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抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定
[目的]探讨毕赤酵母GS115表达的重症肌无力单链抗体A7的一般特性及与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的结合特异性.[方法]采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验,检测已经转化至毕赤酵母GS115中的重症肌无力重组载体pPIC9K-ScFv A7表达的单链抗体A7蛋白的分子质量;应用间接免疫荧光技术确定表达蛋白与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性.[结果]毕赤酵母GS115培养上清液中有目的蛋白的表达,分子质量约为44ku;间接免疫荧光试验显示,在大鼠肋间肌细胞间有荧光出现.[结论]单链抗体A7可以在毕赤酵母中成功地表达,并且可与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合.
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单链抗体A 7基因的原核细胞表达
[目的]制备抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因,为基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]构建含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2-单链抗体A 7,将其转化至大肠杆菌HB2151中,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,在外周质中进行表达,以硼酸钠裂解细菌细胞壁,制备含有单链抗体的裂解液,应用鼠抗c-myc单克隆抗体的斑点杂交试验检测表达的单链抗体A 7基因.[结果]在大肠杆菌的外周质中可见单链抗体A7基因表达,培养上清液中未见单链抗体A 7基因表达.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因在原核细胞成功表达.
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重症肌无力单链抗体基因的制备
[目的]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体.[方法]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因,并克隆到载体噬粒pHEN2.将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性.[结果]电泳检查发现了大小分别为378 bp,339 bp和762 bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因,且位置正确.[结论]已成功地构建了抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体基因.
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从TE 671细胞株提取人乙酰胆碱受体
[目的]分离提取具有活性的人乙酰胆碱受体.[方法]用摇动培养瓶大量培养表达人乙酰胆碱受体的TE 671细胞株,细胞经裂解制备人乙酰胆碱受体提取液.应用放射免疫测定法检测提取的人乙酰胆碱受体与抗人乙酰胆碱受体抗体的结合活性.[结果]提取的人乙酰胆碱受体能与抗人乙酰胆碱受体抗体结合,且结合活性很高,含量为1.8 × 1010个乙酰胆碱受体分子/100 μL提取液.[结论]从TE 671细胞株提取的人乙酰胆碱受体具有与相应抗体结合的功能,可以作为抗原应用于重症肌无力的研究.
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电鳐乙酰胆碱受体的分离和纯化
[目的]分离和纯化具有活性的电鳐乙酰胆碱受体[方法]将电鳐电器官肌肉制成匀浆,细胞经裂解制备电鳐乙酰胆碱受体粗提液.经眼镜蛇毒素偶联的Sepharose 4B层析柱亲和吸附,得到纯化的电鳐乙酰胆碱受体.应用酶联免疫吸附试验检查纯化的电鳐乙酰胆碱受体与抗乙酰胆碱受体抗体的结合活性[结果]分离和纯化的电鳐乙酰胆碱受体能与抗乙酰胆碱受体抗体结合,且结合活性高.[结论]从电鳐电器官中分离和纯化的乙酰胆碱受体活性高、特异性强,可作为抗原在酶联免疫吸附试验中用于检查抗乙酰胆碱受体抗体.
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抗乙酰胆碱受体单链抗体的纯化
[目的]纯化抗乙酰胆碱受体单链抗体,为测定其特异性准备材料.[方法]将大肠杆菌表达的单链抗体(含有6 xHis及c-myc标记肽)经Ni-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA)纯化,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和应用鼠抗c-myc单克隆抗体的免疫印迹试验鉴定纯化产物,并根据吸光度值测定表达产物的含量[结果]在纯化产物中发现大小约为36 KD的单链抗体,杂质蛋白带较少,表达量约为30μg/L.[结论]用Ni-NTA纯化带有6 xHis标记肽的单链抗体的方法简单、纯度高,以大肠杆菌表达抗乙酰胆碱受体单链抗体时产量低.
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定点突变去除抗乙酰胆碱受体抗体的补体结合功能
[目的]制备无补体结合功能的免疫球蛋白样抗乙酰胆碱受体抗体,用于重症肌无力的特异性免疫治疗.[方法]应用定点突变技术,将致病性抗乙酰胆碱受体抗体IgG637的重链CH2区的第322位氨基酸进行K322A突变,获得的突变型抗体IgG637/K322A基因经转化大肠杆菌XL1-Blue进行增殖,测定序列证实为突变序列,转染哺乳类细胞CHO-k1进行表达,其产物经酶联免疫吸附试验检测与补体C1q的结合活性.[结果]突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG637/K322A不能与补体C1q结合,而对照抗体IgG637可与补体结合.[结论]经定点突变,成功地获得了失去补体结合功能的抗乙酰胆碱受体抗体.
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有机磷农药中毒反跳机制及救治探讨
有机磷农药仍是我国当今生产和使用率多的农药,品种达上百种,大多属剧毒或高毒类[1].急性有机磷农药中毒(acute organophosphorus insecticide poisoning,AOPP)是短时间内接触大量的有机磷杀虫剂后,引起以神经系统损害为主的全身性疾病.临床表现包括胆碱能兴奋或危象以及其后可能发生的中间期肌无力和迟发性神经病三类综合征,严重者可致死亡[2].然而有机磷农药中毒反跳更严重,是临床比较棘手的问题,但一些专业书籍及杂志对其阐述却不多.我们医院自2003年3月至2014年3月共收治有机磷中毒病人386例,全部符合AOPP诊断标准[3],其中重度中毒189例.在这189例中,出现中毒反跳48例,其中死亡12例,留有迟发性多发性周围神经病变3例,痊愈33例.报道如下.
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消融右肺动脉神经节丛对肾上腺素能刺激和胆碱能刺激诱发房颤的影响
目的:探讨右肺动脉神经节丛(RPVGP)消融对胆碱能及儿茶酚胺诱发房颤的影响.方法:20 只犬麻醉开胸后.暴露RPVGP,分别在消融RPVGP 前后,经股静脉静滴乙酰胆碱(ACh) 及儿茶酚胺.测量房颤诱发率及两类递质诱发房颤的阈浓度.结果:RPVGP消融前,静滴Ach和异丙基肾上腺素(IPA)及肾上腺素(EPI)(1~100μmol/1)均可诱发AF,诱发率100%.Ach、IPA 和 EPI的诱发阈浓度分别为2.6±0.3~μmol/1,3.3±0.2/μmol/l,5.6±0.2μmol/1.RPVGP 消融后,Ach及儿茶酚胺的AF诱发率分别降至10%及35%,且三种递质的诱发阈浓度分别提高至2.6±0.3 μmol/1、22.5±2.4μmol/1和26.±2.6μmol/1(P<0.05).结论:消融RPVGP使乙酰胆碱和儿茶酚胺诱发房颤的阈浓度增高,并降低此二类介质的房颤诱发率.
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前列腺素类药物在青光眼中的应用
青光眼是严重威胁人类视力的一种至于致育性眼病,属全世界致育眼病的第二位,其特点是:在病理学性高眼压导致的视神经萎缩和视野缺损.[1]因此,合理有效地控制眼压是治疗青光眼的关键.临床常用的降压药有:胆碱能药物、胆碱脂酶抑制剂、肾上腺β受体阻制剂.高渗脱水剂等,而前列腺素类(PGs)是近年来研究并证明有效地降眼压新药.PGs是一类花生四烯酸衍生的不饱和20碳脂肪酸,它是通过增加葡萄膜巩膜途径房水外流来降低眼压.
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Effects of Electroacupuncture on the Ability of Learning and Memory in Rats with Ischemia-reperfusion Injury
目的:观察电针预处理和电针治疗对缺血再灌注大鼠学习记忆功能的影响,为针灸参与中风后学习记忆功能障碍的早期防治和临床应用提供实验基础.方法:将72只清洁级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、术前电针组和术后电针组,通过观测各组大鼠避暗试验潜伏期和错误次数、神经功能缺损评分、患侧海马胆碱能受体结合量,分析术前和术后电针对脑缺血再灌注大鼠学习记忆功能的影响.结果:1)缺血后大鼠出现不同程度神经功能缺损体征.与假手术组相比,模型组神经功能缺损评分明显降低,避暗试验潜伏期和错误次数明显增加.mAchR的特异性结合量降低,与假手术组差异有显著性(P<0.05).2)电针缺血大鼠可降低MCAO大鼠神经功能缺损积分,与模型组相比,术前电针组、术后电针组避暗试验潜伏期和错误次数,均有显著性差异(P<0.05).3)与模型组比较,术前电针组mAchR结合量明显升高(P<0.05),术后电针组mAchR结合量略有升高.结论:术前和术后电针均可延长避暗试验潜伏期,减少错误次数,而术前电针预处理可明显升高脑缺血再灌注所致异常降低的mAchR结合量,从而改善中枢胆碱能系统功能,改善学习记忆.提示电针预处理对预防缺血性脑血管病所致的学习记忆功能缺损有重要应用价值.
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一氧化氮、血管活性肠肽与反流性食管炎
食管反流性疾病(gastroesophageal reflux disease,GERD)及反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)系胃肠动力性疾病,胃肠神经和胃肠激素在其发病机制中发挥重要作用.目前认为,一氧化氮(nitric oxide,NO)与血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)作为肠神经系统中非肾上腺能非胆碱能(nonadrenergic,noncholinergic,NANC)神经的主要抑制性神经递质,广泛分布于消化系.主要以神经分泌方式在局部起作用,在消化系的神经肌肉调控及胃肠动力方面可能发挥重要作用,与GERD及RE的发生密切相关.现从NO、VIP对食管及胃动力的影响,在GERD及RE发生的机制以及NO、VIP相互作用方面进行综述.
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治疗阿尔茨海默病的新药——卡巴拉汀
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是当前严重影响老年人生活质量的一种疾病,已有多项研究证实中枢神经系统胆碱能功能下降是导致AD痴呆及认知功能障碍的生物学基础.
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睡眠呼吸暂停综合征患者伴发胆碱能性荨麻疹三例护理体会
胆碱能性荨麻疹的典型特征是当体温升高时会出现短暂的小风团. 通常是运动后出汗、洗澡、热环境、情绪紧张情况下出现症状,临床较少见,具有一定的特殊性[1]. 我科2014年收治睡眠呼吸暂停综合征患者中有3例伴发胆碱能荨麻疹. 现报道如下.
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阿尔茨海默病动物模型的构建及研究进展
阿尔茨海默病是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病.为了探讨其病因及发病机制和治疗药物的开发,相继探索建立了一些动物模型.其中较有代表性的有微量元素改变模型、物理性胆碱能损伤模型、自身免疫模型和衰老模型等,本文就其动物模型的制作方法、优缺点及其使用范围作一简要综述.
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曲伏前列素:有效的降眼压剂
青光眼是一种常见的慢性眼科疾病,是全球第二大致盲因素,其主要特征为眼内压升高、视神经损害,严重者甚至视力丧失.流行病学研究显示,青光眼威胁着所有年龄段的人群,但相对而言,对40岁以上人群更为显著.青光眼的主要类型包括原发性(包括开角型和闭角型)、继发性、先天性和混合性青光眼.其中原发性开角型青光眼为常见,仅在美国即有约300万患者,也是西方国家致盲的主要因素之一.青光眼的治疗主要为控制眼内压.以往的治疗药物主要为滴眼剂,包括β受体阻断剂、α受体激动剂、胆碱能药物、前列腺素类似物或碳酸酐酶抑制剂.
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P2Y2受体激动剂在治疗肺部感染及其它慢性疾病中的应用
初提出嘌呤受体的概念是用于解释对非肾上腺素能或非胆碱能的效应.进一步研究又将嘌呤受体分为P1受体和P2受体.P1受体对腺苷产生效应,并与腺苷酸环化酶偶联;P2受体对5'-三磷酸腺苷(ATP)和5'-二磷酸腺苷(ADP)产生效应.而P2受体又可分为P2X受体和P2Y受体.P2X受体是配体控制的离子通道,P2Y受体是带有7个跨膜结构域的与G蛋白偶联的促代谢受体(GPCR).P2Y受体家族中的5种受体亚型P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y11已被克隆,这类受体中有些对嘌呤类和嘧啶核苷酸均有效应.故此家族现称为P2Y受体而不称P2Y嘌呤受体.
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阿尔茨海默氏病治疗药物临床评价
阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是导致痴呆的主要原因,临床上以认知功能和功能能力进行性地下降并出现行为和精神症状为特征.不过,AD的病因至今尚未完全明确.由于早期研究证实,AD发病与胆碱能和谷氨酸能神经递质的破坏有关,故制药公司开发上市了两类AD对症治疗药物:一类是胆碱酯酶抑制剂,另一类为N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂.本文根据荟萃分析和合并分析结果,就这两类药物的疗效和耐受性等作一全面评价.
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甲泼尼龙治疗重症肌无力的疗效
目的:评价甲泼尼龙治疗重症肌无力(MG)的临床效果.方法:对大剂量甲泼尼龙冲击(MPPT)治疗的34例MG病人于治疗前及治疗后分别进行临床评分,乙酰胆碱受体抗体(AChRAb)滴度,CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Tr)数量检测.结果:MPPT治疗MG后,1 wk时临床显效率56%,3 mo时临床显效率为79%,总有效率为91%.治疗3 mo后血清AChRAb滴度无明显变化(P>0.05),CD4+CD25+Tr百分率明显升高,与治疗前相比差别有非常显著意义(P<0.01).结论:甲泼尼龙治疗重症肌无力的疗效好,可促进CD4+CD25+Tr细胞比率升高,值得临床推广.
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126例急性颅内出血微创血肿清除术前后心电图观察
观察126例急性颅内出血(ATCH)微创血肿清除术前后心电图的变化,讨论出现脑心综合症的原因,提出对急性颅内血肿处理的看法.认为对适宜的病人要立即行血肿清除术和用阻断胆碱能维传导的药物,解除病灶对心脏的影响,减轻AICH所致的心脏损害;防止AICH并发脑心综合症而致心性猝死,强调应加强心电监护.