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幽门螺杆菌适应性球形变异相关蛋白的筛选及鉴定
目的 对幽门螺杆菌(Hp)在有氧胁迫条件下由螺旋体转变成球形体的适应性调节蛋白进行筛选及鉴定. 方法 运用双向电泳技术比较Hp螺旋体与球形体的全菌蛋白表达谱,差异蛋白进行胶内酶切,肽混合物使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析,将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索. 结果 获得7个与Hp球形变异相关的适应性调节蛋白,即翻译延长因子Tu(EF-Tu)、丙酮酸-黄素蛋白氧化还原酶( POR )、黄素氧化还原蛋白( FldA )、尿素酶G( UreG )、热休克蛋白10(Hsp10)烷基化氢化氧化酶( Ahp )、超氧化物歧化酶( SOD ). 结论 共筛选出7个与Hp球形变异相关的适应性调节蛋白,对有氧胁迫下Hp球形体的形成机制研究和抗Hp药物靶位和疫苗候选靶位的筛选具有参考价值.
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慢性弓形虫感染大鼠脊髓组织蛋白质的双向电泳分析和质谱鉴定
目的 观察慢性弓形虫感染大鼠脊髓蛋白质组的变化与差异表达,为探讨慢性弓形虫感染对脊髓损伤的分子机制奠定基础. 方法 将6只SD雄性大鼠随机分为对照组和感染组,每组3只.感染组每鼠腹腔感染纯化的RH株弓形虫速殖子107/ml×2 ml,对照组每鼠腹腔注射灭菌生理盐水2 ml.大鼠感染弓形虫10周后解剖,采用双向凝胶电泳分离脊髓总蛋白,经考马斯亮蓝染色后用Image Master图象分析系统分析,从胶中选取分离蛋白质点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质量指纹图谱(PMF),采用Mascot软件搜索MSDP、SWISS2PROT数据库鉴定蛋白质. 结果 慢性弓形虫感染大鼠和正常对照组大鼠脊髓蛋白斑点数分别检出(268±13)个和(301±15)个,对2张电泳图进行匹配后发现有7个蛋白斑点在2组大鼠脊髓组织中的含量发生了3倍以上的变化,有差异的7个蛋白斑点经质谱鉴定的数据检索发现3个差异表达蛋白质,分别为甘油三磷酸脱氢酶(similar to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein)和类肌动蛋白[cytoplasmic 2(Gamma-actin)]. 结论 慢性弓形虫感染对大鼠脊髓神经的损伤机制可能与能量代谢受阻和细胞增殖有关.蛋白差异点有可能成为慢性弓形虫感染的治疗靶点.
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斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原蛋白质分析
目的分析和检测斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原的特异抗原组分,为建立特异、敏感的免疫学诊断方法、研制抗斯氏狸殖吸虫药物和疫苗提供理论基础. 方法用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE) 和免疫印迹(Western blot)等方法,对斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原进行分析. 结果 SDS-PAGE分离出22条蛋白带, 其中主带8条,分子质量单位为13～64 ku,未见65 ku以上条带.Western blot显示20条显色带, 主带6条,分子质量单位分别为 13、18、22、28、35 和 64 ku.2-DE电泳分离出斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原48个多肽斑点, 分子质量单位为14～70 ku,绝大部分分布于pI 3.10～7.14,少数分布于pI 8.78～9.85,在 pI 7.14～8.78之间几乎未见多肽斑点.Western blot分析出其中的10个主要多肽斑点能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别,大部分为集中在酸性区域的小分子多肽. 结论斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原经SDS-PAGE电泳分离出的22条蛋白带中,有6条蛋白含量较高,能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别.2-DE电泳分离出的48个多肽斑点中,有10个含量较高,能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别,大部分为偏酸性的小分子多肽.
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曼氏迭宫绦虫裂头蚴感染早期诊断抗原的研究
目的 寻找曼氏迭宫绦虫裂头蚴感染早期诊断抗原. 方法 从野蛙体内收集曼氏迭宫绦虫裂头蚴,经口接种感染20只昆明小鼠,每只小鼠接种2条裂头蚴,感染后6～28 d隔天尾静脉采血,采用ELISA检测抗裂头蚴抗体;应用双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)与Western blot对裂头蚴可溶性抗原进行分析. 结果 裂头蚴感染后8d,小鼠血清特异抗体阳性率为10％(2/20),感染后14d特异抗体阳性率达100％.2 DE显示,裂头蚴可溶性抗原有255±6个蛋白点,分子质量主要集中在25～～117 ku,其中＞44 ku的蛋白点有171±9个,占总蛋白点数的67.1％;等电点(pI)范围为4～7,其中227个蛋白点集中在pI 5～6.5,占蛋白点总数的89.1％o.Western blot检测有14个蛋白点可被感染曼氏迭宫绦虫裂头蚴14d的小鼠血清识别,其分子质量集中在82、45、36、34及25 ku;1～14号蛋白点所对应的pI值分别为5.93、6.06、6.17、6.30、6.39、5.82、6.01、6.17、5.69、5.46、5.63、6.1、5.71、6.19. 结论 曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性抗原分子质量主要集中在25～117 ku,pI值集中在5.0～～6.5.感染14d的小鼠血清识别的裂头蚴蛋白可作为裂头蚴感染早期诊断候选抗原.
关键词： 曼氏迭宫绦虫 裂头蚴 可溶性抗原 双向电泳 Western blot -
骨髓白血病细胞蛋白质组双向电泳技术的建立与优化
本研究旨在建立和优化人骨髓白血病细胞蛋白质组双向电泳分析方法,以获得分辨率高、重复性好的图谱.提取骨髓中白血病细胞总蛋白质,以等电聚焦为第一向和垂直SDS-PAGE为第二向分离蛋白,显色后用PDQueat7.4软件分析电泳图谱,比较不同的实验条件对图谱的影响.结果显示:通过优化样品制备和电泳中的实验环节,获得了蛋白点分离清晰的图谱,平均蛋白点数为780±73,重复实验所得蛋白点匹配率为82±5%.结论:成功建立了人骨髓白血病细胞的蛋白质组双向电泳分析方法,该方法适用于后续各亚型白血病比较蛋白组学研究.
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双向电泳分析链格孢霉过敏原提取液的致敏蛋白组分
I为7.5～8.5;34×103,PI为6.5～7.0;45×103,PI为7.0～8.0;57×103,PI为6.5～7.5.结论 双向电泳可用于链格孢霉过敏原提取液致敏蛋白组分的分析.
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霍乱弧菌O1群有毒株和无毒株的蛋白质谱特征分析
目的 利用双向电泳和质谱鉴定技术探讨环境和人体中霍乱弧菌蛋白表达的差异.方法 利用适当的裂解液处理霍乱弧菌,提取全菌蛋白;采用pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳;考马斯亮蓝染色后获得双向电泳图谱,并利用ImageMaster 2D Elite 5.0图像分析软件进行分析,所得的数据采用SPSS15.0进行统计分析,找出差异蛋白;在此基础上,胰蛋白酶消化这些特殊差异蛋白,并进行质谱(MALDI-TOF-MS)分析.结果 获得1032±22个蛋白斑点,蛋白主要集中在等电点(PI)4.00～7.20之间,重复胶的匹配点数为1025±24,匹配率为96.30%;发现了有明显差异的21个蛋白点,并用质谱鉴定了其中4种蛋白.结论 获得了环境和人体中霍乱弧菌蛋白的差异表达蛋白.
关键词： 霍乱弧菌 双向电泳 基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱 蛋白质组学 -
感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体外膜蛋白抗原表达差异性
目的 了解感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白表达变化,为选择钩体基因工程疫苗候选抗原提供依据.方法 采用Triton X-114法提取感染THP-1细胞前后问号钩体黄疸出血群赖型赖株外膜蛋白.采用双向电泳技术分离钩体外膜蛋白,银染色法检测感染前后钩体外膜蛋白表达量及其差异.感染细胞后4个表达显著上调和4个表达显著下调的钩体蛋白点胰酶水解后,采用LC-MS/MS方法进行鉴定.应用生物信息学软件分析靶蛋白跨膜区和信号肽,采用实时荧光定量RT-PCR检测感染细胞前后靶基因mRNA水平变化.构建靶基因原核表达系统,采用钩体感染豚鼠模型了解重组靶蛋白的免疫保护作用.结果 感染THP-1细胞60 min后,问号钩体赖株外膜蛋白中Loa22、GroEL、F0F1 ATP合成酶α和β亚单位表达水平均显著升高(P＜0.05),FluB2、LigB、OmpA和OmpA家族蛋白表达显著下降(P＜0.05),实时荧光定量RT-PCR检测结果与之基本一致.生物信息学分析结果显示,上述8个外膜蛋白中,OmpA和OmpA家族蛋白为跨膜蛋白,其余均无跨膜结构,Loa22、LigB和OmpA家族蛋白含有信号肽.200 μg重组表达的靶蛋白 rLoa22或rGroEL对豚鼠的免疫保护率均为75.0％.结论 问号钩体赖株感染细胞时外膜蛋白表达谱可发生明显变化.感染后高表达的钩体外膜蛋白尤其是GroEL和Loa22,可作为钩体基因工程疫苗侯选抗原.
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皮质发育不良大鼠差异蛋白的筛选及其致痫作用的探讨
目的 寻找皮质发育不良大鼠脑组织(皮质和海马)与正常对照组织在不同发育阶段的差异表达蛋白质,探讨这些蛋白质在皮质发育不良所致癫痫发生机制中的作用.方法 妊娠晚期(孕17d)Sprague-Dawley大鼠腹腔注射卡莫司汀(15 mg/kg)诱导仔鼠皮质发育不良.提取新生期(出生后7d,记作P7)及成年仔鼠(p60)新皮质及海马组织蛋白,运用双向凝胶电泳技术构建卡莫司汀诱导皮质发育不良鼠和正常鼠皮质及海马组织在新生期及成年期的蛋白质表达谱,通过比对分析筛选出差异表达的蛋白质斑点.应用MALDI-TOF-MS技术平台对差异为显著的部分蛋白进行鉴定.结果 在模型组和对照组之间共筛选出57个差异表达蛋白质斑点(P ＜0.05,35个来自新生期,22个来自成年期),其中35个在模型组表达上调,22个在模型组表达下调.12个蛋白质斑点得以成功鉴定,包括微管蛋白、肌动蛋白、胶质纤维酸性蛋白、生长相关蛋白43、广泛型线粒体肌酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和脑型原肌球蛋白等蛋白或其亚单位线粒体肌酸激酶广泛型亚型.结论 鉴定的蛋白质参与细胞骨架构成、突触形成和线粒体功能活动等多种生理过程,它们的表达改变可能在皮质发育不良致癫痫发生的机制中发挥重要作用.
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2型糖尿病地鼠肝组织蛋白质组学研究
目的探讨2型糖尿病发生、发展相关的蛋白质,及其胰岛素信号传递系统组成的差异.方法将糖尿病地鼠作为实验组,昆明种封闭群正常小白鼠作为对照组,在注射胰岛素0、5、30、60及120 min五个不同时间点分别测定每只小鼠的对应时间的血糖值.采用蛋白质组学技术筛选差异蛋白.结果不同时点血糖值实验组显著高于对照组(P 《0.01),且实验组血糖下降速度缓慢;胰岛素作用后,糖尿病小鼠肝组织蛋白质发生明显改变,主要表现为2-DE图谱中蛋白质斑点的增减以及颜色的深浅上,初步筛选出6个与胰岛素细胞信号转导相关的蛋白质,包括RAF1、BTF3 、SEC1、PAR2、MK10及TRAF2.结论 2型糖尿病地鼠存在胰岛素抵抗,与胰岛素细胞信号转导相关的差异蛋白可能是糖尿病病理生理机制的分子基础.
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偏头痛肝阳上亢证大鼠肾上腺蛋白质双向电泳图谱的分析
目的 探寻偏头痛肝阳上亢证大鼠相关蛋白.方法 将SD大鼠随机分成正常组及偏头痛肝阳上亢证组(简称模型组).通过对肾上腺组织蛋白质的提取,经双向电泳,Pdquest软件分析,蛋白质点原位酶解及质谱分析.结果 发现模型组与正常组大鼠肾上腺总蛋白质的分布模式非常相似,以PI3-8,分子量Mr14.4～75kD范围的蛋白质斑点分布多.经PDQuest 7.0软件分析后得出,在相同条件下识别的蛋白质斑点数分别为正常组(584±25)个,模型组(686±27)个.选取表达有显著差别的12个蛋白质斑点进行酶解和质谱分析,所得结果在网上搜寻,其中有9个点的蛋白质与之匹配.结论 表明模型组与正常大鼠肾上腺蛋白质的表达具有差异,经质谱鉴定的9个蛋白质可能与偏头痛肝阳上亢证的形成有关.这为进一步研究偏头痛发病机制打下了基础.
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福氏志贺杆菌2a 2457T免疫蛋白质组学方法的建立
目的:建立福氏志贺杆菌2a 2457T的免疫蛋白质组学研究方法.方法:提取福氏志贺杆菌2a 2457T全菌蛋白进行不同pH梯度的双向电泳,结合Western Blotting技术寻找发生免疫反应的蛋白质.结果:蛋白经胶内酶切后使用基质辅助激光解析/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱鉴定了19个免疫反应蛋白点,对应于10种蛋白质.结论:该文成功建立了福氏志贺杆菌2a2457T的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原的工作打下了基础.
关键词： 福氏志贺杆菌 Western blotting 免疫蛋白质组学 双向电泳 质谱 -
志贺菌基因转移耐多药相关蛋白初步分析
目的:对志贺菌敏感株与基因转移耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组学比较,寻找细菌耐多药相关蛋白.方法:采用接合基因转移实验对临床分离鉴定志贺菌敏感株进行基因转移耐多药试验,并对志贺菌敏感株及基因转移耐多药株全菌蛋白进行双向电泳;电泳图谱采用Image Master 2D Platinum软件分析,并对差异表达蛋白进行MOLDI TOF-TOF质谱分析.结果:成功获得志贺菌基因转移耐多药株,在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出946±37个和1013±157个蛋白质斑点;经分析共发现43个差异表达的蛋白点,初步对其中5个表达量增加的差异蛋白进行质谱鉴定,基因转移耐多药株中发现两个新出现的耐多药相关蛋白分别为CRISPR相关蛋白及Hsp60的分子伴侣蛋白(Groel-Groes-Adp7);ABC转运蛋白、胱氨酸合成酶、预测的胞浆脂蛋白表达量上调.结论:通过对鉴定的5个耐多药相关蛋白分析初步发现供体菌中一些耐多药相关基因通过基因转移方式插入志贺菌敏感株中并大量表达,同时一些在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调,ABC转运蛋白在志贺菌基因转移耐多药机制中也起重要作用.
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蛋白质组学技术在幽门螺杆菌研究中的应用
蛋白质组学是旨在研究蛋白质表达谱和蛋白质与蛋白质之间相互作用的新领域.他的研究以双向电泳和质谱技术为核心.其技术为幽门螺杆菌基本生物学特性研究,探讨致病机制,寻找保护抗原与研究免疫机制等提供了新的思路和方法.
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高低转移表型大肠癌细胞株蛋白质表达谱差异初步分析
目的:应用蛋白质组学技术分析高低转移表型大肠癌SW480细胞株和LoVo细胞株间的蛋白质表达谱差异.方法:以双向电泳技术分离两种细胞株总蛋白质,银染显色,进行差异蛋白质分析.结果:SW480和LoVo细胞株双向电泳图谱蛋白质点数分别为1184±47和1124±54,共获得88±5的蛋白质差异点,其中48±3个点仅在SW480细胞株中表达或表达明显增强,41±3个点仅在LoVo细胞中表达或表达明显增强.结论:高低转移表型大肠癌SW480细胞株和LoVo细胞株间的蛋白质表达谱存在一定的差异,对这些差异点进行鉴定将为研究大肠癌转移机制提供一定的线索.
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食管鳞癌clusterin表达及其临床意义
目的:探讨食管鳞癌组织clusterin表达和单纯手术治疗前后外周血clusterin含量变化与食管鳞癌临床参数的相关性.方法:RT-PCR分析5对食管鳞癌及其远端切缘食管上皮中clusterin基mRNA表达水平;ELISA分析41例单纯手术治疗食管鳞癌患者治疗前后的血清clusterin蛋白表达水平及其与临床特征的相关性.结果:与正常食管上皮相比食管鳞癌组织中clusterin基因表达显著下降或缺失.食管鳞癌患者术前血清中clusterin含量明显低于术后血清含量(3.23 mg/Lvs 25.71 mg/L,P<0.0001).食管鳞癌患者术前血清clusterin含量与肿瘤大小相关(P<0.01),而与年龄、性别、分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移.以及总蛋白、白蛋白、血糖、血脂和总胆红素浓度无关(r=-0.1334,-0.1602,0.2413,0.0389,-0.2882,均p>0.05).结论:clusterin基因在食管鳞癌组织中表达明显下调或缺失,血清clusterin含量明显降低,提示在食管鳞状细胞癌中clusterin基因可能具有潜在的抑癌基因作用,动态检测外周血clusterin含量有助于判断食管癌进展.
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人胰液蛋白质组的双向电泳
目的 建立优化的用于胰液蛋白质组研究的双向电泳方法.方法 经内镜逆行胰胆管造影(ERCP)术收集纯胰液标本5例,分别进行多次双向电泳,比较不同标本保存时间、制备方法、泡胀液组成、固相pH胶条、等电聚焦条件及染色方案等因素对双向电泳图谱质量的影响.结果 胰液标本在-80℃保存4个月做双向电泳对图谱没有明显影响.根据图谱质量比较,三氯乙酸/丙酮沉淀继以含硫脲的泡胀液复溶是优化的标本制备方法;应用窄范围固相pH胶条可以在增加标本上样量的同时改善分辨率;银染和兼容质谱的银染方案所获得的图谱同样具有良好的重复性和分辨率;不同病理状态的胰液标本的双向电泳图谱表现出一定程度的相似性.结论 标本制备是胰液双向电泳的关键,优化的方法可以获得重复性好、分辨率高的双向电泳图谱,为不同病理状态下胰液蛋白质组学差异的研究奠定基础.
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甲状旁腺激素间歇性应用对大鼠成骨细胞分泌组的影响
目的 利用蛋白质组学技术研究甲状旁腺激素(PTH1-34)对大鼠成骨细胞分泌组的影响,为进一步研究唧促成骨作用机制、寻找新的骨代谢调节因子打下基础.方法 将大鼠成骨细胞分为PTH刺激组和对照组分别培养,收集第三周期6h末和24h末的无血清培养液,用透析-丙酮沉淀法富集培养液中的分泌蛋白质,然后通过双向电泳寻找差异蛋白,再通过质谱分析和数据库检索鉴定两组样品中差异蛋白的种类和性质.结果 6h末和24h末PTH刺激组的分泌组均有明显改变,初步鉴定其中23个差异表达蛋白,发现它们分别属于细胞骨架蛋白、翻译调控相关蛋白、蛋白降解相关蛋白、信号转导相关蛋白、热休克蛋白/分子伴侣、抗氧化酶、胰岛素样生长因子结合蛋白及与糖、脂代谢相关的酶等.结论 PTH间歇性应用可使成骨细胞分泌组发生明显改变,这些蛋白可能与PTH促成骨作用相关,本研究为进一步研究PTH促成骨机理、寻找新的骨代谢调节因子提供了实验依据.
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结核分枝杆菌蛋白质组学的研究进展
蛋白质组学是整体、动态、定性、定量地研究所有蛋白质的组成、功能和相互关系的一门新兴学科,其核心技术是双向电泳、生物质谱和生物信息学.MTB蛋白质组学研究是当前研究的热点之一.MTB的H37Rv全基因组序列约441Mbp,4000个基因,3924个可读框,其中大部分用于编码脂类代谢酶,10%编码两大类不相关的富含甘氨酸的酸性蛋白,可能与产生抗原变异和免疫逃逸有关.现将MTB的蛋白质组学研究进展综述如下.
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双向电泳结合免疫印迹技术分析蜉蝣变应原
目的 用双向电泳和免疫印迹技术(Western blot)对蜉蝣提取液蛋白质组分进行分析,寻找蜉蝣主要致敏蛋白质.方法 提取蜉蝣总蛋白,应用双向电泳结合免疫印迹技术,获得相应的电泳图谱和免疫印迹图谱,免疫印迹一抗为蜉蝣过敏患者血清,二抗为鼠抗人IgE抗体.结果 蜉蝣蛋白质提取液经双向电泳后,考马斯亮蓝染色,电泳图谱显示约805个主要蛋白点.相对分子质量约为20 000~130 000;等电点主要集中在4.0~9.5.免疫印迹结果显示,阳性患者组与对照组的差异蛋白点数约为27个.结论 双向电泳联合免疫印迹技术对蜉蝣提取液蛋白质组分分析具有实用价值,并可进一步用于变应原致敏组分的研究.
