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梅毒螺旋体膜蛋白Tp0971激活MAPKs和NF-κB诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β
目的:探讨梅毒螺旋体(Tp)膜蛋白Tp0971诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的分子机制.方法:课题组前期表达的Tp0971重组蛋白为研究对象,将不同浓度的重组Tp0971刺激巨噬细胞,分别采用ELISA和实时定量PCR检测TNF-α和IL-1β的分泌及其mRNA的表达.采用Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)p38,ERK1/2以及JNK1/2的磷酸化,并用相应的抑制剂处理观察TNF-α和IL-1β的变化.同时采用Western blot观察核转录因子κB(NF-κB)的核转位情况,并采用抑制剂处理观察其在介导TNF-α和IL-1β分泌中的作用.结果:ELISA结果显示,重组Tp0971能在0.5～10μg/ml剂量范围内诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β.并能促进其mRNA表达,采用转录抑制剂放线菌素D(ActD)或翻译抑制剂放线菌酮(CHX)处理后,TNF-α和IL-1β的转录和分泌水平显著降低.Tp0971也可诱导p38,ERK1/2以及JNK1/2磷酸化,采用其相应的抑制剂处理后,TNF-α和IL-1β分泌明显减少.Western blot结果也显示Tp0971能诱导NF-κB p65亚基核转位,采用NF-κB抑制剂PDTC处理后,TNF-α和IL-1β分泌水平降低.结论:Tp0971激活MAPKs和NF-κB诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β.
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尿微量蛋白检测项目的临床选择和评价
尿微量蛋白指用日常检验尿蛋白的方法不能发现而需用高度灵敏而特异的方法才能检出的尿中所含的少量蛋白.其种类很多,大多数属血浆的固有成分,如白蛋白、免疫球蛋白和微球蛋白等,也有肾小管产生的膜蛋白和某些疾病产生的蛋白等.各医院常根据需要,选定需检查的蛋白种类.
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急性脑出血患者血清和脑脊液髓鞘碱性蛋白动态变化
髓鞘碱性蛋白(MBP)是神经髓鞘特有的膜蛋白.在急性脑实质性破坏或脱髓鞘病变时,血清和脑脊液中MBP含量升高.对血清和脑脊液MBP含量测定,可以反映急性脑实质性损伤的程度[1,2].但对血清MBP与脑脊液MBP(CSF-MBP)是否相关,文献[3,4]报道不一致.本文以急性脑出血作为脑实质性损伤的模型,采用酶联免疫吸附法,通过同时监测脑出血过程中血清MBP和CSF-MBP的动态变化,为了解血清MBP和CSF-MBP对急性脑实质性损伤的诊断意义提供实验证据.
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基底膜蛋白在口腔粘膜扁平苔癣中的表达
扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)是一种原因不明慢性浅在性炎症的角化性病变.它可以单独发生在口腔粘膜,也可以同时伴发皮肤损害,它有一定的恶变率,属于癌前状态.
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Ⅱ型高尔基体膜蛋白GP73的研究进展
高尔基体在真核细胞中发挥着重要作用,在既往的研究中,发现了很多高尔基体相关蛋白以及高尔基体膜蛋白,其中有许多都参与粗面内质网蛋白合成或运输过程,但具体的功能尚不明确.在探究高尔基体相关蛋白功能的时候,一种Ⅱ型高尔基体膜蛋白(TypeⅡGolgi membrane protein,Golph2) 引起了研究者的高度关注.因Golph2多克隆抗血清能够特异性识别人类上皮细胞裂解物中大小为7.3×104的蛋白分子,故又将这种蛋白称为GP73(Golgi protein-73).
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人前列腺癌PC-3M细胞中与转移相关靶标蛋白的筛选
目的 探讨早期诊断前列腺癌和逆转前列腺癌转移的标志物.方法 采用一维SDS-PAGE结合高效液相色谱-串联质谱的方法分离并鉴定PC-3M细胞中的膜蛋白.结果 在严格的过滤参数条件下(当Charge+1,Xcorr≥1.9;当Charge+2,Xcorr≥2.2;当Charge+3,Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1),PC-3M细胞中鉴定出2 023个蛋白,其中1391(69%)个蛋白经过基因本体评注(GOA)显示为已知细胞组分,其余为未知细胞组分.在已知细胞组分中527(38.30%)个蛋白为膜蛋白或者膜相关蛋白,其中18.32%的蛋白被预测至少有1个跨膜区,49.62%的蛋白有1～3个跨膜区,19.08%的蛋白有4～9个跨膜区.9.92%蛋白预测有≥10个跨膜区.除了已知的与膜相关的蛋白,很多新的蛋白也被鉴定,其中包括假设蛋白和一些cDNA序列.结论 一种明显独特的质膜蛋白表达模式存在于高转移前列腺癌细胞系中.这将帮助进一步理解前列腺癌侵袭和转移的分子机制.并且为寻找前列腺癌转移相关的靶标分子提供实验基础.
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缝隙连接蛋白Cx43在神经系统领域研究进展
缝隙连接(gap junction,GJ)通道是对抗细胞间电阻,实现兴奋在细胞间传播的主要途径.缝隙连接蛋白(connexin,Cx)是构成细胞间缝隙连接通道的基本结构和功能的一大类膜蛋白[1],6个缝隙连接蛋白单体形成同源六聚体,中间有一个亲水性通道,每侧膜上的通道相当于一个半通道,两侧膜相对,形成缝隙连接通道.这些通道通常是开放的,允许水溶性分子和离子通过,一个细胞产生的动作电位可通过缝隙连接的局部电流传播到另一个细胞.其中,缝隙连接蛋白CX43在神经系统信号传递中发挥重要作用.Cx43在星形胶质细胞、室管膜细胞和软膜内皮细胞中表达,以星形胶质细胞中含量丰富,在神经系统信号传递及各种反应中发挥重要作用[2].本文主要探讨Cx43在神经系统生理及某些神经系统疾病领域的研究进展.
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人前列腺癌PC-3细胞膜蛋白组学的分析
目的 分析人前列腺癌PC-3细胞中的所有膜蛋白,全面展示PC-3细胞中的蛋白质表达谱.方法 采用一维SDS-PAGE,结合高效液相色谱-串联质谱的方法,分离并鉴定PC-3细胞中的膜蛋白.结果 在严格的过滤参数条件下,PC-3细胞中鉴定出2 172种蛋白,其中1 499种经过基因本体评注(GOA)显示为已知细胞组分,其余为未知细胞组分.在已知细胞组分中,564种(37.6%)蛋白为质膜蛋白,其中138种为跨膜蛋白.跨膜蛋白中,21.17%被预测至少有1个跨膜区,57.66%有1～3个跨膜区,30.66%有4～9个跨膜区,11.66%有不少于10个跨膜区.许多新的蛋白也被鉴定,其中包括假设蛋白和一些cDNA序列.结论 这些被鉴定蛋白的生物学功能和理化性质将有助于进一步理解前列腺癌侵袭和转移的分子机制,为寻找与前列腺癌转移相关的分子提供新的实验证据.
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家蚕膜镁转运蛋白的表达及其纯化
目的 在原核细胞中表达并纯化家蚕膜镁转运蛋白(Bombyx mori membrane magnesium transporter,BmMMgT).方法 利用PCR法从家蚕蚕蛹cDNA文库中扩增BmMMgT基因,对其进行生物信息学分析后,将该基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组克隆质粒pET-32a-BmMMgT,将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析柱和阴离子交换柱纯化后,进行SDS-PAGE鉴定.用无血清培养基(Mg2+饥饿)、镁离子终浓度分别为1、2、4、8 mmol/L的培养基培养BmN细胞,设正常培养基培养的BmN细胞作为对照,提取各组细胞总RNA,逆转录合成cDNA第1条链,以其为模板,荧光定量PCR检测体外Mg2+对BmMMgT基因mRNA转录水平的影响.结果 在cDNA文库中获得1个BmMMgT基因,该蛋白是一个单次跨膜蛋白,等电点为6.7,相对分子质量约13 000.质粒pET-32a-Bm-MMgT经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量为31 000,主要以可溶性形式存在,表达量约占菌体总蛋白的60％,纯度约95％.与对照组细胞相比,处在镁饥饿状态下及不同浓度MgCl2处理的细胞,BmMMgT基因mRNA转录水平差异均有统计学意义(P＜0.05),且当Mg2+终浓度为4 mmol/L时,转录水平达到高.结论 成功在原核细胞中表达并纯化了BmMMgT,并对其功能进行了初步探讨,为其后续的深入研究奠定了基础.
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表达HIV-1 gp160膜蛋白靶细胞的制备及鉴定
目的获得表达HIV-1 bp160膜蛋白的靶细胞,用于HIV-1特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)和抗HIV-1重组毒素细胞杀伤活性检测.方法采用PCR方法,从质粒pJen 10中扩增HIV-1 gp160基因,插入pGEM-T 载体,测序后克隆入pIRES1 ngo载体中构建成重组质粒pIRE160,酶切鉴定正确后,转染人肝癌细胞(SMMC-7721),G418加压筛选至细胞不再死亡为止,并采用Western blot和间接免疫荧光法对制备的靶细胞进行检测.结果HIV-1 gp160在SMMC7721表面表达,并裂解为gp120和gp41蛋白.结论已成功得到稳定表达HIV-1 bp160的靶细胞,且表达的蛋白具有良好的特异性.
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不同片段HIV-1膜蛋白三聚体的构建、表达及其免疫原性
目的 构建、表达不同片段1型人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)的膜蛋白三聚体,并检测其免疫原性.方法 以中国主要流行株HIV-1 CRF_07 BC亚型基因为模板构建pFUSE-gp160重组质粒,以pFUSE-gp160为模板构建pFUSE-gp140FF、pFUSE-gp 120FF、pFUSE-gp41FF、pFUSE-N55FF、pFUSE-N28FF重组质粒,将重组质粒分别转染293F细胞,转染120 h后,收获上清,经Ni-NTA superflow、nProtein A SepharoseTM 4 Fast Flow及Superose 12 Prep Grade分子筛纯化后,分别进行SDS-PAGE及Western blot鉴定.将各重组蛋白联合MF59佐剂经大腿肌肉注射免疫豚鼠,100 μg/只,分别于第1、30及60天各免疫1次,初次免疫前7d及末次免疫后第90天心脏采血,分离血清,ELISA法及假病毒系统分别检测血清特异性抗体效价及中和抗体滴度.结果 质粒pFUSE-gp160、pFUSE-gp140FF、pFUSE-gp120FF、pFUSE-gp41FF、pFUSE-N55FF、pFUSE-N28FF经测序鉴定构建正确.各纯化蛋白的SDS-PAGE及Western blot鉴定均可见目的条带,gp120FF和gp140FF均可高通量表达,其表达量分别为6和2.5 mg/L,gp41FF、N55FF和N28FF蛋白的表达量均低于0.5 mg/L,纯化后的纯度均较高.gp140FF组和gp120FF组豚鼠血清抗体效价分别为3.2× 105和5.33×105、中和抗体滴度分别为405和462,均显著高于其他组(P＜0.05).结论 gp 140FF和gp120FF能诱导豚鼠产生较强的体液免疫反应和中和抗体,本实验为HIV-1疫苗的研发提供了参考.
关键词： 1型人类免疫缺陷病毒 膜蛋白 三聚体 免疫原性 -
羊布鲁菌膜蛋白的提取及血清抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 提取羊布鲁菌标准强毒株16 m膜蛋白,分析其反应原性,并建立血清抗体间接ELISA检测方法.方法 利用碳酸盐方法提取羊布鲁菌标准强毒株16 m膜蛋白,12%SDS-PAGE分析其相对分子质量范嗣;用自然感染羊布鲁菌的阳性血清进行Western blot分析,初步确定膜蛋白组分中能够发生免疫反应的条带;用方阵滴定法确定抗原和抗体的佳稀释度,建立间接ELISA检测方法,并进行特异性和精密性验证;检测免疫豚鼠的血清抗体效价;对临床上采集的羊血清样品进行检测,并与虎红平板凝集试验结果进行比较.结果 分离的羊布鲁菌膜蛋白浓度为9.4 μg/μl;SDS-PAGE分析显示,羊布鲁菌膜蛋白的相对分子质量主要集中在17 000～80 000之间;Western blot分析显示多条特异性反应条带.膜蛋白抗原的佳稀释度为1:1 280,抗体佳稀释度为1:10.所建立的ELISA方法特异性和精密性良好.ELISA检测豚鼠血清效价为1:64 000.检测临床510份羊血清样品,阳性率为86.3%,高于虎红平板凝集试验检出的阳性率(41.2%).结论 已成功提取了羊布鲁菌膜蛋白,其具有良好的反应原性,并建立了血清抗体间接ELISA检测方法.
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质膜蛋白质组学技术的研究进展
随着蛋白质组学技术的不断发展,在疾病的发生、发展以及预后发挥着重要作用的膜蛋白受到越来越多的关注.然而,细胞质膜蛋白的丰度低、疏水性强和水溶性不好的特点,始终是阻碍着膜蛋白质组学研究取得更大进展的难题.本文对膜蛋白的富集、纯化、增溶以及分离和鉴定方法进行综述.
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三首活血化瘀方对气虚血瘀模型大鼠红细胞膜蛋白组成影响的研究
目的 研究补阳还五汤、少腹逐瘀汤和丹参饮对气虚血瘀型大鼠红细胞膜蛋白组成的影响.方法 80只Wistar大鼠,随机分为8组,分别为空白对照组、气虚血瘀模型组、补阳还五汤高低剂量组、少腹逐瘀汤高低剂量组、丹参饮高低剂量组,每组10只.大鼠采取饥饿加力竭游泳法复制气虚血瘀模型,每日1次,连续14天.末次造模后禁食不禁水24h.每日1次灌胃给药,连续给药15天.取血制备红细胞膜,采用SDS-PAGE法分析红细胞膜蛋白组成变化.结果 与空白组比较,模型组带5及带6蛋白含量显著降低(P＜0.05).与模型组比较,补阳还五汤可显著升高带5蛋白(P＜0.05)、带6蛋白(P＜0.05)和带7蛋白含量(P＜0.05);少腹逐瘀汤可显著升高带2蛋白(P＜0.05)、带3蛋白(P＜0.05)、带5蛋白(P＜0.01)和带6蛋白含量(P＜0.05);丹参饮可显著升高带4.1蛋白(P＜0.05)、带5蛋白(P＜0.05)、带6蛋白(P＜0.05)和带7蛋白含量(P＜0.05).结论 补阳还五汤、少腹逐瘀汤和丹参饮可以不同程度地纠正气虚血瘀模型大鼠红细胞膜的膜蛋白组成.
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结核分枝杆菌P16蛋白的研究进展
P16蛋白是结核分枝杆菌主要的膜蛋白,对该菌的生存力和稳定性起重要的调节作用.P16蛋白主要以9个亚基的寡聚体形式存在,有抗蛋白酶的水解作用;在氨基酸序列有一α-crystallin结构,该结构与P16蛋白的分子伴侣活性密切相关;P16蛋白具有高效、自发的再折叠,再组装能力,具有极强的抗热性.P16蛋白具有较强的免疫原性,可作为预防结核的亚单位疫苗及血清学诊断试剂.
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血吸虫疫苗研究新进展
血吸虫病是一种防治难度极大的人畜共患寄生虫病,在全球范围内其患病人数仅次于疟疾,是第二大热带寄生虫病.数十年来,血吸虫疫苗研究逐步从死疫苗、减毒活疫苗发展到基因工程亚单位疫苗.随着血吸虫分子生物学领域的飞速发展,血吸虫基因组学、转录组学和大部分蛋白组学研究基本完成,人们发现了一批新的疫苗候选分子.本文综述了血吸虫疫苗新近的研究进展,着重描述了tetraspanin为代表的膜蛋白疫苗.
关键词： 血吸虫病 疫苗 膜蛋白 tetraspanin -
声波刺激影响烟草膜蛋白结构和功能的研究
生物膜是由蛋白质、脂质和碳水化合物等构成的超分子体系,其主要的功能包括能量转换、物质运输和信息传递以及承担着蛋白质和酶系统的代谢进程.质膜是细胞中对环境刺激为敏感的部位,膜蛋白又是膜功能的主要执行者,因此研究声波刺激下膜蛋白结构和功能的改变将有助于了解植物对机械刺激的原初响应过程.本研究以烟草愈伤组织为材料,来研究声波刺激对膜蛋白二级的影响.
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耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌膜蛋白机制研究
目的 研究耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌膜蛋白机制并了解其流行型别.方法 收集仁济医院、瑞金医院和上海市第六人民医院鲍曼不动杆菌共85株,其中亚胺培南和美罗培南耐药菌49株,敏感菌36株.用细菌基因组回文结构重复序列-聚合酶链反应(REP-PCR)分析其流行型别,PCR扩增检测碳青霉烯类水解酶及金属酶,对阳性扩增菌株进行DNA测序分析,同时用超声波和超速离心法提取细菌的膜孔蛋白并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析. 结果 49株耐亚胺培南和美罗培南鲍曼不动杆菌中,REP-PCR分析结果 以A型为主,与敏感菌株存在很大差异;耐药菌株中oxa-51均为阳性,45株为oxa-23阳性;36株敏感菌株中检测到1株oxa-58阳性,29株为oxa-51阳性;金属酶(VIM和IMP-1/4型)均阴性;膜蛋白分析显示,在36株耐药株中38 000附近条带缺失,而在30株敏感株中有17株在相应位置处表达该条带.结论 耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌主要以A型流行,产oxa-23水解酶和38 000附近膜孔蛋白条带缺失可能是其主要耐药机制.
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红细胞膜蛋白异常与膜骨架相关溶血性贫血的发生
红细胞膜为双层磷脂结构,其间镶嵌着多种膜蛋白.这些膜蛋白包括包埋在脂质双分子层中的整合蛋白及存在于膜内侧的细胞膜骨架蛋白,而后者与红细胞膜缺陷所致的溶血关系密切.
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中性肽链内切酶检测在临床中的应用
中性肽链内切酶(neutral endopetidase,NEP)是含锌金属肽酶M13家族中的一种,其在体内分布非常广泛,是存在于许多细胞膜表面的Ⅱ型完整膜蛋白.
