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C群脑膜炎奈瑟菌部分蛋白表型特征分析
目的 以蛋白质组学研究为基础,分析2003～2005年间我国流脑暴发流行期间C群脑膜炎奈瑟菌菌株分布特征.方法 利用双向电泳技术获得66株2003～2005年流脑流行期内分离的C群脑膜炎奈瑟菌菌株及2株参考菌株的2-DE电泳图谱,并结合质谱分析的结果进行部分外膜蛋白和sucD蛋白表型分析.结果 根据外膜蛋白和sucD蛋白将实验菌株共分为9型,其中安徽菌株分型结果显示出了高度的一致性,而其他地区菌株分型分布则显示出高度的多态性.结论 安徽已经有优势菌型形成,但优势菌型还没在全国范围内出现,此类菌型分布和变迁的检测可能对认识流脑的流行规律和有效进行流脑疾病控制具有重要意义.
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弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS影响FliC的表达和分泌
目的 研究弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛功能.方法 构建弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛的精确缺失突变株(CF74△T6SS).对弗氏枸橼酸杆菌CF74和其突变株CF74△T6SS的全菌蛋白和上清蛋白进行提取,并进行2-DE分析.结果 在CF74△T6SS全菌蛋白中,有4个蛋白表达上调,42个蛋白表达下调,并且FliC的表达下调十分明显;在CF74△T6SS的培养上清中,有27个蛋白表达上调,36个蛋白表达下调,并且FliC、FlgK和FliD的表达下调十分明显.结论 弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS可以影响FliC蛋白的表达和分泌.
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我国脑膜炎奈瑟菌孔蛋白PorA、PorB的多态性分析
目的 以蛋白质组学研究为基础,分析2003-2005年我国流脑暴发流行期间C群脑膜炎奈瑟菌菌株特征,建立以致病性相关蛋白多态性为目标的新分型方法.方法 利用双向电泳和MALDI-TOF质谱鉴定分析2003-2005年流脑流行期内分离的66株C群脑膜炎奈瑟菌菌株及2株参考菌株的蛋白表达,重点分析与致病性相关的蛋白多态性特征.结果 根据孔蛋白PorA、PorB在双向电泳中的多态性,建立了12个特征菌型.安徽菌株的PorA和PorB蛋白电泳谱型显示出了高度的一致性,而其他地区的菌株则显示出高度的多态性.结论 PorA和PorB蛋白2-DE电泳谱型可以作为一种新的菌株分型方法,可能在菌型变迁检测和流脑暴发预警中具有重要应用前景.
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递增负荷运动对大鼠心房肌蛋白质组研究的影响
目的:通过探讨递增负荷运动对大鼠心房肌蛋白质组的影响,以筛选出心房肌组织中对运动应激具有重要意义的差异性表达的目标蛋白质,在蛋白质组学水平上研究运动对心脏功能与结构影响的规律.方法:10只雄性SD大鼠,分为运动组(n=5)和对照组(n=5).递增负荷运动训练7周,力竭运动后6h,运动组和对照组同时麻醉处死.提取心房肌组织的全蛋白,依次对样品蛋白进行pH梯度-SDS双向凝胶电泳分离蛋白、改良考马斯亮蓝方法染色、基质辅助激光解吸离子化飞行时间串联质谱分析.结果:运动组和对照组蛋白质斑点数目分别是354±40个和382±24个;共获得具有两倍以上差异性表达的蛋白质点104个;运动后上调两倍以上的蛋白质点66个,运动后下调两倍以上的蛋白质点38个.选择差异性表达5倍以上的蛋白质点为目标蛋白进行质谱分析,共鉴定出5个蛋白质点.结论:在运动应激状态下,大鼠心房肌蛋白质发生了明显的差异性表达,这些差异性表达的蛋白质点为进一步深入运动对心脏结构与功能影响的新的目标蛋白提供了实验依据.
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运动心脏重塑中大鼠右心室肌的差异蛋白质组学研究
目的:探讨在运动心脏的发生过程中,右心室肌蛋白质组的差异表达,筛选对研究运动心脏重塑机制有重要意义的右心室蛋白质.方法:18只雄性SD大鼠按运动能力和体重随机配伍分为对照组和运动组,每组9只.运动组进行12周中等强度有氧运动(70～80%VO2max),后与对照组同时称取体重、麻醉处死,称取心脏重量,提取右心室肌的全蛋白,对样品蛋白用双向凝胶电泳技术分离、后固定染色.运用Bio-rad PD quest图像分析软件对双向凝胶电泳图谱进行分析,选取差异蛋白进行质谱鉴定.结果:经过12周运动后,运动组心脏出现明显形态学变化.此次实验获得了重复性和分辨率较好的双向凝胶电泳图谱,与对照组相比,通过软件分析,上调到10倍以上或下调至1/10及以下的差异点31个,其中7个上调,24个下调.这些点多位干分子量50～70kDa和10～20kDa、等电点7.0～9.0范围内.质谱分析并鉴定了其中2个蛋白点,包括丙酮酸脱氢酶E1α1(运动12周后下调)和一个未知蛋白.结论:12周运动后大鼠右室肌蛋白质组发生了明显变化.能量代谢酶的变化提示中等强度运动对心脏产生的重塑作用可能主要引起右心室肌能量代谢水平的变化.
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Hela细胞蛋白质分离和肽质量指纹谱鉴定方法的建立
目的 研究Hela细胞总蛋白质的分离及利用肽质量指纹谱对蛋白质进行鉴定的方法 .方法 提取了Hela细胞的总蛋白质,通过双向电泳技术对蛋白质进行了分离,并应用图像扫描仪及图像分析软件获取蛋白质点的数字化信息.对其中不同丰度的蛋白质点,进行胶内酶切后,通过基质辅助激光解吸/电离直角型飞行时间质谱(MALDI O-TOF-MS)分析,再将检测出的多肽质量数通过Mascot搜索引擎检索NCBInr数据库.结果 获得了Hela细胞总蛋白质双向电泳图谱及蛋白质点的数字化信息,通过MALDI O-TOF-MS检测得到的肽质量指纹谱再经过网上公共数据的检索从而获得3个蛋白质点分别是α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、γ-肌动蛋白(γ-actin)和过氧化物酶2(peroxiredoxin 2).结论 Hela细胞总蛋白质双向电泳的分离效果较好,肽质量指纹谱法能有效地对Hela细胞的蛋白质斑点进行鉴定.
关键词： Hela细胞 蛋白质组 2-DE MALDIO-TOF-MS 肽质量指纹图谱 -
CyclinE干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和蛋白质组的影响
目的:研究siRNA对HepG2细胞株cyclinE表达的抑制及细胞生长的影响,并用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质.方法:构建质粒表达载体pU6-cyclinE-shRNA,稳定转染肝癌HepG2细胞株,获得HepG2-cyclinEshRNA细胞系,RT-PCR检测cyclinE mRNA表达,MTT测定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期.裂解、抽提HepG2-cyclinEshRNA细胞和Cl期肝癌HepG2细胞全蛋白,用双向电泳技术进行分离后.用Proxpress2D分析软件对两组细胞全蛋白质表达谱进行差异分析,并应用MALDI-TOF-MS和数据库搜索鉴定差异显著的蛋白点.结果:HepG2-cyclinE-shRNA细胞与转染空质粒HepG2细胞和未转染的HepG2细胞相比,生长速度减慢,出现G0/G1期细胞增多,C2/M和S期细胞减少.双向电泳后软件分析G1期肝癌HepG2细胞株平均检测到435±51(n=3)个蛋白点,HepG2-cyclinEshRNA细胞376±44(n=3)个,匹配分析,筛选出两组间差异6倍及以上且出现频率大于等于50%的蛋白点20个.应用质谱鉴定出角蛋白19、波形蛋白、神经多肽113等8个G1期HepG2细胞高表达蛋白点.结论:在HepG2细胞株中,导入eydinE干扰RNA,可有效抑制cyclinE的表达,进而使细胞增殖减缓,逆转其恶性表型.两组细胞蛋白质谱有明显差异,鉴定出G1期HepG2细胞高表达蛋白点8个,这些蛋白的高表达引起肿瘤的基因修饰异常、分化异常、增殖紊乱,肿瘤侵袭转移.
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递增负荷运动后大鼠心房肌蛋白质组的差异性表达
目的:以往的许多研究都是针对心房的单个蛋白质进行的,没有系统地对心房的"全部"蛋白质进行研究,因而不能全面地对心房在运动性心脏重塑或运动性心脏疲劳中的作用做出解释.本实验应用双向凝胶电泳技术,认识递增运动负荷训练后,大鼠心房肌组织中对运动应激具有重要意义的差异性表达的目标蛋白质,从蛋白质组学水平上探讨运动性疲劳的发生及发展的规律.方法:实验于2006-11/2007-03在湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与蛋白质组学国家教育部重点实验室和省级运动人体科学实验室完成.①实验动物:10只雄性SD大鼠,随机分为运动组5只和对照组5只.实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求.②实验方法:递增运动负荷训练7周,力竭运动后6 h,运动组和对照组同时麻醉处死.提取心房肌组织的全蛋白,依次对样品蛋白进行pH梯度-SDS双向凝胶电泳分离蛋白、改良考马氏亮蓝方法染色.运用Bio PD quest图像分析软件对双向凝胶电泳图谱进行分析.结果:①运动组和对照组蛋白质斑点数目分别是(354±40)个和(382±24)个,匹配率分别为(68.67±9.87)%和(72.67±8.62)%,相关系数为0.71.②共获得具有2倍以上差异性表达的蛋白质点104个.③运动后上调2倍以上的蛋白质点66个,其中运动后上调5倍以上的蛋白质点18个,未见运动后新增的蛋白质点.④运动后下调2倍以上的蛋白质点38个,其中运动后下调5倍以上的蛋白质点23个,运动后消失的蛋白质点7个.结论:在运动应激状态下,大鼠心房肌蛋白质发生了明显的差异性表达,这些差异性表达的蛋白质点为进一步深入观察具有运动性疲劳特征的新的目标蛋白提供了充分的实验依据.
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以蛋白质组学方法筛选人源性大肠癌噬菌体抗体库
目的以蛋白质组学相关技术进行初步筛选人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库,建立一种寻找特异性大肠癌抗原蛋白及相应的噬菌体抗体的方法.方法以二维凝胶电泳分离大肠癌组织和正常大肠粘膜组织蛋白组并将获得的2-DE凝胶电转至PVDF膜.然后以大肠癌组织匀浆为靶抗原对我们构建的人源性大肠癌Fab段噬菌体初级抗体库进行三轮淘洗,再用富集抗体库和PVDF膜进行Western-Blot印记实验.结果经Western-Blot印记实验我们发现了至少八个大肠癌表达而正常大肠粘膜不表达的有噬菌体抗体特异性结合活性的抗原蛋白.结论成功建立了双盲,双向,高通量筛选大肠癌特异性抗原及其相应噬菌体抗体的方法.
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应用蛋白质组学及噬菌体抗体库技术筛选大肠癌特异性抗原及抗体方法的建立
目的构建大肠癌患者转移淋巴结Fab段噬菌体抗体库并结合蛋白质组学相关技术进行初步筛选大肠癌特异性抗原蛋白及相应的噬菌体抗体.方法取大肠癌患者系膜转移淋巴结,提取总RNA,RT-PCR扩增重链Fd和轻链cDNA,将扩增产物依次插入载体pComb3,电转感受态大肠杆菌XLI-Blu,加噬菌体VCSM13超感染.以二维凝胶电泳分离大肠癌细胞和正常大肠粘膜蛋白组并转至PVDF膜,将银染胶图用Melanie112-DE分析软件进行分析,以大肠癌组织匀浆为靶抗原对初级抗体库进行三轮淘洗,再用富集抗体库和PVDF膜进行Western-Blot印迹实验.结果成功建立了大肠癌Fab段噬菌体抗体库.建立了平均877个斑点的大肠癌平均胶图和847个斑点的正常大肠粘膜平均胶图.经Western-Blot印记实验我们发现了至少八个大肠癌表达而正常大肠粘膜不表达的有噬菌体抗体特异性结合活性的抗原蛋白.结论成功建立了双盲、双向、高通量筛选大肠癌特异性抗原及其相应噬菌体抗体的方法.
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不同转移能力肺腺癌细胞系AGZY83-a和Anip973的比较蛋白质组学研究
目的 寻找高低转移能力肺癌细胞中潜在的蛋白标记以更好的解释肺腺癌转移机制.方法 用双向电泳的方法对高低转移能力肺腺癌细胞系AGZY83-a和Anip973进行了比较蛋白质组学分析.选取差异较大的候选差异表达蛋白进行基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)分析并鉴定.结果 双向电泳胶图分析结果说明两细胞系的蛋白表达差异具有统计学意义.MALDI-TOF-MS鉴定证实这3个蛋白分别为Stathmin 1蛋白、磷酸甘油酸变位酶1(PGAM 1)和热休克蛋白27(HSP27).结论 在高转移细胞系Anip973中,HSP表达显著升高,Stathmin 1和HSP27表达显著下降,这3种蛋白与肿瘤的发生和恶性程度密切相关.
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快速老化小鼠额叶皮质的蛋白组学研究
目的:探讨快速老化过程中差异蛋白质及其与学习记忆的关系.方法:以13月龄和8月龄快速老化小鼠模型的快速老化亚系SAMP8和抗快速老化亚系SAMR1的额叶为研究对象,经双向电泳技术和考马斯亮兰G250染色,分别获取13月龄和8月龄SAMP8和同龄SAMR1额叶的2-DE考染图谱,用PDQuest 7.40图像分析软件,建立不同月龄蛋白质组的匹配差异图谱,分析图谱中SAMP8与SAMR1蛋白质的表达变化.结果:8月龄SAMP8额叶检测到579个蛋白点,同龄SAMR1额叶检测到612个蛋白点;13月龄SAMP8额叶检测到705个蛋白点,同龄SAMR1额叶检测到621个蛋白点.PDQuest7.40软件匹配差异分析显示,8月龄SAMP8与同龄SAMR1比较,SAMP8表达缺失33个蛋白,两者共有显著差异表达蛋白35个.13月龄SAMP8与同龄SAMR1比较,SAMR1中表达缺失84个蛋白,两者均有但表达有显著变化的蛋白质36个.13月龄和8月龄的SAMP8互相比较,13月龄组新增蛋白126个,二者共有差异表达蛋白58个.13月龄和8月龄的SAMR1比较,13月龄组新增9个蛋白,二者共有差异表达蛋白33个.结论:两组不同月龄小鼠额叶SAMP8和SAMR1存在差异表达蛋白质,进一步研究有助于了解衰老的发生机制,并为研发调节学习记忆蛋白的新药提供依据.
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蛋白质组学及其在神经科学中的应用
蛋白质组学这一概念从提出到现在已应用到生命科学许多领域.在中枢神经系统中,全脑以及许多脑区的蛋白质组数据库逐步建立,并且已经鉴定出了许多在神经系统疾病过程中起重要作用的蛋白.虽然神经系统蛋白质组学的研究尚处于起步阶段,但在阐明某些疾病的发病机制方面已取得长足发展.本文对蛋白质组学及其在神经科学中的研究进展作一综述.
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用免疫蛋白质组学技术筛选烟曲霉分泌蛋白中的免疫优势抗原
目的 用免疫蛋白质组学技术筛选烟曲霉分泌蛋白中的免疫优势抗原,用于侵袭性曲霉病(IA)的诊断标志物及疗效监测.方法 YEPG培养基培养14 d的真菌分泌蛋白质进行二维电泳(2-DE)分离,用抗曲霉抗体阳性的IA确诊患者混合血清进行免疫印迹,再用质谱分析及生物信息学方法鉴定阳性反应点.结果 2-DE、免疫印迹结果显示,确诊IA患者血清与分泌蛋白质中多种抗原反应强烈.40个蛋白质点被抗体阳性IA患者血清识别.对40个蛋白质点质谱分析,成功鉴定了39个免疫反应阳性的蛋白质点,代表17种蛋白质,包括分泌型二肽基肽酶V(DppV)、NAD-依赖型苹果酸脱氢酶、硫氧还蛋白还原酶、醛脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶等.在鉴定出的17种蛋白质中,有2个为已知抗原,15个首次报道为免疫原性蛋白质.有7种免疫原性蛋白质显示有多个蛋白质点.且在新发现的免疫原性蛋白质中,2号蛋白质(共13个蛋白质点)免疫反应强,鉴定结果为硫氧还蛋白还原酶.结论 免疫蛋白质组学技术是筛选病原体免疫优势抗原的一种有效方法,此次鉴定的抗原可能是潜在的疾病标志物,但还需进一步地实验加以评估.
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具有荚膜的白假丝酵母菌蛋白质组学分析
目的:研究从淋病患者阴道分泌物中分离鉴定的具有荚膜的白假丝酵母菌蛋白质组学特征.方法:采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离从淋病患者阴道分泌物中分离鉴定的具有荚膜的白假丝酵母菌(C14)和无荚膜的白假丝酵母菌(ATCC14053)的菌体蛋白质,用ImageMaster 2D platinum 7.0软件识别差异蛋白点,MALDI-TOF-MS鉴定差异蛋白.结果:C1-4与ATCC14053相比,显著差异表达蛋白点232个,其中180种蛋白表达明显上调,52种蛋白表达明显下调,质谱鉴定了32差异蛋白质点,8个得到鉴定,均在C1-4菌株显著表达.结论:具有荚膜的白假丝酵母菌与无荚膜的白假丝酵母菌菌株相比,蛋白质表达存在明显差异.
关键词： 白假丝酵母菌 荚膜 蛋白质组学 2-DE MALDI-TOF-MS -
胃癌蛋白质组学研究进展
使用二维凝胶电泳(2-DE)、质谱和生物信息学技术,发现多种蛋白(如CagA,GroEL,TsaA等)与幽门螺杆菌的致胃癌机制有关;并找到了一些胃癌细胞株和胃癌组织的特异性蛋白,如ErbB3,annexin V,prohibitin等;证明了丙酮酸激酶M2蛋白等胃癌耐药相关蛋白的存在.
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放疗诱导鼻咽癌细胞株CNE1热休克蛋白高表达
目的鼻咽癌是一种以放射治疗为主的头颈肿瘤,但部分鼻咽癌对放疗耐受.为了解鼻咽癌放疗耐受机制,本实验拟初步探讨人高分化鼻咽癌细胞株CNE1放疗后的蛋白质改变.方法利用固相pH梯度二维凝胶电泳,建立CNE1放疗前后总蛋白质2-DE图谱,利用MALDI-TOF-MS及数据库搜索初步分析和鉴定部分放疗前后差异蛋白质点.结果高分子量酸性蛋白质在CNE1放疗后20 min高表达,其中大多为热休克蛋白质HSPs(heat shock proteins, HSPs).结论放射能诱导CNE1的热休克蛋白高表达,它们可能与鼻咽癌放疗耐受有关.
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食品过敏原指纹图谱快速检测研究(三)--花生总蛋白2-DE指纹图谱和蛋白点MALDI-TOF/MS分析
目的建立一种简捷、准确、快速检测食品过敏原的方法.分析花生总蛋白2-DE(2-dimensionelectrophoresis)指纹图谱与蛋白点MALDI-TOF/MS分析联用的可行性.方法新鲜生花生去皮搅碎后丙酮去脂,PBS抽提总蛋白,冻干得初提样品,试剂盒精提,双向电泳IEF选择11cm非线性胶条(pH=3-10)溶胀上样,平衡后转移胶条在电泳槽中进行第二向SDS-PAGE垂直电泳(10%),考染后扫描图像进行计算机分析处理,同时在胶上任意选择两个蛋白点切胶、脱色、消化后进行MALDI-TOF/MS分析.结果2-DE指纹谱图显示花生总蛋白的分布范围较窄,主要是一些中、小分子量的中性、弱酸和弱碱性蛋白,用PDQuest 2-D Analysis分析软件对此2-DE图谱分析可以发现其中共有178个特征性蛋白点.以花生总蛋白2-DE指纹图谱为基础,进一步对单个蛋白点进行MALDI-TOF/MS指纹图谱分析,结果显示每一个蛋白点都具有自己特征的分子量峰和图谱形状,无需进行肽片段混合物的分析、检索亦可完全区分不同的蛋白点,从而可以对食品过敏原进行更深入、更准确的指纹图谱检测.结论食品过敏原总蛋白2-DE指纹图谱与蛋白点MALDI-TOF/MS指纹图谱分析联用可以更好的进行食品过敏原指纹图谱快速检测研究.
关键词： 食品过敏原 指纹图谱 2-DE MALDI-TOF/MS 快速检测 -
食品过敏原指纹图谱快速检测研究(二)--河虾总蛋白2-DE指纹图谱重现性分析
目的建立一种简捷、准确、快速检测食品过敏原的方法.分析河虾总蛋白2-DE(2-Dimension Electrophoresis)指纹图谱的重现性,确定食品过敏原指纹图谱快速检测的可行性.方法新鲜河虾,去头和虾皮,搅碎后丙酮去脂,PBS抽提总蛋白,冻干后为初提样品,试剂盒精提,双向电泳IEF选择11cm和13cm两种不同厂家、规格的非线性胶条(pH=3～10)溶胀上样,平衡后转移胶条在不同厂家、型号的电泳槽中进行第二向SDS-PAGE垂直电泳(10%),银染和考染后扫描图像进行计算机分析处理.结果2-DE谱图显示河虾总蛋白分布较广,其高丰度蛋白主要是一些大分子量酸性蛋白.不同电泳系统,选用不同规格的IPG胶条所得河虾总蛋白2-DE指纹谱图具有良好的重现性.银染灵敏度较高,更适合食品过敏原指纹图谱的快速检测.结论食品过敏原总蛋白2-DE指纹图谱具有良好的重现性和稳定性,可以用于食品过敏原的快速检测.
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食品过敏原指纹图谱快速检测研究(一)--鲫鱼、鲢鱼总蛋白2-DE指纹图谱分析
目的建立一种简捷、准确、快速检测食品过敏原的方法.分析鲫鱼和鲢鱼总蛋白2-DE(2-dimension electrophoresis)指纹图谱,确定食品过敏原指纹图谱快速检测的可行性.方法取新鲜鲫鱼和鲢鱼,去内脏和鱼鳞,在预冷的丙酮中搅碎,用丙酮去脂,PBS抽提总蛋白,PBS透析,冻干得初提样品.用Clean-up Kit试剂盒对两种鱼的总蛋白初提样品进行精提.双向电泳第一向IEF选择13 cm非线性胶条(pH=3-10),采用溶胀方法上样,达到平衡后转移胶条进行第二向SDS-PAGE垂直电泳(10%),银染,脱色后扫描图像进行计算机分析处理.结果2-DE图像显示鲫鱼和鲢鱼总蛋白主要是中等分子量蛋白,呈弱酸性和弱碱性,其蛋白点既有相同点也有差异点.结论通过2-DE指纹图谱分析完全可以区分这两种不同的鱼类,对于差异性蛋白点可以给出明确的判定.
