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人感染禽流感病毒A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)株HA基因序列分析
目的 测定本市首例人感染禽流感病毒A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)株HA基因序列,分析H7N9禽流感病毒HA基因特点.方法 采用real-time PCR检测患者H7N9禽流感病毒核酸,RT-PCR扩增病毒HA基因后测定核苷酸序列.结果 实验室确诊丽水首例人感染H7N9禽流感患者.测序得到H7N9禽流感病毒长度为1 683 bp的HA基因核苷酸全序.A/Zhejiang/LS01/2014 (H7N9)与我国江浙沪分离株HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性都比较高,分别为98.8％ ～ 99.5％、98.9％ ～ 99.5％;与浙江鸡分离株A/chicken/Zhejiang/C483/2013(H7N9)序列相似性高.A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)与我国江浙沪H7N9病毒株HA基因序列均处于同一进化分支;与浙江外环境分离株A/environment/Hangzhou/34/2013(H7N9)进化关系近;与浙江鸡分离株A/chicken/Zhejiang/C483/2013(H7N9)进化关系次之;与韩国野鸟分离株A/wildbird/Korea/A3/2011(H7N9)处于同一进化分支.结论 A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9) HA基因来源于浙江鸡携带的H7亚型流感病毒.HA基因具有低致病性禽流感病毒基因特征,但与人类呼吸道上皮细胞的亲和力增加,更容易感染到人.
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2012年宁波市甲3亚型流感流行特征与HA1基因特性的分析
目的 了解2012年宁波市甲3亚型流感病毒的流行特征及血凝素基因HA1区域的变异情况.方法 全年度每周从流感监测哨点医院收集疑似病例标本进行病毒分离,获得的甲3亚型流感毒株进行血凝素基因HA1区nt序列测定并推导出其aa序列,然后进行基因特性分析.结果 系统进化分析显示2012年的甲3亚型流感病毒的分离株与近几年的代表株均不在同一进化分支上,aa比对结果显示2012年宁波市的流行株与2011年国内外的流行株在HA1区域有8个以上aa位点存在差异.与2012年-2013年疫苗株相比也存在5个aa位点的差异.结论 2012年宁波市流行的甲3亚型流感病毒在血凝素基因HA1区域发生了较为明显的改变,说明近几年宁波市流行的甲3亚型流感病毒变异较为频繁.
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高致病性禽流感病毒血凝素基因定点突变及其原核表达
目的改构高致病性禽流感病毒血凝素基因,建立有效的原核表达体系.方法利用位点特异PCR突变技术同义突变HA1基因中的稀有密码子,将改构的HA1基因克隆到pGEX-4T-1载体中建立4T-1-HA1-m+重组表达质粒,然后转入E.coli BL21 DE3中并用IPTG诱导表达HA1-GST融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白,Western印迹分析表达产物的免疫活性.结果改构的HA1基因能够在大肠埃希菌中有效表达,表达产物能与H5N1亚型高致病性禽流感病毒免疫鼠血清特异性结合.结论提示高致病性禽流感病毒血凝素基因经位点特异PCR突变技术改构后,可以在大肠埃希菌中表达出有免疫活性的血凝素蛋白.
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H9与H5亚型禽流感病毒血凝素基因的快速鉴别
建立一步法RT-PCR检测方法,对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(Hemagglutinin,HA)分型进行了研究.参照AIV的HA基因序列设计1对引物,对H9和H5亚型AIV进行了扩增,产物大小分别为579bp和177bp.经测试,该引物不与新城疫病毒等鸡的其它传染性病原及鸡肌肉组织的核酸发生交叉反应.敏感性分析发现,从50pg的AIV总RNA中亦能扩增到目的条带.结果表明,此次利用1对引物建立的一步法RT-PCR方法简便适用,可以在一次反应中同时将H9和H5亚型AIV进行快速检测和分型.另外,两个亚型的扩增产物均包含了HA裂解位点在内的基因序列,可通过测序推导氨基酸顺序以预测H5或H9亚型禽流感病毒的潜在毒力.
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整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒
本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定.将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定.将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性.本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法.
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广东地区1996年流感暴发的分子变异基础
1996年广东地区流感毒株发生明显的血清学抗原漂移；引起广 东地区流感暴发的分子基础是流感毒株HA基因编码的A、B、C、D和E五个抗原决定簇位点变 异，尤其是A、C、E位点发生氨基酸改变；而受体结合位点的氨基酸改变对此流感流行未发 挥明显影响。HA基因编码氨基酸的第145号和第193号位点变异导致流行毒株的生物学特性改 变，即分离毒株适应于MDCK细胞株生长，而难以适应鸡胚生长环境。
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基因重组疫苗的研究进展
血凝素是流感的保护性抗原,它不仅诱导机体产生针对血凝素1和血凝素2的抗体,而且诱导CTL反应.1.2.1 左青山等[1]构建了禽流感(AIV)血凝素5和血凝素9基因共表达禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的血凝素基因重组禽痘病毒,可表达AIV的血凝素5和血凝素9基因.用该重组禽痘病毒免疫鸡后再用禽流感病毒做攻击试验,结果表明该重组病毒能全面诱导机体的细胞免疫和体夜免疫反应,对H5强毒攻击产生强的免疫保护,为进一步开展疫苗研究奠定科学的理论和实验基础.
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2010-2013年中山市流感病毒(H3N2)血凝素基因特征分析
目的 研究中山市2010-2013年流行的H3N2亚型流感病毒的血凝素基因特征,分析其基因变异情况. 方法 选取2010-2013年中山市流行的H3N2亚型流感病毒6株,用MDCK细胞分离病毒,提取病毒RNA,RT-PCR扩增HA基因并测定序列,利用BLASTn对序列进行相似性检索,分析其与疫苗株,不同年份、区域流行株的进化变异情况.结果 共分离鉴定到6株H3N2亚型流感病毒,其中2株为2010年流行株,2株为2012年流行株,2株为2013年流行株.各年流行株与其他国家或地区当年大部分流行株在一个分支上,其进化距离随着进化时间变长而变远.2012年流行株相对2010年流行株在HA1区发生12个氨基酸位点变异,有3个位于B、C区.2013年流行株相对2012年流行株发生4个氨基酸位点变异,有2个位于A区.2012年、2013年流行株相对于疫苗株分别发生6、8个氨基酸位点变异,分别有2、4个位于A、B、C区.受体结合位点未发生变异. 结论 中山市H3N2亚型流感病毒流行株在年度之间存在一定程度变异,进化距离随着进化时间变长而变远,相对于疫苗株也存在一定程度上的变异.
关键词： H3N2亚型流感病毒 血凝素基因 基因变异 进化 疫苗株 -
珠海市2011年连续发生5起乙型流感疫情的病毒HA1基因分析
目的 分析珠海市2011年多起连续发生的流感疫情中分离的乙型流感毒株HA1基因特性,阐述流感暴发的原因.方法 用MDCK细胞分离培养流感病毒,提取病毒核酸,采用RT-PCR扩增病毒HA基因并测定核苷酸序列,用ClustalX和MEGA4.1分析结果.结果 珠海市2011年多起连续发生的流感疫情中分离的乙型流感病毒属Victoria系,与2011年流感监测分离株2011C-IN-0056-7相比,没有核苷酸的丢失和插入,没有糖基化位点的改变,核苷酸同源性在97.3％以上,氨基酸有1～3个位点发生了变异,属于同一变异株.与2010-2011年北半球乙型流感疫苗株B/Brisbane/ 60/2008相比较,核苷酸同源性在98.5％以上,氨基酸有1～4个位点发生变异,也属于同一变异株.结论 引起本市流感连续暴发疫情的原因可能是本地流行株抗原漂移所致,与疫苗株B/Brisbane /60/2008核苷酸和氨基酸同源性都很高,吻合性较好,如果能够在儿童中普遍接种,应该能够起到很好的预防作用.
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2006年广东省流感病毒流行的分子基础
目的 了解广东省2006年流行性感冒(流感)流行情况的分子基础.方法 选择广东省流感监测网络实验室分离的11株流感毒株,对血凝素基因进行基因和抗原性的分析.此外,还检测人群抗体水平.结果 2006年流行的H1N1亚型病毒血凝素蛋白重链(HA1)区氨基酸序列与A/New Caledonia/20/99(H1N1)相比,同源性为95.7%～96.3%,有2个抗原决定簇的氨基酸发生了替换.Victoria系的HA1区基因与B/HongKong/330/2001相比,同源性为97.2%～97.5%,有6个位于抗原决定簇的氨基酸发生了替换,这种变化和B/Malaysia/2506/2004相一致,这在B型的基因种系发生树也得到证实.同时发现人群针对H1N1亚型和B/Victoria的抗体水平较低.结论 2006年广东H1N1亚型和B/Victoria系病毒株发生了一定程度的变异,以及人群保护性抗体水平较低,共同造成其在本地的流行.
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流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析
目的获得血凝素基因(HA)基因,将其克隆到真核表达载体,为研究流感DNA疫苗奠定基础.方法从当年流感病人体内分离病毒(A/Guangdong/448/2001),鉴定型别(H3N2)后,提取RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增HA,并将其克隆到pMD18-T Vector,进行序列测定和分析;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo),进行鉴定.结果获得一个核苷酸长度为1698bp的基因,编码565个氨基酸;与A/Beijing/32/92(Genbank/NCBI:U26830)基因序列有98%同源,有15个碱基和/或10个氨基酸出现变异,且在212缺失一个氨基酸V;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN).结论成功构建了HA基因真核表达载体,可以进一步研究其免疫功能.
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苏州市人感染H7N9禽流感聚集性疫情调查分析
目的 调查分析苏州市两起家庭聚集性人感染H7N9禽流感疫情流行病学及病原学特征,为该地区人感染H7N9病毒疫情防控提供科学依据.方法 采集聚集性疫情中H7N9病例及其密切接触者咽拭子标本,同时收集流行病学及临床资料,应用实时荧光-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测流感病毒及H7N9亚型的特异性基因,对H7N9阳性标本进行病毒分离并测序,比对分析H7N9病毒血凝素基因变异状况.结果 第一起聚集性疫情中2例H7N9病例被成功救治.而第二起聚集性疫情中的1例H7N9死亡,另1例存活.两起疫情中的其他密切接触者无发病报告.H7N9病毒的受体结合位点没有发生变异.引起这两起人感染H7N9禽流感聚集性疫情的病毒血凝素切割位点的氨基酸序列为PEIPKGR↓GLF.耐药位点E120G、R153K、H276Y及R294K未发生改变.结论 H7N9病毒在有血缘关系的近亲属之间可能更容易传播,对于H7N9患者应加强院感防控,防止密切接触者感染.目前,H7N9病毒仅具有有限的人传人能力,尚不能在人际间持续传播,第二起聚集性疫情中的H7N9病毒血凝素基因序列高度同源且仍对奥司他韦等神经氨酸酶抑制剂敏感.
关键词： H7N9病毒 血凝素基因 变异 实时荧光-聚合酶链反应 耐药 -
2015-2017年贵州省威宁13株H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析
目的 了解2015-2017年贵州省威宁H9N2亚型禽流感病毒的分子特征,为禽流感病毒的研究与防控提供依据.方法 对选取的13株病毒进行核酸的提取、血凝素基因(hemagglutinin,HA)的扩增和测序,运用生物信息学软件对H9N2禽流感病毒(AIV) HA基因的同源性、遗传进化、受体结合关键位点、致病相关位点和糖基化位点变异情况进行分析.结果 13株H9N2AIV的HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96.1％ ～99.9％和95.7％～100％,均属于DK/HK/Y280/97分支.HA基因与致病性高低相关的裂解位点区域2株为PSRSNR↓GLF,11株为PSRSSR↓GLF,均属于低致病性毒株.与传播感染相关的受体结合位点均发生E198T和Q234L的突变,具有人样受体结合特征.13株毒株HA均含7个与毒力相关的糖基化位点,218位点均存在一个糖基化位点缺失,3 13位点均存在一个糖基化位点的增加.结论 贵州省威宁县H9N2AIVs属于DK/HK/Y280/97系,均为低致病性禽流感病毒,存在人易感位点,病毒一直处于不断的变异之中,故应加强其监测与防控.
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河北省2005～2006年H1N1亚型流感病毒血凝素HA1基因特征研究
[目的]研究2005～2006年河北省分离的H1N1型流感病毒毒株HA1基因特性.阐明HA1基因的变异与流感流行的关系. [方法]用MDCK分离培养流感病毒,提取病毒核糖核酸(RNA),采用RT-PCR扩增病毒HA1基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件作分析处理. [结果]2005～2006年在河北省流行的H1N1型流感病毒HA1基因核苷酸和氨基酸序列与同时期的H1N1亚型疫苗株A/New Caledonia/20/1999相比巴发生较大变异,核苷酸同源性为97.0%～98.1%,氨基酸同源性为97.9%～98.7%,有5～7个氨基酸发生了替换,但均不在抗原表位.种系进化结果显示A/河北南市/37/2005与A/河北新市/56/2005和A/河北新市/129/2006位于2个小分支,均距A/NewCaledonia/20/1999较远,A/河北南市/37/2005与A/NeW York/221/2003有较近的亲缘关系. [结论]H1N1型流感病毒HA1基因已发生明显变异,但对抗原性改变意义不大;近几年H1N1持续低流行使人群易感性得以积累是今年H1N1型流感流行的主要原因;2005～2006年河北省同时流行着至少2支种系发生距离较远的H1N1型流感病毒.
关键词： H1N1亚型流感病毒 血凝素基因 核苷酸序列 -
多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒
目的:建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法.方法:用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段.根据扩增产物的大小检测流感病毒.结果:以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942 bp、1117 bp和751 bp的核酸片段,它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系.根据扩增产物的大小可以检测流感病毒.用这个方法能检测病毒浓度为0.1TCID50的样品.还可直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒.结论:多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法,此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒.
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2007年乙型流感病毒抗原性和基因特性分析
目的 了解四川省乙型流感病毒血凝索的抗原性和基因变异情况.方法 采集四川省流感监测哨点医院和疑似流感疫情的流感样病例咽拭子,用MDCK细胞进行病毒分离.选取来自不同时间、地点且经血凝抑制实验鉴定为乙型的流感病毒分离株进行单向血凝抑制实验;提取病毒核酸,进行RT-PCR扩增HA基因的HA1区,对扩增产物进行序列测定并推导出氨基酸序列.结果 2007年四川省乙型Yamagata系流感病毒的抗原性不同于B/天津/144/2005,而与B/福建新罗/54/2006类似,乙型Victoria系病毒与B/深圳/155/2005相比其抗原性存在差异;核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,在HA1区有分别有6个、2个和4个氨基酸位点发生了替换.结论 四川省2007年乙型Yamagata系和Victoria系流感病毒的抗原性与B/天津/144/2005和B/深圳/155/2005相比发生了进一步的漂移.
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禽流感病毒血凝素基因及基因工程疫苗的研究进展
通过近年来对禽流感病毒血凝素基因及该基因编码的血凝素蛋白的结构和功能的研究,进一步明确了禽流感病毒血凝素基因的特点以及血凝素蛋白的裂解效力与禽流感病毒致病性的关系.本文着重就血凝素蛋白及其裂解位点与禽流感病毒致病力的关系进行综述,并对禽流感病毒血凝素基因工程疫苗的研究与开发近况作一介绍.
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贵州省A(H1N1)亚型流感病毒HA基因系列分析
目的:了解贵州省A(H1N1)流感病毒血凝素抗原的基因变异情况.方法:对贵州省分离的部分A(H1N1)流感病毒株利用聚合酶链反应进行扩增,将扩增产物进行序列测定,然后进行基因系列分析.结果:2001-2005年贵州省分离的A(H1N1)流感病毒株有以下位点发生变异:202G>R、203D>N、225R>K、268M>R.202、203(RBS的左侧壁)、225在受体结合位点.结论:我省2001-2005年分离的A(H1N1)流感病毒株基因特性已发生变异.
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慢病毒介导的H7N9禽流感病毒血凝素基因快速真核表达系统的建立
目的 利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定.方法 提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-HA重组载体.设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-HA质粒中扩增出平末端HA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-HA-V5.将表达载体转染HEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Westernblot法鉴定HA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性.结果 经反转录PCR获得1 683 bp的HA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白.IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性.结论 成功利用慢病毒载体建立了HA蛋白的快速真核表达系统,为研制H7N9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础.
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流感病毒血凝素基因、神经氨酸酶基因在小鼠中的免疫效果观察
流感病毒血凝素基因,神经氨酸酶基因免疫BALB/c小鼠,获得特异阳性抗体反应,抗体滴度与基因免疫量呈正相关性,各实验组免疫小鼠抗同型流感病毒攻击存活率为100%,血凝素基因免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为100%,神经氨酸酶基因免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为75%,血凝素基因与神经氨酸酶基因联合免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为100%.
