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C型肉毒毒素的制备及类毒素保护力初探
将C型肉毒梭菌经适宜条件的产毒培养后纯化,并进行相关鉴定.制备的C型肉毒毒素用分段脱毒法脱毒,并进行类毒素保护力的初步研究.以不同蛋白含量C型肉毒类毒素免疫小鼠后攻毒,结果显示,蛋白含量为0.625μg的类毒素免疫2针或蛋白含量为1.25μg的类毒素免疫1针均可保护50LD50的C型肉毒毒素攻击.蛋白含量为5μg的C型肉毒类毒素与福氏不完全佐剂配制的抗原免疫小鼠3次所得抗血清的保护力(Anti LD50/ml)为4.3×104.说明用该纯化工艺制备的C型肉毒类毒素具有很好的免疫原性,作为抗原成分用于C型肉毒疫苗和C型肉毒抗毒素的研究和生产具有较好的应用潜力.
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大黄总游离蒽醌提取与纯化工艺的初步研究
目的:改进大黄总游离蒽醌提取与纯化工艺.方法:采用正交试验考察乙醇浓度、提取次数、溶剂用量等因素对大黄总蒽醌提取率的影响,并以总蒽醌的洗脱率和纯度为指标,考察大孔吸附树脂对大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数.结果:用药材8倍量的95%乙醇提取2次,每次1 h,提取物水解后通过大孔吸附树脂富集,用50%乙醇的Na2CO3饱和溶液洗脱,总蒽醌洗脱率在80%以上,纯度可达40.21%.结论:该试验所确定的大黄总游离蒽醌的提取与纯化工艺是切实可行的.
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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆、表达、纯化及生物学活性鉴定
目的:在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的可溶性片段(soluble TNF-related apoptosis-inducing Ligand, sTRAIL),并鉴定其生物学活性.方法:以人胎盘cDNA为模板,根据GenBank中序列NM_003810设计引物,以PCR方法扩增sTRAIL基因,将其克隆入pET-32a,转化BL21(DE3),IPTG诱导后,收集菌体,超声破碎,离心取上清纯化,鉴定其生物学活性.结果:表达载体经DNA测序鉴定,氨基酸序列与预期一致.宿主菌高效表达目的蛋白,经SDS-PAGE、氨基酸测序鉴定均正确.可溶部分占表达总量的20%.经过两步纯化,sTRAIL纯度达到95%,表达量可达20 mg/L培养基.纯化产物在体外能够明显诱导L929、NCI157、BEL7402、DU145等细胞凋亡,Hela细胞不敏感.对于L929,其半数致死量为0.10 μg/ml.结论:本研究在原核表达系统中表达了sTRAIL,获得高纯度sTRAIL蛋白,为其进一步研究提供了良好基础.
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祖师麻超滤纯化工艺研究
目的 考察超滤技术纯化祖师麻乙醇提取液的可行性.方法 采用不同分子截流量的超滤膜滤过祖师麻乙醇提取液,考察祖师麻甲素保留率、除杂力度、滤液稳定性及相关工艺参数.结果 用超滤技术纯化祖师麻乙醇提取液,祖师麻甲素保留率可达96 %以上,滤液澄明度好,除杂力度较大.结论 该工艺可用于纯化祖师麻的工业化生产.
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重组人脂联素融合蛋白在大肠埃希菌BL21中的表达
目的 在大肠埃希菌BL21中对构建的重组人脂联素质粒pET-32a(+)/AP进行诱导表达,并对产物进行纯化、鉴定.方法 将pET-32a(+)质粒和重组pET-32a(+)/AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,建立表达体系,筛选高表达的克隆子,用不同诱导时间和不同异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度确定佳诱导条件,用Ni2+金属层析柱进行蛋白亲和层析,对纯化蛋白进行浓缩,蛋白质印迹鉴定所诱导的蛋白.结果 得到分子量为43 kD的新生蛋白,经蛋白质印迹鉴定为重组脂联素融合蛋白.结论 将重组pET-32a(+)/AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中,建立表达体系,且获得高效表达.
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人生物素基因的原核表达及纯化
目的 构建生物素原核表达载体,获取同源性、可溶性、高纯度的重组生物素融合蛋白,为生物素的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础.方法 从胃癌细胞中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出生物素基因;用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对生物素DNA和载体pET32进行双酶切,构建pET32-生物素重组质粒;将重组质粒转化BL21感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性、PCR和重组质粒双酶切筛选重组子转化菌落,经DNA测序及BLAST比对,确认生物素基因序列正确性以及插入pET32质粒的位点和方向;用IPTG诱导表达,Western-Blotting鉴定,用Ni2+金属螯合层析柱纯化重组融合蛋白.结果 通过RT-PCR,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,扩增的生物素DNA片段与预期大小一致.经双酶切及DNA测序鉴定,生物素DNA定向插入了pET32质粒.用重组质粒转化大肠杆菌BL21、诱导表达和纯化目的蛋白.经Western-Blotting鉴定,所诱导的蛋白为重组生物素融合蛋白.结论 成功构建了生物素基因原核表达载体,表达和纯化了生物素融合蛋白.
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大孔吸附树脂对大黄总蒽醌类物质的吸附纯化
目的 研究大孔吸附树脂对大黄总蒽醌类物质的纯化和制备.方法 对比5种大孔树脂对大黄总蒽醌的吸附性能,以大黄总蒽醌为考察指标,对大孔树脂吸附纯化大黄总蒽醌的条件进行了筛选.结果 S-8型树脂对大黄总蒽醌适宜交换吸附条件为:pH 9,流速为1 mL/min;洗脱剂用5%氢氧化钠和75%乙醇混合液,解吸效果较好.静态交换容量为15.48 mg/g,动态交换容量为23.12 mg/g,吸附率为92.01%,吸附性能较好.结论 S-8型大孔树脂交换吸附大黄总蒽醌的纯化方法可取,具有良好的应用前景.
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相转移催化合成富马酸二苄酯
富马酸二苄酯是一种室内空气清新剂.常规的合成工艺是以浓硫酸为催化剂,在高温下进行富马酸和苯甲醇的酯化反应.常规的合成工艺时间较长,工艺较复杂,产品纯化较困难,且催化剂对设备有较强的腐蚀[1].本文介绍以水为溶剂,采用新洁尔灭为相转移催化剂,在碱性条件下进行富马酸钠盐与氯化苄的非均匀相缩合反应来合成富马酸二苄酯.
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抗菌肽2IQ3及其突变体的原核表达与纯化
目的：将抗菌肽2IQ3及其突变体基因进行原核表达，经纯化获得目的蛋白。方法根据2IQ3氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码原则设计并合成2IQ3基因编码的核苷酸片段，采用重叠延伸聚合酶链反应法扩增抗菌肽2IQ3及突变体基因，克隆至载体pET-28a(＋)中，构建重组表达质粒，转化至大肠杆菌BL21中，经异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，分析重组蛋白的表达形式，纯化重组蛋白。结果构建的抗菌肽2IQ3及其突变体基因所表达的重组蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，有特异性目的条带出现，纯化的重组蛋白纯度达97%左右，浓度为0.502 mg/mL。结论成功构建了抗菌肽2IQ3及其突变体基因的原核表达体系，并在大肠杆菌中进行表达、纯化，为进一步研究其生物学活性奠定了基础。
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多房棘球蚴蛋白TSP3的原核表达及分离纯化
目的 构建适合融合基因pCzn1-TSP3的原核表达系统,纯化获得多房棘球蚴蛋白TSP3.方法 TSP3的基因序列在GenBank中获取,采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,构建原核表达质粒pCzn1-TSP3,并转化于大肠杆菌Arctic Express (DE3)中,经IPTG诱导,获得目的蛋白,利用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化获得目的蛋白.结果 经生物公司测序及酶切鉴定结果证明重组质粒pCzn1-TSP3构建成功.进一步实验结果表明TSP3在原核表达系统中主要以可溶蛋白形式存在.继而经Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化获得TSP3纯蛋白,并经过Western Blot证实.结论 大肠杆菌Arctic Express(DE3)中能够成功表达蛋白TSP3,且Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱能够纯化目的蛋白TSP3.
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重组人表皮细胞生长因子在创面愈合中的临床应用进展
表皮生长因子(EGF)于1962年由Cohen从小鼠颌下腺中分离出来并纯化,它由53个氨基酸组成,相对分子质量为6 040.在随后的大量基础研究中发现EGF有广泛的生物学功能,尤其对创面愈合有促进作用[1].
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结核分支杆菌ESAT-6重组蛋白的表达、纯化及临床诊断价值
目的 构建结核分支杆菌6 kDa早期分泌性抗原(ESAT-6)表达质粒,原核表达、纯化,研究其蛋白的免疫学特性和临床诊断价值.方法 将ESAT-6基因与pET28a连接,构建重组质粒;加入诱导剂IPTG进行原核表达,亲和层析法纯化ESAT-6,Western blot法进行免疫学特性鉴定,用间接ELISA法检测结核患者血清中抗ESAT-6抗体.结果 成功构建基因工程菌株高效表达质粒ESAT-6与pET28a以及表达并纯化该重组蛋白.结论 成功构建ESAT-6/pET28a重组质粒,ESAT-6表达量高,纯化的ESAT-6有良好的抗原性.
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结核分支杆菌CFP10/pET32a重组质粒的构建、原核表达及纯化
目的 构建结核分支杆菌重组CFP10/ pET32a表达质粒,原核表达及纯化重组蛋白.方法 将目的基因CFP10亚克隆到pET32a表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)plysS,鉴定后以IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE检测其表达水平,经含Ni2+的His-bind树脂柱纯化CFP10.结果 菌落PCR鉴定及测序分析表明,成功构建CFP10/ pET32a重组质粒;IPTG诱导表达后,融合蛋白占菌体总蛋白的40%,占裂解物上清总蛋白的72.4%,表明重组的CFP10基因能在BL21中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶性状态存在.结论 成功构建结核分支杆菌CFP10/ pET32a重组质粒,CFP10获得高效表达.
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细粒棘球蚴重组延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学鉴定
目的 对构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)延伸因子-1(Elongation factor 1,EF-1)基因的重组质粒,并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定.方法 从重组质粒EF-1/pGEM-T中酶切出EF-1目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物.结果 成功构建Eg.EF-1/pET28a/E.coliBL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到31KDa Eg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别.结论 初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性.
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胀果甘草中查尔酮类物质的富集
目的 建立胀果甘草中查尔酮类物质的富集方法 .方法 使用水提、醇提、氯仿提取等方式进行粗提,再使用大孔树脂,聚酰胺柱层析等方法对其进行纯化精制;并对得到的精制物进行HPLC含量测定,检测条件为乙腈-0.1％甲酸水溶液(梯度洗脱),检测波长310nm.结果 获得的甘草查尔酮纯化物中的甘草查尔酮A含量分别为14.87％和16.5％.结论 大孔树脂和聚酰胺柱层析两种方式方法简便易行,均可得到合适的甘草查尔酮纯化物.
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甘草药渣中甘草查尔酮A的制备
目的 研究甘草药渣中甘草查尔酮A的制备及纯化工艺.方法 采用大孔树脂进行富集,硅胶柱层析与重结晶相结合进行纯化.结果 用该方法富集和纯化得到的甘草查尔酮A纯度达92.3％.结论 方法简便、成本低,所得甘草查尔酮A纯度高.
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管花肉苁蓉中松果菊苷的提取和纯化
本文对管花肉苁蓉中松果菊苷的提取和纯化工艺进行了初步研究.确定了管花肉苁蓉中松果菊苷的佳提取工艺条件:10倍量75%乙醇回流提取2次.每次lh,此条件下管花肉苁蓉提取物中松果菊苷的含量为11.2%.通过HPD-100大孔吸附树脂纯化后松果菊苷的含量达到32.8%.回收率为91.5%.
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维药瘤果黑种草子总皂苷含量测定及纯化工艺研究
目的 优选大孔吸附树脂纯化瘤果黑种草子总皂苷的工艺条件.方法 以瘤果黑种草子总皂苷量为考察指标,采用紫外-可见分光光度法测定瘤果黑种草子总皂苷含量,考察AB-8型大孔吸附树脂纯化瘤果黑种草子总皂苷的洗脱条件:上样液浓度、上样液pH、洗脱剂浓度、上样液用量及洗脱速度.结果 上样液浓度为3.93mg/mL,8倍量50％乙醇洗脱,洗脱流速为4BV/h,按此工艺条件得瘤果黑种草子总皂苷纯度为62.1％.结论 该方法操作简便,纯化效果较好.
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鼠疫快速诊断技术及其应用研究
目的寻找和确定引起特异性不足的因素,实施科学的对策加以解决,真正实现鼠疫的快速诊断技术并以此为基础构建新一代的检测技术.方法 (1)研制高质量的鼠疫F1抗原的单克隆抗体,考虑到位点问题要求尽可能多的、针对不同位点的高效价瘤株,构建稳定的"抗体源";(2)利用获得的高效瘤株通过纯系小鼠生产抗体或用无蛋白细胞培基生产抗体;(3)对抗体进行纯化并使其达到"免疫纯水平"并建立提取、纯化工艺,终建立稳定的低成本的无交叉"抗体源";(4)纯化抗原至"免疫纯水平"或"电泳纯水平",建立提取、纯化工艺,终建立稳定低成本的无交叉"抗原源";(5)对新一代快速检测技术进行实验室和现场评价,对特异性即实验的准确性做出评价.结果 (1)确定了影响鼠疫免疫学诊断技术特别是间接红细胞凝集试验(IHA及RIHA)特异性不足的两大因素:a.技术落后,试验中采用的载体不适导致了相当数量的假性凝集;b.技术方法中使用的抗原、抗体严重不纯,尤其是制备抗体时免疫动物"自身抗体"的掺入是造成交叉反应更重要的因素;(2)研制并开发出分泌抗鼠疫F1单克隆抗体(F1-McAb)的杂交瘤株164株,并从其中筛选出针对不同位点的高效瘤株6株,经活性鉴定及配对试验形成了4个组合,具高效价和高活性;(3)使用制备电泳技术将鼠疫F1抗原提纯至电泳纯水平;(4)将鼠疫F1-McAb提纯至免疫纯水平;(5)引进、消化了具有先进水平的胶体金标免疫层析技术;(6)使用电泳纯的鼠疫F1抗原及免疫纯的鼠疫F1-McAb构建了能自人和动物血液中直接检测鼠疫特异抗体的金标免疫层析技术(GICA)和能自人和动物脏器或穿剌物中直接检测鼠疫F1抗原或鼠疫病原的反向金标免疫层析技术(RGICA);(7)由于采用了纯化的抗原、抗体,提高了标记效果,其敏感性超过IHA和RIHA,阳性检出率在排除了假阳性和交叉反应后依然高出血凝约5%左右;(8)上述两项技术实验室内经44株非鼠疫菌抗血清和90株非鼠疫菌交叉测定、中和试验以及蛋白印迹鉴定(Western blotting)均证实反应特异,基本消除了传统技术存在的非特异反应;(9)经4省(区)不同宿主动物3 168份(其中血清材料2 265份,脏器材料903份)现场标本验证,与实验室取得了一致的结论.结论胶体金免疫层析测试条较好地解决了特异性之难题,有效地避免了其它病原微生物导致的以及酸、碱和嗜异性凝集素、低温条件等造成的假性凝集,同时也有效地消除了由于抗原、抗体不纯,特别是实验动物自然感染其它病原产生的"自身抗体"导致的交叉反应,该技术操作简便,特别适合现场和边远地区应用,对比传统技术该法不需专业性操作,不需仪器设备,因而乡村医生可自行进行操作并做出诊断.
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关于甲醛固定石蜡包埋组织提取DNA质量的探讨
目的:探讨甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)提取DNA后PCR扩增产物检测率的提高.方法:应用从FFPET提取的DNA,PCR反应扩增β-Globin(110 bp),分析纯化前后DNA PCR产物的检测率.结果:纯化后的DNA模板PCR反应取得高质量目的基因.结论:纯化后能有效去除不能通过蛋白酶K消化和有机萃取法去除 的PCR反应抑制因子,利于PCR反应成功.
