首页 > 文献资料
-
同时检测六种人类冠状病毒的单管多重RT-PCR方法的建立
目的 建立一种单管多重RT-PCR检测方法,同时检测6种人类冠状病毒.方法 由GenBank获取6种人类冠状病毒(HCoV-NL63、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和MERS-CoV)的核苷酸序列作为参比,分别设计6种冠状病毒保守区靶序列特异性引物,用本实验室所保存的病毒株及核酸样本为模板建立基于全自动电泳仪分析的单管多重RT-PCR检测技术,进行了检测限和重复性评价,并用本实验室所保存的其他呼吸道病毒阳性样品对该方法的特异性进行了再验证.用140份临床样本结合荧光定量RT-PCR法平行验证了该检测方法的可行性.结果 基于全自动电泳仪分析的多重RT-PCR检测技术可同时检测6种人类冠状病毒,阳性标本均显示至少一条相应特异性产物预期大小片段(分别为195、304、332、378、415、442 bp),阴性对照无特异性条带显示,具有较高的特异性.在检测单个病毒时检测限能达到1.0×101～ 1.0×102拷贝/μl.其他呼吸道病毒验证未发现交叉反应.140份临床样本平行验证结果与常用的单一HCoV检测的荧光定量RT-PCR法一致,阳性样本均为28份(20％).结论 建立的基于全自动电泳分析的单管多重PCR方法能够同时检测6种人类冠状病毒感染,有较高的灵敏度和特异性.
-
中国首例输入性中东呼吸综合征病例实验室确诊方法比较
目的 对中国首例疑似输入性中东呼吸综合征冠状病毒感染病例进行实验室确诊,并比较不同核酸检测方法灵敏度.方法 采用针对多个靶标(upE,ORF1a,N2,N3)的四种实时荧光定量PCR检测方法,对2015年5月28日中国首例疑似MERS冠状病毒感染患者样本(全血样本1份,咽拭子3份)进行复核,并对检测结果进行比较分析;同时采用2个中东呼吸综合征冠状病毒检测试剂盒对标本进行了检测.结果 送检3份咽拭子多个靶标复核检测结果皆为阳性,1份全血样本仅N2/N3两个靶标检测结果为阳性.采用2个试剂盒皆可检测到送检咽拭子为阳性.结论 实验室确诊送检样本为MERS冠状病毒感染阳性.基于N2与N3靶标核酸检测有更高灵敏度,更适于MERS冠状病毒感染筛查与临床样本检测.
-
兰州地区急性呼吸道感染患儿冠状病毒NL63的检测与临床研究
目的 探讨兰州地区冠状病毒NL63(HCoV-NL63)在急性呼吸道感染患儿中的流行现状及临床特点.方法 收集2006年11月至2009年10月兰州大学第一附属医院急性呼吸道感染(ARTIs)患儿1169例鼻咽分泌物,应用RT-PCR方法检测HCoV-NL63以及其余7种常见呼吸道病毒:鼻病毒(HRV),呼吸道合胞病毒(RSV),偏肺病毒(hMPV),流感病毒(IFVA,IFVB)副流感病毒1-3(HPIV1-3)及PCR方法检测腺病毒(ADV),博卡病毒(HBoV).结果 检测出HCoV-NL63阳性标本35例,检出率2.99％,2007年8、9月,2009年7、8月检测阳性标本阳性率较高,分别为23.53％、17.65％,50％、33.33％.2007年12月至2009年2月未检出HCoV-NL63阳性标本.25(25/35)例混合其他病毒感染,混合感染率为71.43％,常见的混合感染病毒是HRV.3岁及以下和3岁以上HCoV-NL63感染组感染率差异无统计学意义.HCoV-NL63阳性患儿主要的诊断是支气管肺炎和毛细支气管炎,主要的症状是发热和咳嗽.HCoV-NL63单独感染组和混合感染组除消化道症状外,在其余症状和临床诊断方面,差异均无统计学意义.结论 HCoV-NL63是兰州地区呼吸道感染患儿的重要病原,夏季是兰州地区HCoV-NL63感染高峰期,HCoV-NL63的流行存在年度差异.HCoV-NL63感染存在很高的混合感染率,混合感染并不加重HCoV-NL63感染的病情.
-
SARS冠状病毒N蛋白6个不同原核表达区段的抗原特性分析
目的 确定原核表达的SARS-COV N蛋白不同片段抗原特性及在血清学诊断中的应用.方法 在前期N蛋白抗原性初步分析的基础上,从39个原核表达不同区段的N蛋白中选取6个纯化的N蛋白即PN360(1 -360aa),PN301(1- 301aa),PN199( 30 - 228aa),PN185(30 - 214aa),PN155b(60 - 214aa),PN125 (90 - 214aa),采用Western-Bolt和ELISA方法,检测SARS-COV阴性正常人血清与SARS-COV患者恢复后血清中抗SARS-COV N蛋白抗体.结果 Western-Bolt结果表明6个片段皆能与SARS-COV阳性血清反应,但PN360和PN301与SARS-COV阴性血清存在明显交叉反应;使用PN199,PN185,PN155b,PN125作为包被抗原进行ELISA检测,分析表明PN185,PN155b区段的敏感性较好.结论 原核表达的SARS-COV N蛋白PN185与PN155b区段是SARS-COV病毒感染的特异性抗体检测的较佳抗原.
-
传播链和非传播链SARS患者中SARS冠状病毒抗体的分布及变化规律
目的探讨人体对SARS-CoV血清抗体反应及分布规律.方法对301例临床诊断病例的血清标本(其中传播链上的病例158例,非传播链病例143例);采用北京华大GBI生物技术有限公司生产的间接ELISA试剂,进行SARS-CoV IgG抗体的检测,部分病例还进行了SARS-CoV IgM的检测.结果传播链涉及15条,多涉及4代,各条链的SARS IgG抗体阳性率为85.70%～100.00%,总阳性率为94.30%(149/158).SARS病例数随代数增加而减少.但各代间IgG阳性率的差异无显著意义;χ2=5.11,P＞0.05.非传播链病例的血清抗体阳性率为12.59%(18/143).与传播链的阳性率比较,两者间的差异有显著意义;χ2=199.64,P＜0.001.在发病后的0～7 d、8～14 d、15～21 d、22～30d内,SARS-CoV IgG的累计阳性率分别为16.67%、40.00%、70.00%、93.10%;然后进入平台期,并可以维持6个月以上.在发病7 d内,SARS-CoV IgM的累计阳性率为16.67%,8～14 d时,已有55.17%的标本IgM抗体阳转,在21～30 d时,抗体阳性率达高峰(86.96%),以后迅速下降.结论SARS感染后,94%的感染者可产生IgG抗体.检测该抗体可以作为临床核实诊断的依据.SARS-CoV IgG抗体在7 d时可能检出,一般在4周达高峰,可维持半年以上.
-
SARS-CoV N基因重组腺病毒对树突状细胞前炎症细胞因子mRNA表达和分泌的影响
目的 探讨严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)感染后炎症细胞因子的mRNA表达和分泌水平的动态变化,在蛋白质水平上阐明SARS-CoV的致病机理.方法 本研究在建立树突状细胞(dendritic cells,DC)培养方法的前提下,利用SARS-CoV的N基因重组腺病毒(rAd-N)和对照的腺病毒(rAd-LacZ)来感染成熟的DC,用RT-PCR和ELISA法检测DC对IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a的mRNA表达和分泌水平的变化.结果 IL-6和TNF-a mRNA的表达和分泌水平在前24 h之内是逐渐升高的,与对照组(rAd-LacZ感染)相比,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 SARS-CoY的N蛋白与SARS的急性期DC分泌过量的前炎症细胞因子有关.
-
2012年发现的新冠状病毒分子检测方法的建立与探针优化
目的 建立2012年确定的新冠状病毒的分子检测方法,并筛选优化引物与探针.方法 依据先发表的208 bp长的新冠状病毒1b片段核酸序列,比对分析后设计合成常规RT-PCR引物1对及荧光定量RT-PCR引物1对与TaqMan探针2条(TZ1,TZ2),同时合成锁核酸修饰的TaqMan探针2条(LNA-TZ1,LNA-TZ2).建立检测新冠状病毒感染的常规RT-PCR方法与4种荧光定量RT-PCR,分析比较其灵敏度与特异性,同时参照欧洲发表的2种荧光定量RT-PCR引物与探针对(upE,ORF1b)建立相应方法,以合成的阳性模板比较6对荧光定量RT-PCR引物与探针的检出灵敏度.结果 所合成的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR引物与探针皆有较好特异性,不能扩增其他人冠状病毒模板及常见呼吸道病毒模板,检出下限达50 ～ 500拷贝/反应.锁核酸修饰TaqMan探针可改善荧光定量PCR检测方法的反应性能,经锁核酸修饰的TaqMan探针与常规TaqMan探针相比,检出率提高10倍左右,其中LNA-TZ1与upE探针对具佳反应性能.结论 本研究所建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR可用于新冠状病毒的分子检测,并推荐使用LNA-TZ1与upE探针对.本研究为新冠状病毒分子检测方法应用与改进奠定了基础.
-
重组SARS冠状病毒棘突蛋白S1区基因片段的克隆、表达及免疫原性研究
目的构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)棘突(spike)蛋白(S蛋白)S1区基因(40～2001 bp)分段表达载体,并研究其免疫原性.方法利用PCR技术扩增S1区基因,将其定向插入pQE-30质粒,在pQE-30质粒上将S1切成3段(40～751、746～1344、746～2001 bp),均插入pQE-30质粒,构建质粒在大肠埃希菌M15中表达,表达产物经亲和层析纯化及Western Blot和ELISA鉴定.结果构建的3种重组质粒(pQE-30/S1a、pQE-30/S1b、pQE-30/S1c)均高效表达,重组蛋白相对分子质量分别为26 700、22 500和46 000,表达量分别占菌体总蛋白质的35%、35%和30%.3种重组蛋白经Ni亲和层析树脂得到成功纯化.经Western Blot及ELISA证实,重组蛋白片段S1c(746～2001bp)可以被SARS患者血清所识别.结论成功构建了SARS-CoV S蛋白S1区基因分段表达载体,重组蛋白S1c具有较强的免疫原性,它的获得为下一步疫苗的研制奠定了基础.
-
Taqman荧光定量RT-PCR在呼吸道感染患者临床标本非SARS冠状病毒检测中的应用
目的 建立检测四种常见人非SARS冠状病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan qRT-PCR检测方法,应用于急性呼吸道感染患儿的感染分析.方法 分别应用TaqMan qRT-PCR与普通RT-PCR平行检测248份呼吸道标本,对方法的灵敏性、特异性和稳定性以及临床标本的适用性进行比较评价,阳性标本以体外转录RNA为标准品进行病毒载量定量.结果 本方法可对HKU1、NL63、229E、0C43四种冠状病毒进行特异性诊断,与其他病毒无交叉反应,检测灵敏度可达10拷贝/μl,检测线性范围可达101～ 108拷贝/μl,248份标本中HKU1、NL63、229E、OC43阳性率依次为1.2％,0.8％,1.2％,1.6％,其中0C43荧光RT-PCR法检出率高于普通RT-PCR,其余三种病毒两种方法检测结果一致.非SARS冠状病毒阳性标本均检出于12月至次年5月.结论 建立的TaqMan Realtime RT-PCR法具有特异性强、灵敏性高的特点,是开展非SARS冠状病毒的临床检测与疾病监测的有效技术手段.
-
人原代呼吸道上皮细胞体系分离人冠状病毒HKU1的方法及其复制特点
目的 建立分化良好的人原代呼吸道上皮细胞(HAE)培养方法,从北京地区重症肺炎患儿呼吸道样本中分离人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)并对其复制特点进行初步分析.方法 采用气-液两相的方法诱导原代HAE细胞体外分化成假复层纤毛柱状上皮结构,接种经PCR方法鉴定HCoV-HKU1单阳性的北京儿童医院住院患儿鼻咽拭子样本,进行病毒的分离培养.通过荧光定量PCR与序列分析检测病毒复制动力与遗传稳定性.结果 HCoV-HKU1可在HAE中复制,产生有活性的子代病毒,细胞上清中的子代病毒在接种后96 h达到高峰.子代病毒在HAE传代过程中基因相对保守.结论 在国内首次采用人原代呼吸道上皮细胞从重症肺炎患儿呼吸道样本中分离到人冠状病毒HKU1毒株并确定其复制特性.
-
多重实时荧光定量PCR技术检测儿童呼吸道新发病毒方法的建立与应用
目的 建立儿童新发呼吸道病毒的多重实时荧光定量PCR检测方法,并利用该方法进行临床标本的检测.方法 根据人类偏肺病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、人博卡病毒、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒的保守区域设计并合成引物和探针,确定引物和探针的特异性,优化引物和探针的组合浓度,通过检测具有类似临床症状的其他病原体的标本评价该多重荧光定量PCR方法的特异性,构建质粒标准品用于分析检测该方法的灵敏度和重复性；并对2009至2012年湖州市妇幼保健院及湖州市中心医院收集的322例呼吸道感染患儿的痰液标本进行检测分析.结果 成功建立了这6种新发呼吸道病毒的多重荧光定量PCR检测方法,能够同时或分别对其进行检测.体系中筛选的引物和探针具有很好的特异性,并优化出适合的引物探针组合浓度,灵敏度分析低检测限为10拷贝数/μl,重复性分析中批内变异系数(CV)为1.2％ ～ 3.4％,批间CV为0.08％～0.85％,均小于5％.322份临床标本中,人类偏肺病毒阳性17份,阳性率5.28％,人博卡病毒9份,阳性率2.80％,未检到冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒.结论 多重荧光定量PCR方法具有简单快速,灵敏性和特异度高等特点,并且能实现多种新发病毒同时并行检测,可为儿童呼吸道新发病毒感染的临床诊治提供技术支持.
-
T载体克隆在病毒样颗粒表达载体构建中的应用
目的提高带某些限制酶切位点聚合酶链反应(PCR)扩增产物克隆入表达载体的效率.方法将带Hind Ⅲ酶切位点的PCR扩增产物与T载体连接,转化BL21-DE3 E.Coli,提取质粒后,用Hind Ⅲ酶切,电泳分离并提取纯化的目的片段.然后,与经过相同的限制性酶酶切的表达载体pNCCL1连接. 结果经T载体克隆酶切构建的内含严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)核酸的病毒样颗粒表达载体,方法简单快速,每次均可获得成功.而采用直接酶切扩增产物的构建方法,未获得成功构建的表达载体.结论 T载体克隆可用于对直接酶切效果不好(如Hind Ⅲ)的PCR扩增片段的表达载体的连接构建,方法简便高效.
-
多重RT-PCR同时检测8种呼吸道病毒方法的建立
呼吸道病毒分别在2组多重RT-PCR体系中被成功扩增,评估结果显示呼吸道合胞病毒、鼻病毒和冠状病毒229E第一轮多重RT-PCR与普通RT-PCR结果的一致性分别为97.9%、95.8%和95.8%;第二轮多重半巢氏PCR与普通PCR扩增结果一致性分别为48/48、47/48和48/48;其他5种病毒的2轮扩增的结果一致性均为100%.结论 2组多重RT-PCR与普通RT-PCR扩增结果均具有较高的一致性,一种可以同时检测8种常见呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法被初步构建.
-
从北京地区急性呼吸道感染患儿标本中检测到新型冠状病毒NL63基因
目的了解北京地区婴幼儿急性呼吸道感染是否与一种新发现的冠状病毒--HCoV-NL63相关.方法选取2003年12月-2004年3月,从首都儿科研究所附属儿童医院收集的245份因急性呼吸道感染就诊的门诊患儿的咽拭子标本以及住院患儿的鼻咽洗液标本,进行HCoV-NL63的筛查.这些标本已经过间接免疫荧光法和病毒分离检测,常见的七种呼吸道病毒(包括RSV,甲、乙型流感病毒,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒)检测均为阴性;同时还经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测人偏肺病毒(hMPV)也为阴性.首先用位于HCoV-NL63 1b基因的两对引物用巢式PCR方法进行筛查,阳性者再用位于HCoV-NL63 1a基因的两对引物扩增进行复核.对用HCoV-NL63 1a基因扩增的长片段产物进行测序并与GenBank中相关序列进行比较分析.结果用HCoV-NL63 1b基因的引物经巢式PCR方法从245份标本中检测到3份阳性标本,阳性率为1.2%.3份阳性标本用HCoV-NL63 1a基因的两对引物经巢式PCR方法进行复核均得到阳性结果,这3份标本均取自住院患儿,患儿年龄分别为4个月、1岁和1岁5个月,临床诊断分别为毛细支气管炎、喉炎和支气管炎,男女比例为2:1.对其中基因扩增产量较高的BJ3140和BJ3787的1a基因长片段扩增产物(838 bp)进行序列测定和分析的结果显示,这两株HCoV-NL63与GenBank公布的不同地区的HCoV-NL63的1a基因序列同源性高,达到98%～99%.基于部分1a基因序列的系统进化分析显示,BJ3140和BJ3787属于HCoV-NL63的第一簇(group 1).结论结果提示北京地区部分婴幼儿的急性呼吸道感染与HCoV-NL63相关.
-
SARS患者SARS冠状病毒RNA的动态检出特点及其意义
目的观察SARS患者各种临床标本的带毒状况,分析SARS冠状病毒(SARS-CoV)在患者体内的动态变化及其临床意义.方法设计针对SARS-CoV P区和N区的2套引物,应用巢式RT-PCR对 84例SARS患者的血、尿、痰、粪便、咽拭子等494份不同发病时间收集的标本进行病毒定性检测,并将PCR产物直接进行DNA序列分析.结果两套引物均能较好地扩增出部分标本SARS-CoV基因的特异性片段.在所有标本中痰液阳性检出率高,联合检测多种标本或同时应用两套引物进行PCR扩增可明显提高标本阳性检出率.跟踪观察发现,ARS患者发病第2周时PCR阳性检出率高,第3～4周次之,但各种标本阳性检出率的动态变化不尽相同.结论应用巢式RT-PCR进行SARS早期诊断和检测是一种可行的方法,针对SARS-CoV基因组不同区域设计多对引物,联合检测多种临床标本可明显提高阳性检出率;研究SARS-CoV的检出变化特点将为SARS的临床治疗提供一定的依据.
关键词： 严重急性呼吸综合征(SARS) 巢式RT-PCR 冠状病毒属 -
SARS 25例临床诊断患者血浆特异性抗体和病毒的动态检测
目的动态检测SARS患者血浆特异性IgM和IgG以及SARS冠状病毒(SARS-CoV)的变化规律.方法用酶联吸附免疫法对25例145份 SARS临床诊断患者血浆特异性IgM和IgG进行定性检测,用RT-PCR对其中114份血浆进行SARS-CoV定性检测.结果 IgM和IgG抗体的阳性样本检出率分别为49.0%(71/145)和54.5%(79/145),阳性患者检出率均为84.0%(21/25),两种抗体大多在发病第2～4周产生,前5周检出率相近,均呈上升趋势,以后IgM抗体检出率开始下降,gG抗体检出率则继续上升.血浆SARS-CoV阳性样本检出率为15.8%(18/114),阳性患者检出率为40.0%(10/25),多为发病后4周内采集的样本,抗体检测阴性或初次阳性.结论血浆特异性抗体以及SARS-CoV检测可作为SARS的确诊依据;抗体产生后大多数病人血浆病毒很快转阴,但有个别病人在抗体产生2～3周后仍能在血浆中检测到病毒序列.
关键词： 严重急性呼吸综合征(SARS) 抗体 冠状病毒属 实验诊断 -
鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1内保守序列LLRKxGxKG的功能研究
目的 研究鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)内的保守氨基酸序列LLRKxGxKG的功能.方法 扩增并构建MHV NSP1正常基因及LLRKxGxKG序列缺失突变的NSP1基因,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得真核表达质粒.用所构建的真核表达质粒转染L929细胞,经新城疫病毒(NDV)刺激诱导后,采用ELISA法检测IFN-β的表达水平,观察NSP1正常或突变蛋白对IFN-β表达的影响.通过与含CAT和Luc报告基因的重组质粒进行共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对IEF-β启动子活性和干扰素刺激应答元件(ISRE)活性的影响.通过与三种报告基因(pRLuc-CMV、pGL3-basic、pGL3-control)共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对共转染基因表达的影响.结果 MHV NSP1对真核细胞产生干扰素有一定的影响,并可显著抑制IFN-β启动子或ISRE应答元件的活性,且该抑制作用不受LLRKxGxKG序列缺失的影响.同时,MHV NSP1还可强烈抑制多种共转染报告基因的表达.该抑制作用在LLRKxGxKG序列缺失后显著降低.结论 MHV NSP1对Ⅰ型干扰素信号通路有特异的抑制作用.LLRKxGxKG序列是MHV NSP1的一个重要功能域,在抑制共转染基因表达过程中发挥着重要作用.
-
MERS冠状病毒核衣壳蛋白原核表达和纯化
目的 构建带有MERS-CoV N( MERS冠状病毒核衣壳蛋白)基因片段的pET-22b+原核表达载体,并表达和纯化核衣壳蛋白( NP). 方法 通过PCR技术扩增NP蛋白基因片段,插入到原核表达载体pET-22b+上. 使用核酸电泳、测序以及小量诱导表达确认所构建克隆的正确性,然后将重组质粒转化进大肠杆菌BL21a(DE3)中,并在大肠杆菌BL21a(DE3)中大规模诱导表达NP蛋白,使用AKTA纯化系统经强阳离子交换层析纯化出NP蛋白.结果 测序和小量诱导结果表明,扩增的NP蛋白片段序列正确,所构建的pET-22b+-NP克隆可在大肠杆菌BL21a (DE3)的包涵体和细胞质中表达;通过阳离子交换层析和浓缩后,蛋白的纯度和浓度都得到明显提高. 结论纯化出高纯度、高浓度的NP蛋白,为NP蛋白功能性研究提供重要基础.
-
亚甲蓝/光化学法灭活血浆中的SARS冠状病毒
目的:探讨亚甲蓝/光化学法灭活人血浆中SARS冠状病毒(SARS-CoV)的效果.方法:从SARS患者血清中分离出冠状病毒,经VeroE6细胞增殖后将病毒加入含有不同浓度亚甲蓝的人血浆中,再用亚甲蓝/光化学法处理不同时间,取样接种细胞,观察细胞病变作用.结果:在激发光源照度为40 000 lx条件下,经1 μmol / L的亚甲蓝作用30 min可灭活血浆中6.5 lgTCID50/ ml的SARS-CoV,经5 μmol / L的亚甲蓝作用3 min可灭活上述滴度病毒.结论:亚甲蓝/光化学法能够灭活血浆中的SARS-CoV.
-
Swanson的知识发现法在科学研究中的意义 --基于对SARS可能病原间相互作用关系的初步探讨
目的:应用知识发现法研究SARS可能相关病原体间的作用关系.方法:应用Arrowsmith系统检索非相关文献策略.结果与结论:通过对冠状病毒和衣原体间非相关文献检索,可推断出一些有参考价值的结论.
