、剥落和感觉乳突丢失等损害,甚至皮层正常结构完全消失.金丝桃素纯品各浓度光照组的虫体死亡率和形态结构的损伤改变与金丝桃素浓度和光照时间有关. 结论 金丝桃素经光诱导后,具有显著的体外抗日本血吸虫雄虫作用.
-
日本血吸虫酪氨酸激酶TK4保守区编码基因的克隆和分析
目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株酪氨酸激酶(TK4)保守区编码基因,并分析其在日本血吸虫雌、雄虫间的差异表达.方法 以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经逆转录PCR (RT-PCR)扩增目的基因片段.纯化PCR产物与原核表达载体pET28a质粒连接构建重组质粒pET28a-SjTK4,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达重组蛋白rSjTK4并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)和生物信息学分析.随后,分别提取日本血吸虫雄虫、雌虫及雌雄混合虫体总RNA后,将其逆转录为cDNA,并进行实时荧光定量PCR,确定TK4基因在雌、雄虫虫体的表达水平. 结果 RT-PCR扩增出一条582 bp的基因片段,序列分析表明该片段与SmTK4保守区基因序列同源性为91％,推导的氨基酸序列同源性为98％.SDS-PAGE分析显示,rSjTK4重组蛋白的相对分子质量(Mr)约为26 000(含组氨酸标签).生物信息学分析显示,该蛋白具有多个酶活性位点.雄虫和雌虫中TK4的cDNA相对拷贝数分别为0.61±0.29和0.03±0.02,雄虫TK4的mRNA表达量为雌虫的18倍.结论 日本血吸虫TK4保守区编码基因克隆和表达获得成功,该基因的mRNA在日本血吸虫雄虫的表达量显著高于雌虫.
-
Toll样受体7敲除对日本血吸虫感染早期免疫应答的影响
目的 探讨Toll样受体7(TLR7)敲除对日本血吸虫感染小鼠免疫应答的影响. 方法 野生型C57BL/6小鼠(WT,n=9)和TLR7-/-敲除小鼠(TLR7-/-,n=9)以腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴(20条).感染后42 d处死小鼠,以胸主动脉灌注法收集虫体(n=6),并取肝脏进行虫卵计数;分别取WT、TLR7-/-未感染小鼠,WT、TLR7-/-感染小鼠的脾脏(n=3),制备脾细胞悬液;加入日本血吸虫虫卵(250个/ml)刺激72 h,ELISA法检测γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素4(IL-4)和IL-10水平. 结果 感染后42d,WT组平均虫荷数为(10.5±3.3)条,每克肝卵数为(38 251.9±4 891.5)个;TLR7-/-组平均虫荷数为(9.8±5.2)条,每克肝卵数为(38 160.9±3 341.0)个,两组间差异无统计学意义(P＞0.05).在未感染的情况下,TLR7-/-小鼠脾细胞上清液中的IL-10 [(1702.6±572.3) pg/ml]和IL-4[(59.5±10.1) pg/ml]水平远高于WT组小鼠[(595.2±386.3)和(8.3±0.9) pg/ml] (P＜0.05,P＜0.01).感染后42 d,TLR7-/-组小鼠脾细胞上清液中的TNF-α[(43.7±9.8)pg/ml]和IFN-γ[(215.2±35.4) pg/ml]水平低于WT组[(63.4±22.9)和(383.5±253.3) pg/ml],而IL-4 [(63.9±33.9) pg/ml]水平高于WT组小鼠[(23.3±11.5)pg/ml],但rLR7-/-组与WT组间的差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 TLR7-/-小鼠在未感染的状态下偏向Th2反应,不影响感染日本血吸虫6周后的免疫应答.
-
日本血吸虫钙蛋白酶基因的原核表达及功能分析
目的 克隆表达日本血吸虫钙蛋白酶(Sjcalpain),了解Sjcalpain在尾蚴内的分布及其在尾蚴侵染中的作用. 方法 根据SjCalpain基因全序列(GenBank登录号为AB016726)设计引物,PCR分别扩增Sjcalpain的催化位点区域和Ca2+结合位点区域的基因片段,克隆入pET-28a原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli) BL21 (DE3)中进行原核表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达和纯化情况.纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体,ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测多克隆抗体的效价和特异性.利用免疫荧光定位技术观察Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况.将尾蚴和钙蛋白酶抑制剂孵育后感染小鼠,计算血吸虫减虫率. 结果 成功构建了Sjcalpain的催化位点/pET-28a和Ca2+结合位点/pET-28a原核表达重组质粒,在E.coli BL21 (DE3)中成功表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为43 000和39 000,与预期大小一致,且均为包涵体表达.组氨酸标签亲和层析成功纯化得到目的重组蛋白.间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价超过1∶80 000.免疫定位结果显示,Sjcalpain在日本血吸虫尾蚴头部分布较多.尾蚴侵染抑制实验中,钙蛋白酶抑制剂作用组平均获虫19条,对照组平均获虫23条,减虫率为17.4％. 结论 Sjcalpain蛋白产物主要分布在日本血吸虫尾蚴的头部;Sjcalpain被抑制后可以减少入侵宿主的尾蚴数量,说明Sjcalpain在尾蚴感染宿主皮肤过程中发挥一定的作用.
-
日本血吸虫两种酪氨酸酶的克隆、表达和转录特异性分析
目的 克隆、表达日本血吸虫2种酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的全长基因,并研究这2种基因在日本血吸虫不同性别和不同发育阶段的转录特异性. 方法 设计特异性引物,从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出SjTYR1和SjTYR2的全长片段,并克隆入原核表达载体pSJ2,验证正确的重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)Rosetta Gami细胞,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并用组氨酸标签对表达产物进行亲和层析纯化.将纯化后获得的重组蛋白SjTYR1和SjTYR2分别免疫新西兰白兔制备免疫兔血清.分别以重组蛋白免疫兔血清和日本血吸虫感染兔血清为一抗,用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性和免疫反应性;以重组蛋白免疫兔血清为一抗,用Western blotting观察其与日本血吸虫虫体蛋白的反应情况.制备感染后14、16、18、20、22、24、26和28 d雌虫和雄虫的总RNA,利用RT-PCR分析SjTYR1和SjTYR2基因在日本血吸虫不同性别及不同发育时间的转录水平的差异. 结果 构建了重组原核表达载体SjTYR1/pSJ2和SjTYR2/pSJ2,诱导后获得包涵体形式表达的重组蛋白,相对分子质量(Mr)分别为55 000和56 800,与预测的融合蛋白相对分子质量相符.纯化后的重组蛋白SjTYR1可被日本血吸虫感染兔血清识别,而SjTYR2则不能.rSjTYR1免疫兔血清与虫体蛋白反应后,可见一条约Mr 100 000的条带,rSjTYR2免疫兔血清不与虫体蛋白反应.在雄虫体内,2种酪氨酸酶均不转录;在雌虫体内,2种酪氨酸酶在感染后24 d内不转录,自24d开始出现激增,之后逐渐提高,感染后28 d达到相对大值. 结论 构建了SjTY R1和SjTYR2的重组质粒并表达,2种重组蛋白均具有免疫原性和免疫反应性.SjTYR1和SjTYR2在血吸虫雌虫中特异表达,且在感染终宿主后24～28 d转录水平升高.
-
吡喹酮治疗血吸虫感染小鼠后IFN-γ和IL-4及T细胞的变化
目的 观察血吸虫感染小鼠经吡喹酮治疗后血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的水平,及脾细胞中特异性T细胞数量的变化. 方法 将90只6～8周龄BALB/c小鼠随机分成3组,分别为感染组、治疗组和对照组,每组30只.感染组和治疗组小鼠经腹部感染血吸虫尾蚴(约25条/鼠).治疗组小鼠于感染后6周经口给予吡喹酮治疗,300 mg/(kg·d) ×3 d.分别在治疗后4、6、8和12周,对各组小鼠进行称重,采血并分离血清,ELISA检测血清细胞因子IFN-γ和IL-4水平.无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,经日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)刺激后,用酶联免疫斑点法(ELISPOT)分别检测分泌IFN-γ和IL-4的特异性T淋巴细胞的增殖水平. 结果 治疗组小鼠体重在治疗后4～12周均显著大于感染组(P＜0.05),与对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).ELISA结果表明,治疗后4周,治疗组血清中IFN-γ和IL-4水平与感染组间差异无统计学意义(P＞0.05),而治疗后6、8和12周,治疗组的IFN-γ(0.038±0.013、0.028±0.001和0.027±0.007)和IL-4(0.051±0.020、0.045±0.019和0.043±0.016)水平均显著低于感染组(IFN-γ:0.057±0.004、0.060±0.023和0.052±0.017,IL-4:0.150±0.014、0.148±0.014和0.123±0.017)(P＜0.05),而治疗组和感染组的IFN-γ和IL-4水平均显著高于对照组(P＜0.05).ELISPOT结果显示,在治疗后4周和6周,治疗组脾细胞中IFN-γ特异性淋巴细胞数量与感染组间差异无统计学意义(P＞0.05),而治疗后8周和12周治疗组细胞数量(39.9±22.8和38.5±6.2)显著低于感染组(141.9±39.3和106.8±28.6)(P＜0.05);治疗组脾细胞中IL-4特异性淋巴细胞数量在治疗后4周显著高于感染组(P＜0.05),而后开始减少,治疗后8周和12周(111.3±14.3和113.0±44.2)显著低于感染组(220.3±107.1和208.1±17.2) (P＜0.05);治疗组和感染组脾细胞中IFN-γ和IL-4特异性淋巴细胞数量均显著高于对照组(P＜0.05). 结论 吡喹酮治疗血吸虫感染小鼠后血清中细胞因子IFN-γ和IL-4水平降低,脾细胞中IFN-γ和IL-4特异性淋巴细胞数量减少.
-
日本血吸虫感染小鼠肝脏Toll样受体2和6的表达变化
目的 探讨日本血吸虫感染小鼠肝内Toll样受体1(Toll-like receptor 1,TLR1)、TLR2和TLR6的表达变化. 方法 50只BALB/c小鼠经腹部皮肤贴片法感染日本血吸虫尾蚴(20±3)条,分别于感染后5、6、8和12周各剖杀10只,收集小鼠肝脏.另10只鼠感染后6周经灌胃法给予吡喹酮治疗[250 μg/(g·d) ×3 d],于感染后8周剖杀收集小鼠肝脏.同时设未感染吡喹酮治疗组和健康对照组,每组10只小鼠.以肝脏总RNA为模板逆转录PCR检测感染不同时期TLR1、TLR2、TLR6的mRNA水平.应用免疫组化法检测各时期小鼠肝TLR2和TLR6的蛋白水平.结果 感染后5、6、8、12周,小鼠肝组织中的TLR1、TLR2、TLR6 mRNA转录水平均升高.感染后6周,吡喹酮治疗组肝组织中的TLR2、TLR6 mRNA水平较单纯感染组下降,而TLR1未见明显变化.免疫组织化学结果显示,感染后5、6、8、12周,小鼠肝组织中的TLR2、TLR6蛋白表达水平升高;感染后6周,吡喹酮治疗组肝组织中的TLR2蛋白水平较单纯感染组明显下降,TLR2阳性表达面积百分比分别为(8.8±3.1)％、(44.2±4.3)％,差异有统计学意义(P＜0.01).感染后6周,吡喹酮治疗组肝组织中的TLR6蛋白水平较单纯感染组略微下降,TLR6阳性表达面积百分比分别为(37.4±3.5)％、(48.4±5.4)％,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 小鼠感染日本血吸虫后肝组织中的TRL2、TLR6蛋白水平升高,但TLR6的作用比TLR2弱.
-
日本血吸虫醛糖还原酶基因RNA干扰效应的初步研究
目的 研究siRNA诱导的日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)基因转录本和蛋白水平的RNA干扰(RNAi)效应. 方法 设计并合成2条针对SjAR基因的siRNA(siRNA-1和siRNA-2)和1条阴性对照siRNA(siRNA-NC).用日本血吸虫尾蚴感染4～～6周龄雌性昆明鼠(800～～1 000条/鼠),13 d后灌注小鼠肝门静脉收集童虫,每(120±10)条童虫为一组,分别采用电转法和浸泡法对各组童虫进行RNAi处理.电转处理法:向电击杯中分别加入5 μg siRNA-1、siRNA-2、siRNA-NC或等体积的焦碳酸二乙酯(DEPC)水(空白对照),经125 V 20 ms方波脉冲电击童虫1次后,继续培养48 h；浸泡处理法:向童虫培养基中加入siRNA-1、siRNA-2或siRNA-NC溶液至siRNA浓度为200 nmol/L,第3天时更换一半新鲜培养基并补充siRNA,共培养5d.每处理设3个平行对照组.干扰结束后,采用TRIzol法提取虫体RNA和可溶性总蛋白,将RNA反转录为cDNA,以SjGAPDH基因为内参,实时定量PCR检测SjAR转录本相对表达水平的变化,Western blotting分析jAR蛋白水平的变化. 结果 实时定量PCR结果显示,采用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC电转后,虫体jAR转录本水平分别为(90.6±16.2)％、(84.2±7.3)％和(105.9±10.3)％,与空白对照组[(100.9±16.8)％]的差异均无统计学意义(P＞0.05)；使用siR-NA-1、siRNA-2浸泡后,SjAR转录本水平为(48.6±8.2)％和(73.4±4.7)％,均较空白对照组[(100.0±3.3％)]显著下降(P＜0.01),而阴性对照siRNA-NC浸泡后的虫体SjAR转录本的表达水平为(101.43±14.33)％,与空白对照组比较表达差异无统计学意义(9＞0.05).Western blotting分析和条带定量结果显示,以空白对照组为标准,使用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC浸泡后,SjAR蛋白水平分别为79.0％、97.8％和103.2％. 结论 使用浸泡法对日本血吸虫童虫SjAR进行RNAi处理可降低靶基因转录本和蛋白的表达水平.
-
髓源抑制性细胞在日本血吸虫感染小鼠脾脏及外周血富集的研究
目的 分析日本血吸虫尾蚴感染小鼠体内髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)的富集情况,初步探索其在抗血吸虫感染免疫中的作用. 方法 日本血吸虫尾蚴用腹部贴片法感染C57BL/6小鼠(20条/鼠)24只.感染后1、2、6和8周采集小鼠(各6只)外周血,感染6、8周组小鼠脱颈处死后取脾组织,制备单细胞悬液.各时段同时设健康对照组(各6只).通过流式细胞术检测小鼠脾组织和外周血中的Gr-1+细胞、CD11b+细胞及MDSC比例.通过CD4+T细胞增殖抑制试验验证感染小鼠Gr-1+粒细胞的功能. 结果 感染后6周和8周组小鼠外周血MDSC、Gr-1+细胞、CD1 1b+细胞分别约占总单核细胞(MNC)的38.2％～57.8％和47.1％～77.6％,28.9％～44.6％和40.4％～72.9％,36.0％～48.1％和40.3％～68.3％,显著高于健康对照组(15.1％～20.4％,8.4％～17.3％,9.8％～22.6％)、感染后1周(16.2％～19.8％,13.0％～16.8％,17.6％～19.4％)及2周组(19.8％～29.5％,17.2％～22.2％和20.9％～33.3％)(P＜0.01).而感染后1周、2周组与健康对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).脾组织与外周血中的MDSC、Gr-1+细胞、CD1 1b+细胞变化趋势一致.此外,从感染小鼠脾组织分离到的Gr-1+细胞显著抑制刀豆球蛋白诱导的健康小鼠的CD4+T细胞增殖能力. 结论 日本血吸虫感染可诱导小鼠体内MDSC富集,且感染Gr-1+细胞可抑制正常CD4+T细胞增殖.
-
日本血吸虫感染对小鼠血清中脂质含量影响的初步研究
目的 探讨日本血吸虫感染对小鼠血清中脂质含量的影响. 方法 24只ICR小鼠随机均分为2组,分别喂食高脂鼠料和普通鼠料,4周后每组随机取6只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫双性尾蚴(150条/鼠),42 d后摘眼球取血.另取36只ICR小鼠均分为3组,均喂食普通鼠料.第1组小鼠感染日本血吸虫单性尾蚴(150条/鼠),42 d后摘眼球取血；第2组小鼠腹腔注射日本血吸虫虫卵10 000枚,注射后第3天眼内眦静脉取血,第6天摘眼球取血；第3组小鼠腹腔注射虫卵可溶性抗原(soluble egg antigen,SEA),每鼠1 mg/d,连续注射6d后摘眼球取血.各组均设空白对照,全自动生化仪检测各组小鼠血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的含量. 结果 日本血吸虫双性尾蚴感染可降低高脂和普通鼠料喂养的小鼠血清中TC、TG、HDL和LDL含量(P＜0.05),其中高脂鼠料喂养组的感染小鼠TC、TG、HDL和LDL含量分别为(1.45±0.31)、(0.17±0.06)、(1.11±0.26)和(0.44±0.15) mmol/L,均低于对照组小鼠的(7.86±0.07)、(0.23±0.07)、(4.96±0.81)和(3.93±0.29) mmol/L(P＜0.05),血清中TC、TG、HDL和LDL分别降低81.6％、26.1％、77.6％和88.8％；普通鼠料喂养组的感染小鼠TC、TG、HDL和LDL含量分别为(1.03±0.08)、(0.17±0.03)、(0.84±0.02)和(0.09±0.02) mmo]/L,均低于对照组小鼠的(1.85±0.05)、(0.90±0.14)、(1.38±0.18)和(0.15±0.01) mmoUL (P＜0.05),血清中TC、TG、HDL和LDL分别降低44.3％、81.1％、39.1％和40.0％.单性尾蚴感染以及腹腔注射虫卵的小鼠与对照组比较,血清中TC、TG、HDL和LDL含量差异无统计学意义(P＞0.05).注射日本血吸虫SEA小鼠的血清TC、TG、HDL和LDL含量分别为(1.07±0.15)、(1.06m15)、(0.71_±0.14)和(0.05±0.04),均低于对照组小鼠的(1.81±0.06)、(2.15±0.13)、(1.16±0.15)和(0.16±0.03) mmol/L(P＜0.05).与对照组相比,TC、TG、HDL和LDL分别降低40.8％、50.7％、38.8％和68.8％. 结论 日本血吸虫感染能降低小鼠血清中的脂质TC、TG、HDL和LDL含量.
