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中期因子与卵泡发育的研究进展
中期因子(midkine)属于肝素结合生长因子家族中的新成员,是一种强有力的刺激细胞增殖的调节因子,表达于卵泡颗粒细胞等组织,具有抑制卵丘颗粒细胞凋亡等广泛的生物学作用.在卵泡发育过程中midkine能促进卵母细胞的发育成熟,特别是对细胞质的成熟有着重要的作用,能够提高其受精率、胚胎卵裂率和囊胚率.
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人类卵巢组织条厚度对超低温冷冻效果影响的研究
目的 探索不同卵巢组织条厚度对超低温冷冻效果的影响,同时评估卵巢组织的凋亡情况.方法 卵巢组织取自10例手术的妇女.冷冻前行卵巢组织切片,按小厚度随机分成1.0、0.5、0.25 mm 3组.采用二甲基亚砜(DMSO)为冷冻保护剂的程序慢速冷冻法进行超低温冷冻保存.冻融后进行卵泡计数及各组间正常卵泡形态学分析比较,使用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行组织细胞凋亡检测.上述结果与新鲜卵巢组织进行比较.结果新鲜卵巢组中97.6%原始卵泡保持形态学正常,切片厚度为1.0、0.5、0.25 mm三组形态正常率分别为71.1%、73.9%和72.7%,与新鲜组比较,三实验组下降明显,差别有统计学意义(χ2=15.66,P<0.001);而三冷冻组间相比差别无统计学意义(χ2=0.153,P=0.926).TUNEL原位杂交显示窦前卵泡颗粒细胞中未见凋亡阳性信号,窦卵泡中可见散在阳性信号细胞,卵巢间质细胞亦有散在凋亡信号.结论 0.5～1.0 mm厚度卵巢组织为行超低温冷冻保存是较合理厚度,卵泡闭锁的机理值得进一步研究.
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LM23基因降调激活Fas-FasL和线粒体通路使精母细胞凋亡
目的 通过LM23基因RNA干扰(RNAi)动物模型,探讨LM23基因降调对大鼠生精细胞凋亡的影响.方法 使用本实验室建立的LM23基因RNAi大鼠动物模型,分别通过苏木精-伊红染色(HE)和原位末端标记方法(TUNEL)检测LM23基因降调后生精细胞的凋亡发生情况;基因芯片技术,分析LM23基因降调后凋亡相关基因的差异表达;免疫组织化学技术检测LM23基因降调后caspase3蛋白分子在生精细胞中的表达.结果 TUNEL结果显示,LM23基因降调后大量精母细胞发生凋亡;基因芯片分析结果,LM23基因降调后Fas-FasL信号转导通路和线粒体信号转导通路被激活;免疫组织化学技术发现,LM23基因降调后,caspase3蛋白分子在大鼠睾丸精母细胞中的表达量显著增加.结论 LM23基因降调后,可能激活Fas-FasL信号转导通路和线粒体信号转导通路,从而导致大量精母细胞发生凋亡.
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染料木黄酮对去势小鼠脾细胞凋亡及雌激素受体表达的影响
目的 探讨染料木黄酮(GEN)对去势(OVX)小鼠脾细胞凋亡、凋亡基因Fas、FasL及雌激素受体(ER)亚型表达的影响.方法 流式细胞仪检测不同浓度GEN对OVX小鼠脾细胞的凋亡率,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测细胞内Fas、FasL及ERa、ERβmRNA的表达.结果 OVX+GEN组与青年组相比,脾细胞凋亡率在GEN两个高浓度(37.0、92.5μmol/L)时都显著增高(P均＜0.05);而Fas基因表达在GEN 92.5μmol/L时显著增高(P＜0.05),FasL基因表达在GEN两个高浓度均显著高于青年组(P均＜0.05);与OVX空白组相比,GEN高浓度(92.5/μmol/L)时凋亡率显著增高(P＜0.01),Fas、FasL基因的表达均显著增高(P均＜0.05).ERa、ERβ基因的表达随GEN浓度增加而呈增加趋势,在GEN高浓度(92.5 μmol/L)时显著高于OVX空白组(ERa:P＜0.05;ERβ:P＜0.01).结论 高浓度GEN致脾细胞凋亡,与上调凋亡促进基因Fas、FasL基因表达有关.低浓度GEN可能逆转OVX小鼠脾细胞凋亡.高浓度GEN增加ERα、ERβ基因表达.GEN对脾细胞凋亡、ERs表达的调节可能不完全通过ER途径.
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PUMA基因对耐药绒癌化疗敏感性的影响
目的 研究p53上调凋亡调控因子(PUMA)对绒癌耐药细胞jeg-3/vp16化疗敏感性的影响. 方法 PUMA在化疗药物加入前用PUMA感染jeg-3/vp16细胞,观察抑制增殖的效应并探讨其机制. 结果 Ad-PUMA体内体外均显著增加耐药细胞对化疗药物的敏感性,增加化疗药物诱导绒癌细胞凋亡的能力.jeg-3/vp16的PUMA表达降低,而且对5-氟尿嘧啶(5-Fu)和依托泊苷(vp16)反应减弱. 结论 PUMA在化疗药物诱导凋亡的过程中发挥作用,Ad-PUMA与化疗药物合用后显著增加耐药绒癌细胞对化疗药物的敏感性.
关键词： 绒癌 耐药 凋亡 p53上调凋亡调控因子 -
自然流产模型小鼠绒毛滋养层细胞凋亡及相关调控蛋白的表达
目的 探讨自然流产模型小鼠绒毛滋养层细胞凋亡异常与自然流产的关系. 方法 建立正常妊娠模型CBAXBALB/c和自然流产模型CBAxDBA/2.采用DNA缺口原位末端标记技术(TUNEL)测定两组模型孕13 d绒毛滋养层细胞凋亡情况;免疫组织化学SABC法测定两组模型孕13 d绒毛组织Bcl-2、Bax、Fas、FasL 4种凋亡调控蛋白的表达,并以MBIS-2000医用彩色病理图像免疫组织化学测量系统对其表达进行半定量分析,结果 用平均灰度值表示. 结果自然流产模型小鼠绒毛滋养层细胞凋亡指数明显高于正常妊娠模型(P＜0.01).Bax表达亦高于正常妊娠模型(P＜0.05);FasL表达低于正常妊娠模型(P＜0.01);Fas和Bcl-2表达两组无明显差异.结论 早孕期绒毛滋养层细胞凋亡异常是自然流产机制之一,Bcl-2/Bax,Fas/FasL途径可能是诱导早孕期绒毛滋养层细胞凋亡的重要因素.
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RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌细胞生长的抑制作用
目的 探讨RNA干扰沉默STAT3基因表达对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用.方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建重组质粒(pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3),转染SKOV3细胞进行体外研究;采用Western blot、实时聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学技术检测重组质粒对STAT3基因表达的作用;MTT法检测重组质粒对SKOV3细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)及吖啶橙染色检测重组质粒诱导的细胞凋亡.结果 (1)免疫组织化学技术证实卵巢癌细胞株SKOV3及癌组织中STAT3呈高表达;(2)成功构建pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒,并成功转染SKOV3细胞;(3)MTT法证实重组质粒抑制SKOV3细胞的增殖,流式细胞技术证明重组质粒诱导细胞凋亡;(4)RT-PCR与Western blot分析表明,重组质粒在mRNA及蛋白质水平特异的抑制STAT3的表达;(5)STAT3基因表达的下调抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.结论 pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒可抑制STAT3在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡.
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褪黑素对子宫内膜异位症大鼠细胞凋亡相关蛋白的影响
目的 观察褪黑素(MT)对大鼠子宫内膜异位症(EM)模型细胞凋亡调控相关蛋白的影响. 方法 采用手术移植法制备大鼠EM模型,大鼠随机分为正常对照组、模型对照组和MT高、低剂量组,免疫组织化学法检测异位内膜Bcl-2、Fas、细胞间粘附分子(ICAM)-1的表达,同时检测脾脏自然杀伤(NK)细胞活性. 结果 MT治疗组与模型组比较异位内膜Bcl-2、ICAM-1表达明显下降,Fas表达明显升高,脾脏NK细胞活性显著增加. 结论 MT具有抑制异位内膜 Bcl-2、ICAM-1表达以及增强Fas表达和脾脏NK细胞活性的作用.
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不同玻璃液冻存卵巢组织移植于鸡胚前后的氧化应激和细胞凋亡研究
目的 研究不同玻璃液(VS)保护下冻存的卵巢组织移植于鸡胚前后的氧化应激和细胞凋亡情况,以评估不同玻璃液的冷冻保护效果. 方法 将卵巢组织分割成1～2 mm×1 mm×1 mm的小块分别放入VS1、VS2、VS3、VS4 4种不同的玻璃液中,经过4种玻璃液平衡后冻存并复苏的卵巢组织称为冻存卵巢组织(FOT),分别将经4种玻璃液冻存的FOT移植到胚龄10 d的鸡卵绒毛尿囊膜(CAM)上培养,于鸡卵胚龄16d取出移植于CAM的卵巢组织(TOT),以未经玻璃液平衡的新鲜卵巢组织为对照(COT),分析4种玻璃液保存的FOT、TOT、COT中线粒体活性、细胞内活性氧自由基(ROS)水平和间质细胞凋亡情况. 结果 线粒体活性:经过VS1、VS3和VS4冻存的FOT和TOT中的线粒体活性低于COT,差异有统计学意义(P＜0.05);经VS2冻存的TOT与COT中线粒体活性无显著性差异(P＞0.05).细胞内ROS水平:经过VS1、VS3和MS4冻存的FOT和TOT细胞内ROS水平低于COT,有统计学差异(P＜0.05);经VS2冻存的FOT细胞内ROS水平与COT组比较无显著性差异(P＞0.05).间质细胞凋亡情况:经过VS1、VS2、VS3和VS4平衡的FOT间质细胞凋亡率和COT组之间的差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 由玻璃液VS2保护冻存卵巢组织的冷冻损伤小、移植后缺血损伤轻,是本研究优化的卵巢冷冻保护玻璃液;玻璃化冷冻对间质细胞损伤小,适于人卵巢组织的冷冻保存.
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戊酸雌二醇对更年期大鼠脾细胞凋亡及卵巢功能的作用
目的 了解戊酸雌二醇(E2)对更年期大鼠脾细胞凋亡的作用并观察卵巢组织形态学变化. 方法 SD雌性大鼠30只分为青年组(2.5月龄)、更年组(12月龄)、雌激素组(12月龄)3组.青年组、更年组均予蒸馏水1 ml/d灌胃,雌激素组予戊酸E2800 μg·kg-1·d-1灌胃.3个月后颈动脉放血处死.放射免疫法测定血清E2水平,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪测定脾细胞凋亡率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测相关凋亡基因Bcl-2、Bax的表达.光镜下对各组双卵巢切片进行组织形态学观察,IMS细胞自动图像分析系统对卵巢黄体数(个)、卵巢大纵切面面积进行计量分析. 结果 更年组大鼠血清E2水平明显低于青年组而脾细胞凋亡率明显高于青年组,这与其促凋亡基因Bax表达明显升高有关.雌激素组血E2水平明显高于青年组和更年组,其脾细胞凋亡率也明显高于青年组,这与其抗凋亡基因Bcl-2表达降低及Bax表达升高有关.雌激素组抗凋亡基因Bcl-2表达也明显低于更年组.更年组与雌激素组都显示卵巢纵切面积缩小、黄体计数少等功能衰退表现. 结论 更年期大鼠脾细胞凋亡的增龄性改变与血清E2水平负相关;本研究中E2治疗未能逆转更年期大鼠脾细胞凋亡的增龄性变化,这与外源性雌激素导致的超生理浓度的E2水平有关.过高的E2浓度不能改善更年期大鼠衰退的卵巢功能.实验显示衰老与性腺功能衰退密切相关.
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RNA干扰沉默酸性鞘磷脂酶1基因对人成纤维细胞凋亡的影响
目的 为研发保护女性生殖细胞的小分子干扰RNA(siRNA)类药物,以人包皮成纤维细胞(HFF)为模型,检测靶向凋亡关键基因酸性鞘磷脂酶1(SMPD1)基因的siRNA对HFF凋亡的抑制作用.方法 设计合成三对靶向SMPD1基因的siRNA并体外转染HFF细胞,转染后48 h用丝裂霉素(MMC)诱导细胞凋亡.荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Q-RT-PCR)法及免疫印迹(Western blot)检测siRNA转染后SMPD1在mRNA水平和蛋白水平的变化,Annexin Ⅴ-PI双染检测细胞凋亡率.用脂质体(lipofectamine 2000)和无干扰siRNA(NT siRNA )作为对照.结果 siRNA1、2、3对SMPD1基因mRNA的抑制效率分别为(67.0±9.0)%、0%、(45.0±2.1)%,以siRNA1高,蛋白水平的抑制也呈现相同变化.siRNA1组细胞凋亡率为15.2%,明显低于MMC组(26.3%).结论 靶向SMPD1的siRNA可以抑制人包皮成纤维细胞凋亡.
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重组人钙调素对小鼠胚胎发育及凋亡的影响
目的 探讨外源重组人钙调素(rhCAM)对小鼠早期胚胎体外发育及凋亡的影响.方法 小鼠超促排卵,收集2-细胞胚胎置于含不同浓度rhCAM的IVF-30培养液中,观察并记录胚胎形态,TUNEL法检测囊胚细胞数及囊胚细胞凋亡情况.结果 20 μg/ml rhCAM组的胚胎体外培养48、72 h的囊胚形成率和孵化囊胚率均高于对照组,该组体外培养72 h囊胚细胞凋亡指数显著低于对照组.200 μg/ml rhCAM组的胚胎囊胚形成率低于对照组,凋亡指数显著高于对照组.结论 一定浓度的rhCAM可促进胚胎体外发育并可抑制胚胎细胞的凋亡.
关键词： 胚胎 钙调素 凋亡 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 -
二氧化硫诱导小鼠脾细胞凋亡与谷胱甘肽水平的关系
许多研究表明二氧化硫(SO2)长期吸入后除直接影响呼吸系统功能,引起气管炎、支气管炎、哮喘等症状外,尚可进入血液系统进一步转化为亚硫酸氢钠(NaHSO3)、亚硫酸钠(Na2SO3)、硫酸钠(Na2SO4)等形式对机体造成多方面的损害,如引起脂质过氧化、硫血红蛋白血症等[1,2].
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镉中毒对鸡垂体氧化应激和凋亡的影响
镉是地壳中丰度很少的重金属元素,但由于人类的生产活动,它已成为当今环境中主要的污染物,随着水和土壤的污染,威胁着水生生物和动植物及人类的健康.大量的研究表明,镉中毒可引起多器官损伤.镉已被证实为一种环境雌激素,在很低的接触水平就可能对包括垂体在内的内分泌系统产生严重的损害[1].以往的研究表明,氧化应激是镉中毒的机制之一,并且镉可通过氧化应激诱导细胞凋亡[2],但这是否是镉诱导鸡垂体细胞凋亡的一个机制,目前还未见报道.本研究用不同浓度的CdCl,对鸡进行亚慢性体内染毒,通过抗氧化指标和凋亡的检测,探讨镉对鸡垂体氧化应激和细胞凋亡的影响以及两者的关系.
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硫酸镍诱导小鼠卵巢细胞P53、P16、Bcl-2蛋白表达的研究
以前研究中我们得知,腹腔注射硫酸镍(NiSO4)致雌性小鼠卵巢损伤作用与NiSO4调控细胞周期诱导细胞凋亡有关[1].本研究用免疫组化法测定NiSO4.
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氟化钠导致小鼠神经细胞凋亡的研究
地壳中含氟的化合物有100多种,占地壳含量的0.077%.我国除上海外,其余各省、市、自治区均有不同程度的氟中毒流行.同时在工业生产及生活燃煤产生的含氟烟尘和气体均可污染作业场所和大气.
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硫代乙酰胺引起兔肝纤维化及肾毒性作用的研究
目的 探究硫代乙酰胺不同注入途径、不同剂量引起新西兰大白兔肝纤维化及肾毒性的作用机制.方法 15只新西兰大白兔随机分成空白对照组,腹腔注射高和低剂量组,耳缘静脉注射高和低剂量组.硫代乙酰胺干预20周处死试验阶段动物,制备肝、肾病理组织切片,苏木素-伊红(HE)染色观察肝肾组织结构病理改变;Western blot检测肝肾组织细胞凋亡相关蛋白Casepase3、Bax、Bcl-2表达水平的变化;免疫组化检测NF-κB表达水平的变化.结果 病理组织切片结果显示,2种注入途径均可导致新西兰大白兔肝细胞肿胀、纤维化形成,且都引起肾上皮细胞肿胀、出血等病理损伤,但无明显纤维化病变;Western blot结果显示2种注入途径均可使肝肾组织细胞凋亡相关蛋白Casepase3和Bax表达上调,Bcl-2表达下降,且呈现剂量依赖性;免疫组化结果表明两种注入途径NF-κB在肝肾组织的表达均随剂量增加表达上调.结论 硫代乙酰胺可引起兔肝纤维化合并肾损伤毒性,可能与其诱导细胞凋亡有关.
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镉诱导OK细胞凋亡
镉在人体的半衰期长达20～30年,长期职业或环境接触可导致镉在人体组织的大量蓄积.镉在肾脏的蓄积,会影响肾近曲小管的功能,表现为低分子量蛋白质、氨基酸、钙、葡萄糖、尿酸、磷酸盐和酶等从尿中大量排出,以及肾近曲小管的酸化[1,2].这些损害已被大量研究所证实,同时开始从分子生物水平得到一定认识,镉致细胞凋亡就是其中一个方面.有研究表明镉在体外实验中可致人T细胞(T cellline)[3]、猪肾细胞(LLC-PK1 cells)[4]、转化人肾细胞(293cells)[5]发生凋亡,少量整体实验如大鼠肾近曲小管细胞发生凋亡[6].有些体外实验显示很低剂量的镉(10～20μmol/L)即可诱导细胞凋亡[4,5].凋亡是一种生理性的细胞死亡方式,具有特殊的生化和形态特征,许多哺乳动物细胞会发生凋亡[7].尽管凋亡可表现出很多特征性的细胞改变,如核固缩、DNA断片、特殊基因表达等,但是至今没有一项技术足以明确说明凋亡[8].末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记方法(TdT-mediated dUTP Nick-END Labelling,TUNEL)是一种凋亡检测方法,简单、精确、快速、无放射性,可在原位单个细胞水平或对细胞悬液进行检测.在该检测系统中,对凋亡细胞DNA断片用荧光标记,然后用荧光显微镜或流式细胞仪(flow cytometry)进行检测[8～10].本次实验使用TUNEL方法、DNA凝胶电泳和细胞形态改变来检测镉诱导的OK细胞(一种建立好的具有肾近曲小管特征的肾上皮细胞株)凋亡,以帮助进一步认识凋亡以及镉导致的肾近曲小管功能障碍.
关键词： 镉 凋亡 TUNEL方法 OK细胞 DNA琼脂糖凝胶电泳 -
2-APB对顺铂诱导人卵巢癌SKOV3细胞内质网应激途径凋亡的影响
目的 观察2-APB对顺铂诱导人卵巢癌SKOV3细胞内质网应激途径凋亡的影响.方法 体外培养SKOV3细胞,分别加入3.5、7和14μg/ml顺铂作用12和24 h后,用MTT法检测顺铂对SKOV3细胞的抑制率,应用激光共聚焦显微镜观察细胞质内钙离子浓度变化;将SKOV3细胞随机分为空白对照组、顺铂组、2-APB组和顺铂+2-APB组,分别处理24 h后,用倒置相差显微镜观察顺铂对SKOV3细胞形态的影响,用激光共聚焦显微镜观察细胞质内钙离子浓度变化;分别处理12 h后,采用Western blot检测Caspase-3、CHOP和GRP78蛋白表达.结果 MTT结果显示,3.5、7和14 μg/ml顺铂作用SKOV3细胞12和24h,SKOV3细胞存活率明显降低,作用12和24 h的IC50分别为(14.7 ±0.1)μg/ml和(6.6±0.1)μg/ml.激光共聚焦显微镜检测发现,随顺铂浓度及作用时间的增加,SKOV3细胞质游离钙离子浓度逐渐增加.顺铂与2-APB联合作用后,经倒置相差显微镜观察,与顺铂组比较,顺铂+2-APB组细胞密度明显增多.MTT结果显示,与顺铂组比较,顺铂+ 2-APB组细胞存活率由56.8％±0.9％上升至74.4％±1.0％,激光共聚焦显微镜检测发现,游离钙荧光点数由(58.4+0.2) ×103个降低至(23.8±0.3) ×103个,差异有统计学意义(P＜0.01).Western blot结果表明,与顺铂组比较,顺铂+ 2-APB组的Caspase-3、CHOP和GRP78蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 细胞内钙离子参与调控顺铂诱导的SKOV3细胞凋亡.
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醋酸铅引起神经细胞的凋亡
细胞凋亡是一种有别于细胞坏死的受基因调控的细胞主动死亡方式,其生化特征是DNA被激活的核酸内切酶剪切成180～200 bp或其倍数的寡核苷酸片段,含有丰富的3′-OH末端.目前,不少研究表明细胞凋亡可能参与许多异常刺激引起的神经元损害,如缺血缺氧、神经毒物作用、氧化应激及神经系统退行性疾病等[1].近几年,铅与神经细胞凋亡的关系也引起了不少学者的兴趣.Fox[2]和Blankenship[3]相继发现铅可引起体外培养的新生大鼠皮层颗粒细胞及发育期视网膜的视杆细胞和双极神经元发生凋亡.但迄今为止,铅引起神经细胞凋亡的体内动物实验研究在国内外尚缺乏系统详实的报道.本研究采用原位末端标记TUNEL法[4]及HE染色观察亚急性染铅引起的大鼠神经细胞凋亡,并探讨其发生机制.
