首页 > 文献资料
-
副溶血弧菌RIMD2210633与霍乱弧菌N16961中超级整合子结构差异分析
目的 确定副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) RIMD2210633与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)N16961菌株中超级整合子结构特点差异.方法 (1)使用Perl脚本搜寻RIMD2210633和N16961中superintegron (SI)中核心序列(core segment,CS)和反向核心序列(inverted core segment,ICS)；(2)配对核心序列和反向核心序列,获得副溶血弧菌重复序列(V.parahaemolyticus repeat,VPR)及霍乱弧菌重复序列(V.cholerae repeat,VCR)基因组位置信息； (3)使用Perl语言脚本获得副溶血弧菌RIMD2210633以及霍乱弧菌N16961的SI中重复序列,并获得基因盒的构成和分布信息；(4)使用全局比对软件Clustal W将上一步获得的所有VPR和VCR序列进行多序列比对,使用Perl语言脚本处理比对结果以获得一致性序列；(5)使用MEGA 4.0查看多序列比对结果,并使用Perl脚本计算各位置的变异频率,据此结果来分析副溶血RIMD2210633和霍乱弧菌N16961中的弧菌重复序列以及基因盒分布的特点.结果 在RIMD2210633的超级整合子鉴定了69个VPR,其核苷酸长度在91～125 bp之间.在包含128个核苷酸的一致性序列中,15个为保守核苷酸位点,113个为可变核苷酸位点.在副溶血弧菌的SI中,共确定了64个基因盒,基因盒的长度范围是420～1 709 bp,中位数是648 bp.在霍乱弧菌N16961的超级整合子中鉴定了1 58个VCR,长度在117～124 bp之间.在包含126个核苷酸的一致性序列中,37个为保守核苷酸位点,89个为可变核苷酸位点.N16961的SI中共存在1 46个基因盒,基因盒的长度范围是390～5924 bp,中位数是1 518 bp.结论 与霍乱弧菌的VCR相比,副溶血弧菌的VPR可变区序列变异更大,与弧菌重复序列之间序列一致性高的特点不相吻合.
-
RelB对HIV-1 Vpr转录激活及诱导细胞G2/M期停滞功能影响的初步研究
Vpr是人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus type 1,HIV-1)的辅助蛋白之一,在病毒复制及AIDS进程中起重要作用.为了研究Vpr完成其生物学功能的分子机制,本研究利用酵母双杂交技术,从人的cDNA文库中筛选,并经免疫共沉淀技术证实NF-κB通路中的重要蛋白RelB与Vpr存在相互作用；发现RelB蛋白能促进Vpr介导的对NF-κB报告基因的激活,也能促进Vpr对HIV-1 LTR的反式激活作用.利用流式细胞技术发现RelB促进Vpr诱导细胞周期G2/M期停滞.上述结果表明,RelB辅助Vpr完成其转录激活以及调控细胞周期的功能.
-
艾滋病痴呆综合征患者HIV-1Vpr基因多态性及氨基酸序列分析
目的 研究艾滋病痴呆综合征(AIDS dementia complex,ADC)患者体内不同部位来源的HIV-1 Vpr基因突变及其氨基酸序列的改变,为HIV-1神经致病机制的研究提供依据.方法 取1例ADC患者外周(淋巴结、脾脏、肝脏)和中枢神经系统(脑膜、额叶灰质、额叶白质、颞叶皮质、基底核)共8个部位的尸检标本基因组DNA,巢式PCR扩增并克隆HIV-1 Vpr基因,与克隆载体pMD19-T连接,转化大肠杆菌DH5α后,分别挑取5个阳性菌落进行Vpv基因测序,测序结果通过MEGA6生成系统进化树并计算基因距离,SNAP进行同义/非同义替换值(ds/dn)的计算并分析氨基酸位点的改变.结果 该病例感染的病毒是HIV-1 B亚型,分离自ADC患者不同组织的HIV-1 Vpr基因序列存在差异,其中枢神经系统和外周HIV-1 Vpr基因序列在系统进化树中相互交织在一起,中枢和外周与HXB2 Vpr基因距离差异无统计学意义,所有HIV-1 Vpr基因序列的ds/dn=3.3749.与标准序列相比,该病例的HIV-1 Vpr基因编码的氨基酸序列有22个位点发生了变异,并且中枢各部位部分氨基酸位点的变异与外周不同.结论 ADC患者体内HIV-1 Vpr序列存在变异,且在外周和中枢不同部位中的变异不同,这些变异导致Vpr氨基酸位点的改变对Vpr蛋白生物学活性的影响及在ADC发病机制中的作用,还有待进一步研究.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 VPR 艾滋病痴呆综合征 基因多态性 -
不同变异位点的HIV-1 vpr重组真核表达载体对转染细胞凋亡作用的观察祆
目的 观察不同的人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的vpr基因变异株致宿主细胞凋亡作用的区别,及其可能的机制.方法 14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 vpr基因片断,其PCR产物纯化后经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,以pcDNA3.1(+)真核表达质粒连接转化实验,将重组质粒用脂质体瞬时转染至HeLa细胞,G418筛选后收获细胞.RT-PCR检测目的 基因mRNA水平的表达,荧光染色在显微镜下观察Hoeschst凋亡细胞并计算凋亡率,DNA琼脂糖电泳观察各转染细胞凋亡条带,膜联蛋白V-FITC流式细胞检测各株细胞凋亡率,并比较各株细胞的半胱酸蛋白水解酶3活性差别.结果 14个vpr基因片段转染HeLa细胞后,发现有第70、85、86或94位变异的vpr转染细胞Hoeschst染色凋亡率和半胱酸蛋白水解酶3活性检测(分别为0.1225,0.1675,0.1975,0.1575和11.356,8.021,14.6875,10.521)较无这些变异的保守序列vpr转染细胞(0.355和182.4875)为低,DNA琼脂糖电泳法和膜联蛋白细胞凋亡检测也提示同样的规律;第1～7号重组质粒(均为vprAE亚型)的致细胞凋亡能力也明显小于第8～14号重组质粒(vpr B,AB,C和C/BC亚型).结论 首次观察到有第70、85、86或94位变异的HIV-1 vpr序列,其致HeLa细胞凋亡的能力低于无这些位点变异的保守序列,AE亚型诱导宿主细胞凋亡能力低于其他亚型,其机制之一与半胱酸蛋白水解酶3途径激活降低有关.
-
中国人类免疫缺陷病毒-1 vpr基因多态性及其临床意义
目的 分析来自中国不同地区HIV-1感染者的vpr基因序列变异位点及与国外以往研究的异同,为进一步研究HIV-1 vpr基因变异的意义及其与感染者临床病情的关系奠定基础.方法 RT-PCR及套式PCR法对398例HIV-1感染者行HIV-1 vpr基凶扩增,并进行氨基酸序列分析,了解HIV vpr基冈的多念性、离散率和常见变异位点.同时将发现常见变异位点感染者的相应病毒水平、淋巴细胞亚群及临床病程的进展进行对比分析.结果 对398份血标本行HIV-1 vpr基因扩增,分析后可用氨基酸序列为153份.HIV-1 Vpr氨基酸序列分型主要足CRF01_AE 51,63%,C亚型24.84%,B亚型17.65%,CRF03_AB 3.92%,CRF08_BC 1.31%.HIV Vpr序列中第77位氨基酸84.3%为谷氨酸,与以往国外报道的R77Q变异与AIDS长期病情无进展(LTNP)璃彳切卡廿关的观点有明显差异.HIV Vpr第、63、70、85、86、89、94位氨基酸的变异,有可能使感染者的临床进展趋缓.结论 我围HIV Vpr分型仍以M组为主,其中 CRF01_AE占优势.HIV-1 Vpr中氨基酸序列某些位点的变异可能与感染者临床表现相关.
-
人类免疫缺陷病毒-1 vpr基因干扰RNA载体构建及筛选的体外研究
目的 筛选鉴定针对HIV-1 vpr基因的小干扰RNA(siRNA)干扰片段,探讨siRNA对HIV-1 vpr基因的干扰效率.方法 根据siRNA设计要求合成针对HIV-1 vpr靶点的2段寡核苷酸片段,并构建相应载体,转染含HIV-1 vpr质粒的HEK293T细胞.设2个实验组(siRNA56、siRNA160组),1个阴性对照组(NC组),空白HEK293T细胞为对照组(Con组).各组分别进行总RNA、蛋白提取,实时PCR和蛋白质印迹分别从核酸和蛋白水平验证有效的靶向HIV-1 vpr的siRNA片段.ELISA检测各组培养细胞上清液中IL-17、γ干扰素水平.结果 DNA测序结果表明成功构建了哺乳动物细胞pRNAT-U6.1/Neo-Vpr-56/160(siRNA56和siRNA160)表达载体.siRNA56和siRNA160干扰使HIV-1 vpr基因在mRNA水平的表达分别下降69.0％和76.1％;在蛋白表达水平分别下降76.3％和86.5％.Con组、NC组、siRNA56组和siRNA160组细胞培养上清液中IL-17分别为(1.936±0.415)、(1.815±0.393)、(1.935±0.356)和(2.034±0.421) pg/mL;γ干扰素分别为(1.673±0.234)、(1.648±0.332)、(2.169±0.362)和(2.301±0.4125) pg/mL.结论 表达pRNAT-U6.1/Neo-vpr-56/160(siRNA56和siRNA160)的质粒构建成功,针对不同基因片段的siRNA均可以下调HIV-1 vpr的表达水平.
-
细胞核内尿嘧啶DNA糖苷酶(UNG2)在抗体多样性和HIV-1感染中的作用
尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil DNA Glycosylase,UNG 0r UDG)能切断DNA中错误插入的尿嘧啶(U)碱基与糖基之间的N-糖苷键,移去尿嘧啶,留下无碱基位点[1],该位点能被其它酶(如DNA聚合酶和DNA连接酶)识别和修复[2].因此,UNG能够减少由胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)配对向腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对的颠换率,防止和修复DNA中的错配,是生物体减少突变的自我保护机制之一.除了作为DNA修复过程中的一个重要的修复酶外,近年来的研究发现,UNG与机体的免疫功能相关,它参与免疫分子抗体多样性的产生和细胞内天然抗病毒防御作用[3]J.另外,UNG也参与到许多病毒(例如HIV-1)的复制过程中,有效减少病毒的突变率[4]J.HIV-1感染过程实际上就是病毒与机体免疫系统互相对抗的过程,UNG在这场对抗中的作用正在逐渐引起科学家的兴趣.
-
HIV-1 vpr基因表达载体 pAFVPRA 的构建
目的构建可在肝癌细胞中特异性表达人HIV-1 vpr基因的重组表达载体.方法用PCR的方法从pBSXCYPYVPR-xcTHY(简称vpr质粒)中扩增HIV-1 vpr基因片段,克隆到pGEM-T载体中,构建克隆载体pGEM-T/vpr,切下vpr片段后插入到pCI质粒中polyA的上游,构建中间载体pCI/vpr,再切下vprA(vpr+polyA)插入到pAF5.1中AFP 启动子的下游,从而把AFP 启动子和polyA尾分别克隆到vpr基因的上游和下游,构建成pAFVPRA载体.结果成功构建了带有AFP 启动子和polyA尾的载体 pAFVPRA.结论 pAFVPRA质粒构建成功后,可进一步通过合适的方式把HIV-1 vpr基因导入肝细胞,以探讨vpr基因对原发性肝癌细胞的杀伤作用.
-
中国HIV感染者VPR序列变异对细胞周期和致凋亡作用的影响
目的 研究带有不同变异位点的人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)vpr基因对感染细胞周期和凋亡的影响,以及其致细胞周期变化和致细胞凋亡的机制间的町能关系.方法 以14个带有HIV-1 vpr基因片段的pcDNA3.1(+)真核表达载体构建重组质粒.将其转染Hela细胞,并设立保守株vpr基因转染细胞、突变株vpr-FS基因转染细胞、空载体转染细胞和未转染细胞作为对照,经逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测目的 基因转染成功后,Pi染色,用流式细胞仪检测被转染细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率.结果 14个带有不同变异位点HW-1vpr基因片段的Hela细胞经流式细胞仪检测,显示出不同的致细胞周期阻滞和致细胞凋亡的能力.发现转染保守片段HIV-1 vpr的Hela细胞,其细胞周期出现G2期阻滞和细胞凋亡率明显升高,但转染vpr C末端截断的vpr-FS片段的细胞、空载体pcDNA3.1(+)转染细胞和未转染的Hela细胞无此现象.转染了HIV-1 vpr基因序列相对应的Vpr蛋白中含有70V、85P、86G、94G突变的片段,较vpr保守片段致感染细胞G2期阻滞和凋亡的能力明显下降.初步发现vpr诱导G2期阻滞百分率越高,其所致凋亡率亦越高.结论 HIV-1vpr基因有明显的致感染细胞G2周期阻滞和致细胞凋亡的作用,但vpr C末端截断的vpr-FS片段无此功能.说明中国感染者HIV-1vpr基因表达蛋白的70V、85P、86G、94G位点突变能使其致感染细胞G2期阻滞和凋亡的能力下降.vpr诱导G2期阻滞的程度与其致凋亡水平可能相关,提示两者的发生机制可能有一定的关联.本研究为进一步探讨HIV-1致病机制和探索可能的基因干预措施打下了基础.
