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用PCR指纹图技术分析焦化废水接触氧化池中悬浮污泥和生物膜的微生物种群组成
目的:应用分子生物学方法,以处理焦化工业废水(A2/O生物膜工艺)中的悬浮污泥和生物膜的微生物群落作为研究对象,分析不同环境微生物群落的组成差异.方法:首先提取群落的总DNA,获得ERIC-PCR和LP-RAPD指纹图谱并进行对比分析,然后结合群落探针杂交的技术,检查同样迁移率的条带的序列同源性,运用UVIBAND/MAP软件比较所得群落指纹图谱的相似性指数,从而可以得到群落差异的量化结果.结果:焦化废水接触氧化池中,悬浮污泥和生物膜的微生物群落组成存在相当大的差异.结论:通过这种差异的比较分析,有可能让我们更准确地了解氧化池中微生物的群落组成情况,有利于分析其与系统功能的关系.
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基于ERIC-PCR指纹图谱技术的小鼠肠道菌群失调分析方法的建立
目的 采用常规菌群分析方法和ERIC-PCR技术对正常小鼠和抗生素相关性腹泻小鼠模型分别进行肠道菌群检测,结合细菌培养和DNA指纹图谱检测结果分析小鼠肠道内主导菌群数量和种类的改变情况,建立利用ERIC-PCR技术分析小鼠肠道菌群失调的检测方法.方法 先利用常规菌群分析方法鉴定正常小鼠和抗生素相关性腹泻小鼠的菌群状况,再提取其基因组DNA,后以肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)为模板,利用ERIC-PCR方法获得正常小鼠和模型小鼠的肠道菌群指纹图谱,与常规菌群分析结果作比较,验证ERIC-PCR技术的准确性.结果 常规菌群分析结果表明四种优势菌群在数量上出现明显的变化,证实造模成功.经ERIC-PCR技术成功获得两组小鼠粪便基因组DNA图谱,两组间呈现具有一定对比性的特异性指纹图谱.结论 从小鼠粪便基因组经ERIC-PCR后的图谱中特异性条带的分布、数目和亮度来看,能说明肠道菌群的分布状况存在明显差异,结合常规菌群分析方法作对比,说明ERIC-PCR技术是一种分析小鼠肠道菌群失调高效快捷的检测方法.
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ERIC-PCR指纹图谱技术分析糖尿病小鼠肠道细菌群落变化
目的 通过比较1型糖尿病模型组和空白对照组雄性小鼠肠道菌群结构的变化,探索糖尿病造模与肠道菌群的关系.方法 收集造模2周后空白对照组(n=5)、STZ造模成功组(n=5)和造模不成功组(n=3)ICR小鼠的新鲜粪便样品,提取粪便样品的总DNA,ERIC-PCR扩增形成DNA指纹图谱,借助多变量统计分析方法研究各组样品肠道菌群结构上的异同.结果 ERIC-PCR指纹图谱结合偏小二乘法(PLS-DA)分析表明造模成功组和造模不成功组小鼠的肠道菌群结构显著区别于空白对照组,而造模不成功组小鼠的肠道菌群结构与造模成功组仍有一定的区别.结论 STZ诱导的1型糖尿病会造成小鼠的肠道菌群结构的变化,而部分小鼠造模失败可能与这些小鼠的肠道菌群结构有关.
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膳食诱导肥胖大鼠模型的肠道菌群结构及其特异分子标识物
目的 通过对膳食诱导肥胖(Diet Induced Obesity,DIO)大鼠与健康对照组大鼠的肠道菌群结构的分析比较,寻找造成2组大鼠菌群结构差异的分子标识物,探讨肠道菌群的组成和结构与宿主肥胖之间的关系.方法 ERIC-PCR结合Southern-blot得到肠道菌群基因组指纹图谱,利用Southern-blot与多元统计方法(PCA、PLS等)找出差异条带,回收差异条带进行测序,根据序列设计特异性引物,以定量PCR法对结果进行验证.结果 ERIC-PCR图谱表明膳食诱导肥胖大鼠在肠道菌群结构上与正常大鼠存在着较大的区别;根据杂交结果找到一段基因组DNA片段为膳食诱导肥胖大鼠组所特有,定量分析表明该DNA片段在2组大鼠间区别明显.结论 膳食诱导肥胖大鼠所特有的一段基因组DNA片段可作为肥胖大鼠肠道的特征分子标识物,该标识物有望用于膳食诱导肥胖的机制研究中.
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腹泻儿童肠道菌群结构特征的ERIC-PCR指纹图分析
目的:了解以粪检有无白细胞区分的两类腹泻儿童肠道菌群结构的特征及其与健康儿童的差别.方法:提取健康儿童(H)、临床门诊粪检无白细胞的腹泻儿童(L-)和粪检有白细胞的腹泻儿童(L+)(各11例)粪便总DNA作模板,获得反映肠道菌群组成特征的ERIC-PCR指纹图谱.结果:以H、L-和L+为序,每类样品以独特的ERIC条带为代表的操作分类单元(OTU)的总数分别为54∶47∶26;每类样品ERIC图谱多样性指数范围分别为:2.45±0.14,2.11±0.18和1.76±0.19.组内成对相似性系数累积曲线分析:小于0.6的CS值在L-组占到总Cs值个数的70%,在H组占50%,而在L+组只占30%.结论:腹泻儿童肠道的菌群结构多样性降低,粪检有白细胞腹泻个体较之粪检无白细胞腹泻个体肠道菌群结构偏离健康个体更远.
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DNA指纹图技术分析微生物肥料菌种组成稳定性
目的分析2种市售微生物肥料在不同生产批次中微生物菌种组成的稳定性.方法利用ERIC-PCR基因组DNA指纹图技术和16S rDNA V3扩增一温度梯度凝胶电泳(PCR-TGGE)指纹图技术.结果这2种微生物肥料在同一个生产批次不同包装之间的2种DNA指纹图谱相似性较高,分别在78%～95%和96%～100%,表明同一个批次内的菌种组成比较一致.但其在不同的生产批次之间菌种组成差异存在显著性,反映在2种DNA指纹图谱上,不同生产批次样品间ERIC-PCR指纹图相似性低只有10%,PCR-TGGE指纹图相似性低为46%.结论通过ERIC-PCR和PCR-TGGE DNA指纹图技术可以对微生物肥料中菌种组成的稳定性进行快速、准确的分析,如何保持菌种组成在批次之间的稳定一致,是复合菌种微生物肥料质量控制中面临的难题.
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使用ERIC-PCR技术检测嗜酸乳杆菌
目的 利用ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus)-PCR技术,设计引物,特异性检测嗜酸乳杆菌.方法 以本实验室保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SYP-B2340基因组DNA为模板,通过四因素三水平正交试验,优化嗜酸乳杆菌ERIC-PCR反应体系,对所获得的PCR条带进行测序和分析,进一步设计特异性引物,实现对嗜酸乳杆菌的特异性鉴别.结果 通过四因素三水平正交实验,成功优化ERIC-PCR反应条件;根据ERIC-PCR片段,设计三对特异性引物,可在多种混合基因组DNA中灵敏鉴别出嗜酸乳杆菌.结论 基于ERIC-PCR设计的特异性引物,可简便、快速的鉴定嗜酸乳杆菌.
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重症监护病房老年患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因分析
目的 为了解重症监护病房(ICU)老年患者感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子流行病学特点、菌株的变异情况及耐药性.方法 采用K-B法药敏实验、SCCmec多重PCR技术和ERIC-PCR技术对13株呼吸道感染老年患者MRSA进行分析,并运用NTSYS-PC2.0对ERIC-PCR扩增产物结果进行聚类分析.结果 13株MRSA中,12株鉴定为SCCmecⅠA型,1株鉴定为SCCmecⅡ型.13株MRSA的DNA同源性在44%到88%之间,同源性在69%以上可分为3类.结论 ICU老年患者感染的MRSA主要流行型为SCCmec IA型,但是并不存在聚集性人群感染发生.
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ERIC-PCR 多重PCR 基因分型 -
菊苣提取物对高甘油三酯并高尿酸血症模型大鼠肠道菌群的影响
目的：观察菊苣提取物对高果糖饮水诱导的高甘油三酯并高尿酸血症大鼠尿酸、甘油三酯、总胆固醇水平的影响，并从肠道菌群新的视角探讨菊苣提取物干预高甘油三酯并高尿酸血症模型的特点。方法：雄性SD大鼠按体重随机分为6组，即正常组，模型组，菊苣高剂量组，菊苣低剂量组，非诺贝特组，苯溴马隆组。正常组给予自来水，其余各组均给予10％果糖水，生化法检测血清尿酸、甘油三酯、总胆固醇指标，ERIC－PCR指纹图谱分析各组肠道菌群宏观结构变化。结果：与正常组相比，造模第7天，模型组血清TG水平显著升高；造模第14天，模型组血清TG水平显著升高，血清UA水平有升高趋势；造模第21天，大鼠血清TG、UA均显著升高，大鼠高甘油三酯并高尿酸血症模型塑造成功。与模型组相比，实验第14天，菊苣高剂量，菊苣低剂量，非诺贝特，苯溴马隆均显著降低血清TG水平；实验第21天，菊苣高剂量组显著降低血清TG、UA水平；菊苣低剂量组有降低血清TG和UA水平的趋势；非诺贝特组显著降低血清TG水平；苯溴马隆组显著降低血清UA水平。 ERIC－PCR指纹图谱显示：与正常组相比，模型组肠道菌群结构发生了显著变化，而菊苣高、低剂量组对肠道菌群有干预作用。结论：菊苣提取物治疗高甘油三酯并高尿酸血症作用显著，并可改善紊乱的肠道菌群，说明菊苣提取物可能通过调节肠道菌群发挥治疗作用，具体机制有待于进一步深入研究。
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中药复方对醋酸胃溃疡脾虚大鼠的治疗作用比较
ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR)指纹图谱方法研究四君子汤、理中汤、补中益气汤、益胃汤四种中药复方对醋酸胃溃疡脾虚大鼠的治疗作用.方法:利用食醋灌胃塑造大鼠醋酸胃溃疡脾虚模型,分别提取大鼠健康、模型和复方中药治疗后粪便中的肠道菌群总DNA,并进行ERIC-PCR,建立醋酸模型脾虚大鼠肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱,确定其相关特征条带,以各阶段特征条带的净面积和相似性系数为指标,比较四种复方对醋酸胃溃疡脾虚大鼠的治疗作用.结果;益胃汤低中高剂量和四君子汤中剂量治疗后,特征条带500bp净面积显著性降低,相似性系数与模型组相比显著性增加,疗效较好.结论:醋酸模型脾虚主要造成胃溃疡,单纯补气健脾中药治疗效果不明显,益胃汤通过滋养脾胃,对胃溃疡型脾虚有较好治疗效果.
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快速提取肠道微生物基因组DNA的方法
目的:肠道微生物的研究日益成为热点,如何获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA是肠道微生物研究中的关键.本文通过对酚/氯仿法提取总DNA过程进行考察和优化,建立一种简便酚/氯仿抽提法.方法:考察和优化酚/氯仿法提取总DNA的过程,并根据DNA产量、纯度以及ERIC-PCR及16S rNDA-RFLP所反映的微生物群落结构特性的指标,并与QLAamp?DNAStoo1 Mini Kit提取的进行比较,评价了所建立的快速提取方法.结果:用简便酚/氯仿法得到基本完整的基因组DNA,ERIC-PCR和16S rDNA-RFLP结果与QIAamp?DNA Stool Mini Kit法基本相同.结论:该方法快速并成本低,适合肠道微生物研究中总DNA提取,尤其适合处理大批量的样品.
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食源性致病菌单增李斯特菌检测技术研究进展
单增李斯特菌是一种致病菌,且由于其强大的繁殖和生存能力,广泛存在于自然界.单增李斯特菌可导致人畜共患病,严重阻碍了食品工业的发展,得到世界各地的广泛关注.因此检测单增李斯特菌以预防其感染动物和人类的检测方法和技术显得至关重要,人们渴望找到一种高效并准确检测单增李斯特菌的有效方法.如今,借助于许多科研工作者的努力,许多检测技术和方法已问世或处于探索之中.例如,传统检测技术被许多地方如国家食品药品监督管理局所采用,但耗时过久无法适应食品工业的迅速发展;许多被实验证明有效的快速检测技术耗时短,却面临着如高成本或低灵敏度等其他急需解决的缺点以便于推广应用.总的来看,许多新的检测技术与免疫学方法、生物传感器、PCR或其它先进技术有关,基于不同的原理有不同的特点和适用领域.文章整合近年来国内外单增李斯特菌检测技术的研究进展成果或调研,对目前国内外较为常用的检测方法如传统培养检测法、生物传感器法、环介导等温扩增技术、PCR-RFLP法或ERIC-PCR等的作用机制、检测效果和优缺点等进行对比,让相关工作者对目前的单核增生李斯特氏菌检测方法及进展有一个全面的了解,帮助相关工作者更好的选择相应检测技术或对具潜在价值的某一技术进行进一步的探索.
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碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及分子流行病学研究
目的：探讨临床分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药基因及分子流行病学研究。方法收集并鉴定临床分离非重复碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌株44株。采用Vitek 2 compact全自动微生物鉴定药敏分析仪鉴定进行常规药敏试验，改良Hodge试验检测KPC型碳青霉烯酶，EDTA协同法检测金属β-内酰胺酶，聚合酶链反应（ PCR ）法检测细菌携带的耐药基因。肠杆菌基因间重复性共有序列ERIC-PCR对菌株进行同源性分析，了解其分子流行病学特征。结果44株肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗菌药物显示了较高的耐药性。改良Hodge试验阳性41株，金属酶检测试验结果均为阴性。 PCR结果显示，临床分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌以KPC-2型为主，共42株。 ERIC-PCR将44株肺炎克雷伯菌分为14型，以Ⅰ型为主，共18株，集中于重症监护室（ ICU）和神经外科。结论分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物表现出高水平耐药；其耐药机制主要是该类细菌产KPC-2碳青霉烯酶，ICU 与其它科室的患者频繁转诊治疗可能是导致碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌在全院范围播散流行的主要原因。
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重症监护病房分离大肠埃希菌耐药性及分子流行学检测
目的 了解重症监护病房(ICU)分离大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药性及分子流行病学特征.方法 采用BD pheonix100全自动微生物分析仪对大肠埃希菌进行药物敏感性测定,ERIC-PCR方法进行分子流行病学检测.结果 大肠埃希菌对亚胺培南极为敏感,耐药率为0,其次为呋喃妥因、哌拉西St,/三唑巴坦和阿米卡星耐药率在30%以下,其余抗菌药物耐药率均在70%以上.ERIC-PCR结果显示9株大肠埃希菌分为五种型别,菌株数分别为3、2、2、1、1.结论 ICU分离大肠埃希菌多重耐药显著,但对亚胺培南非常敏感,菌株间存在克隆传播.
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ERIC-PCR用于鲍曼不动杆菌基因同源性分析
目的 建立一种快速、简便、准确的基因分型方法,对鲍曼不动杆菌进行基因分型.方法 采用肠杆菌重复基因保守序列(enterbacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)PCR技术,对38株各个科室来源的鲍曼不动杆菌菌株进行基因分型研究,并比较抗生素耐药结果.结果 38株鲍曼不动杆菌表现为8种基因型13种耐药模式,鲍曼不动杆菌的耐药模式和基因型之间无明确相关性.结论 ERIC-PCR技术可用于鲍曼不动杆菌的基因分型,可用于追踪基因同源性和分子流行病学调查.
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耐复方新诺明嗜麦芽窄食单胞菌耐药基因检测及同源性分析
目的：探讨嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株耐复方新诺明的耐药机制及同源性。方法2013年1月至2013年12月共分离获得126株嗜麦芽窄食单胞菌，药敏试验采用 K-B法。 PCR法检测sul1、sul2、ISCR2、I类整合子。并对I类整合子PCR扩增阳性产物进行测序分析，确定基因型， ERIC-PCR对其同源性进行分析。结果嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明的耐药率为17.4％。22株耐药菌有16株sul1阳性，15株I类整合子阳性；未发现sul2、ISCR2阳性株。22株耐药株分为21个基因型。结论本院嗜麦芽窄食单胞菌耐复方新诺明与sul1和I类整合子高度相关，与 sul2、ISCR2无关，耐药菌株之间无遗传相关性。
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多重耐药铜绿假单胞菌整合子和ISCR1结构及基因分型研究
目的:研究临床分离的铜绿假单胞菌的整合子I和ISCR1的分布情况,并进行ERIC-PCR基因分型.方法:分离临床80株铜绿假单胞菌,ERIC-PCR进行基因分型.PCR检测整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ、ISCR1以及ISCR1携带的耐药基因.结果:铜绿假单胞茵分为51个基因型,26株整合酶阳性,21株整合子Ⅰ阳性,2株ISCR1和ISCR1携带的耐药基因阳性.结论:铜绿假单胞茵的整合子Ⅰ和ISCRI携带率较低,临床可用ERIC-PCR进行铜绿假单胞菌的基因分型.
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产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药基因研究及其基因分型
目的：对临床分离产ESBLs肺炎克雷伯菌相关基因进行研究，并对其进行基因分型。方法：临床分离295株肺炎克雷伯菌，ESBLs药敏试验采用K-B法。PCR法检测I类整合酶、I类整合子基因盒、ISCR1、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M。I类整合子PCR扩增阳性产物送去测序，测序结果在GenBank中用blastn进行核酸序列同源性搜索。菌株基因分型采用ERIC-PCR法。结果：产ESBLs肺炎克雷伯菌阳性率为21.3%。在63株产ESBLs肺炎克雷伯菌中，分为35个基因型，I类整合酶、ISCR1、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M的阳性率分别为46.0%、12.7%、55.6%、0、81.0%，27个I类整合子含有7种类型基因盒。结论：在产ESBLs肺炎克雷伯菌中，I类整合子携带率较高，ESBLs基因型以blaTEM和blaCTX-M为主。我院产ESBLs肺炎克雷伯菌存在某种流行株。
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副溶血性弧菌ERIC-PCR分型技术研究
目的:应用肠杆菌基因间重复序列PCR,对不同来源的副溶血性弧菌进行鉴定、药敏和分型,探讨方法的实用性,为流行病学溯源,减少疾病的发生提供依据.方法:海产品VP分离,采用PCR筛检;腹泻病人分离,采用弧菌显色平板.可疑菌落采用氧化酶、无盐、6% NaCl胨水和蔗糖等生化试验初筛,VITEK-32或API 20E生化条鉴定、确认.分型采用ERIC-PCR法,药敏采用纸片法.结果:VP菌株的生物学特征典型,生化反应稳定.药敏试验显示,对常用抗生素敏感,可选用头孢类、氨基糖苷、喹诺酮类等抗生素进行治疗.ERIC-PCR将261株VP分成42个型,其中18型和26型为优势型.结论:分型结果显示,来源于食品和环境的VP型别多、散,同源性差异较大,病人株则反之,型别集中,同源性近,相关性大,提示ERIC-PCR能对VP进行分型和溯源,其优势基因型可能与致病性有关.
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武汉市6起食物中毒副溶血弧菌分子特征研究
目的:了解武汉地区6起食物中毒病原菌副溶血弧菌分子特征.方法:对6起食物中毒共16株分离株进行药敏分析,运用PCR技术进行耐热性溶血毒素基因(tdh)和耐热性溶血毒素相关溶血素基因(trh)检测,并进行肠道细菌重复基因间共同序列PCR(ERIC-PCR)分析.结果:16株副溶血弧菌对第三代头孢和喹诺酮类较敏感,tdh阳性,trh阴性,ERIC-PCR结果显示每起食物中毒菌株亲缘关系非常紧密,有3起属于同一个群,另外2起属于一个群.结论:武汉地区流行的主要副溶血弧菌分子特征为tdh阳性,trh阴性,ERIC-PCR技术是分析副溶血弧菌引起食物中毒菌株非常有效的工具.
关键词： 副溶血弧菌 药敏试验 耐热性溶血毒素 耐热性溶血毒素相关溶血素 ERIC-PCR
