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HPLC同时测定参附汤中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱含量的研究
[目的]建立参附汤中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的含量测定方法.[方法]采用Hypersil BDSC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,柱温25℃,流动相为甲醇、0.1％三乙胺,梯度洗脱,流速:1.0mL· min-1,检测波长237nm.[结果]新乌头碱在0.005～0.5mg· mL-1范围内线性关系良好,r=0.9999,平均回收率98.49％,相对标准偏差(RSD)为2.31％；乌头碱在0.005～0.5mg·mL-1范围内线性关系良好,r=0.9999,平均回收率99.88％,RSD为157％；次乌头碱在0.005～0.5mg·nL-1范围内线性关系良好,r=0.9999,平均回收率99.67％,RSD为1.75％.[结论]该方法学考察符合定量要求,结果准确,可用于同时测定参附汤中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的含量,为参附汤的质量控制提供依据.
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兔急性草乌中毒血液灌流后的毒代动力学研究
目的:建立高效液相色谱-质谱检测兔血浆乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的方法,研究兔急性草乌中毒血液灌流后的毒代动力学.方法:普通级健康成年雄性日本大耳白兔8只,体重(2.5±0.2)kg,予草乌酒1.0 mL/kg灌胃(i.g.)染毒,染毒后0.25 h予血液灌流2 h.分别于染毒后0.5、1、1.5、2、3、4、6、12、24 h取血浆.以高效液相色谱-质谱法检测血浆新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的浓度.应用DAS 2.0程序计算毒代动力学参数.结果:急性草乌中毒血液灌流后,新乌头碱毒代动力学参数为:t_(max)(3.1±0.8)h、C_(max)(11.5±2.1)μg/L、K_a(1.6±0.9)h、K_e(0.13±0.05)h、t_(1/2)(5.9 ± 1.7)h、 V/F(85.4 ±20.9)L/kg、CL/F(10.28±1.46)L·h~(-1)·kg~(-1);乌头碱毒代动力学参数为:t_(max)(3.2±0.5)h、C_(max)(18.7±5.5)μg/L、K_a(1.2±0.4)h、K_e(0.10±0.03)h、t_(1/2)(7.5±2.4)h、V/F(2.7±1.0)L/kg、CL/F(0.25±0.08)L·h~(-1)·kg~(-1);次乌头碱毒代动力学参数为:t_(max)(3.0±0.8)h、C_(max)(14.6±11.0)μg/L、K_a(1.4±1.2)h、K_e(0.09±0.03)h、t_(1/2)(8.3±2.1)h、V/F(10.7±6.9)L/kg、CL/F(0.85±0.38)L·h~(-1)·kg~(-1).结论:急性草乌中毒兔血液灌流治疗后的毒代动力学呈一级吸收的一室模型.
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高效液相色谱法测定风湿骨痛丸中双酯型生物碱的限度
目的 建立高效液相色谱法测定风湿骨痛丸中双酯型生物碱的限度.方法 供试品采用超声处理法,双酯型生物碱中三种成分通过菲罗门C18被检测,柱温30℃,以乙腈-四氢呋喃-0.1 mol·L-1的乙酸铵溶液(每1 000 mL中加冰醋酸0.5 mL)(12.5:7.5:80)为流动相,检测波长230 nm.结果 乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰分离度均良好,且无干扰.结论 此法准确,重复性好,可用于控制该处方中制川乌、制草乌中双酯型生物碱的限度.
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RP-HPLC同时测定附子地上部分中新乌头碱和次乌头碱的含量
目的 建立RP-HPLC法,测定附子地上部分中新乌头碱和次乌头碱的含量.方法 采用Venusil ABS C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.1% 乙二胺溶液为流动相,梯度洗脱,柱温30 ℃,流速 1 ml·min-1,检测波长230 nm.结果 新乌头碱、次乌头碱均得到较好分离,分别在12.5～1 200 mg·L-1、11.46～1 100 mg·L-1呈良好的线性关系;加样回收率分别为99.72%(RSD=0.69%),100.29%(RSD=1.07%).结论 该方法简便、灵敏、准确,可用于附子中双酯型生物碱的定量分析.
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高效液相色谱法测定祛痹止痛散中新乌头碱的含量
祛痹止痛散由川乌、羌活、当归、白芷、藁本等药组成,川乌为君药,其所含主要有效成分为乌头碱、新乌头碱和乌头次碱等,以新乌头碱的含量高.现参照新乌头碱含量测定的相关文献[1～4],对本制剂中的新乌头碱进行了含量测定方法研究.
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中药制剂乌头碱含量测定
目的:观察超高效液相色谱-质谱法测定中药制剂乌头碱的含量.方法:以参附注射液为例,采用超高效液相色谱-质谱法测定乌头碱含量,确定样品溶液pH值等佳提取时间.精确程度定量乌头碱对照品储备液,制备成1μg·L-1乌头碱、新乌头碱和次乌头碱,然后依次稀释,将乌头碱浓度分别稀释到100 ng·L-1、10 ng·L-1、2.5 ng·L-1、1.0 ng·L-1、0.25 ng·L-1、0.1 ng·L-1.按照设定色谱参数条件进行检测,记录峰值面积.结果:在0.1 ～100 ng·L-1内,乌头碱线性回归方程为y =492.1x+ 122.3(r =0.999 2),线性关系良好;新乌头碱线性回归方程为y=117.1x +218.3(r =0.999 2),线性关系良好;次乌头碱线性回归方程为y=355.9x+ 98.34(r=0.999 6),线性关系良好.乌头碱、新乌头碱、次乌头碱加样回收率分别为100.3％、97.7％、97.4％,乌头碱峰面积RSD为1.6％,新乌头碱峰面积RSD为1.6％,次乌头碱峰面积RSD为2.9％.结论:超高效液相色谱-质谱法测定中药制剂乌头碱含量稳定性好,能够保证用药安全,为正确评价药学作用提供科学依据.
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超高效液相色谱法同时测定胃内容物中3种乌头碱
目的 建立超高效液相色谱法同时测定胃内容物(或呕吐物)中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的方法.方法 样品经0.1 mol/L盐酸提取,8 000 r/min离心20 min,残渣重复提取一次,合并上清液用Oasis HLB固相萃取柱净化后,解析液45℃氮吹至干,已腈-0.1％乙酸(1:1,V/V)复溶,过0.22 μm滤膜进样,ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)液相色谱柱分离,紫外检测器检测,外标法定量.结果 乌头碱、次乌头碱、新乌头碱在相应的浓度范围内线性关系良好,相关系数(r)为0.996 ～0.999 5,检出限分别为0.075 mg/kg、0.10 mg/kg、0.05 mg/kg,定量限分别为0.23 mg/kg、0.30 mg/kg、0.15 mg/kg;空白基质中加标实验显示加标回收率为86.3％ ～1 10.9％,加标回收率的精密度为3.50％ ～ 9.70％.结论 该方法操作简便,准确度好,精密度高,能对胃内容物(或呕吐物)中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱进行定性定量检测.
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薄层色谱扫描法快速检测乌头碱中毒
目的:建立乌头碱中毒的薄层色谱快速检验方法.方法:样品加乙醚,(NH4)2SO4后调pH到10,分出有机层加盐酸,弃去乙醚层,水层加二氯甲烷和氨水提取,挥干后20μ1乙醇定容,lOμl点于HPGF254板上,环己烷:乙酸乙酯:二乙胺(8:1:1)饱和上行展开5～7 cm,薄层色谱扫描定性和定量检测.结果:乌头碱线性范围为1～32μg/ml,新乌头碱与次乌头碱均为4～28μg/ml,小检出浓度0.1μg/ml.结论:本法快速、简便,定性定量准确,可用于乌头碱中毒的快速诊断和乌头碱中毒致死的法医学鉴定.
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蒙药材草乌及其炮制品中几种双酯型生物碱的含量比较
目的 用高效液相色谱法比较蒙药材草乌及其炮制品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量.方法 色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为乙腈-四氢呋喃(25∶15, V/V),B为 0.1 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸(100∶0.05,V/V),梯度洗脱;检测波长为235 nm;流速1.0 ml·min-1;柱温为30℃;进样量10 μl.结果 蒙药材草乌经特殊炮制后,炮制品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量均低于草乌生品,诃子制草乌中含量低,甘草制草乌含量次之,酸奶制草乌含量高.结论 3种炮制方法使草乌药材中双酯型生物碱含量大大降低,可用于指导蒙医临床用药.
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附子中新乌头碱的含量测定
目的 建立以高效液相色谱法测定附子中新乌头碱含量的方法.方法 采用Welchrom-C18 色谱柱(5 μm ,4.6 mm×250 mm),以甲醇-水-三乙胺(75∶25∶0.033)为流动相,流速为1.0 ml·min-1,检测波长为233 nm,柱温为30℃.结果 新乌头碱在0.046 4～0.324 8 μg范围内呈良好线性关系,r=0.999 9;平均回收率为100.7%,RSD=2.19%.结论 该方法操作简便、准确、重复性好,可用于附子中新乌头碱的含量测定.
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反相高效液相色谱法测定附子中乌头碱等3种成分的含量
目的 测定附子中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量.方法 采用反相高效液相色谱(PR-HPLC)法,使用UltimateTM XB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5μm);流动相为乙腈-0.2%冰醋酸(浓氨水调节pH值为7.29);检测波长:230 nm;流速1.0 ml·min-1;柱温为35℃.结果 乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的回归方程分别为:Y=31.258X+5.794,r=0.999 9;Y=17.418X+5.236 9,r=0.999 8;Y=18.989X+6.186 6,r=0.999 7.三者的线性范围分别为:3.3125～106μg/ml;0.735 7～23.541 9μg/ml;1.966 1～62.916 4μg/ml.结论 该方法简便、准确、分离效果好、灵敏度高,可用于附子的质量控制.
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附子不同炮制品三种单酯型生物碱的含量差异研究
目的 研究乌头碱、新乌头碱和次乌头碱在不同主产地不同附子炮制品中的含量变化,为附子中药的行业质量标准的建立提供依据.方法 采用Alltimate C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以40 mmol·L-1醋酸铵(氨水调pH=10.00)-乙腈为流动相梯度洗脱;流速1.0ml· min-1;检测波长240 nm.结果 三种单酯型生物碱新乌头碱、乌头碱、次乌头碱均得到良好的分离,回归方程分别为:Y=15.952X-16.118 R2 =0.9997;Y=15.906X-2.6445 R2 =0.9998;Y=13.218X-23.044R2 =0.9999.三者线性范围是2.5 ～250μg,2.2 ～220 μg,2.6 ～260 μg.结论 该方法的精密度、重复性和稳定性良好,可用于附子炮制品的鉴别和内在质量控制.
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四逆汤中乌头类生物碱的研究进展
中药复方是中医治病的主要临床应用形式,复方中的有效成分是中药发挥药效作用的物质基础.进行复方有效成分的研究,在阐明中医的方药理论,揭示中药的配伍规律和作用机制,优化制剂工艺,制定质控标准,实现中医药现代化并走向国际市场等方面均具有重要意义.四逆汤是东汉张仲景所创名方,由附子、干姜、炙甘草组成,具有回阳救逆之功效,临床常用于阳虚欲脱、脉微欲绝等证.四逆汤主要含乌头类生物碱,包括乌头碱(Aconitine)、新乌头碱(Mesaconitine)、次乌头碱(Hypaconitine)及其水解产物,对其进行研究对于阐明四逆汤回阳救逆的物质基础具有重要的意义.
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不同物理因子对新乌头碱体外透皮吸收的影响
目的 观察不同物理因子促新乌头碱(MA)透皮吸收的效果,同时测定新乌头碱透人量与作用时间的关系.方法 首先采用高效液相色谱法(HPLC)建立新乌头碱的色谱峰(Y)与含量(X,μg)的标准曲线.选取成年大鼠28只,将其随机分成4组(每组7只).各组大鼠分别在直流电场、低频脉冲电场、超声场及自由,透皮条件下进行离体鼠皮的透皮吸收实验.分离各组大鼠背部皮肤,建立离体透皮吸收模型,采用V-C渗透池,将离体鼠皮置于供药池及接受池之间,角质层面向供药池侧.以含生药3 g/ml浓度的生川乌提取液作为释放液,生理盐水作为接受液.各组分别于实验开始后10,20,30,40及50 min时从接受液中取样,根据已求得的Y-X标准曲线测定各取样液中新乌头碱的浓度以及各时间点(t,min)新乌头碱的累积渗透量(Q,μg/cm2).通过Q-t曲线图求得新乌头碱体外透皮吸收的渗透速率(J,μg·cm-2·min-1),并以此为参数观察不同物理因子干预条件下新乌头碱的透皮吸收状况以及药物透过量与时间的关系.结果 在新乌头碱体外透皮吸收实验开始后50 min内,检测到自由透皮组、超声促透组、脉冲电促透组、直流电促透组的渗透速率J分别为4.168,6.111,12.268及12.623 μg·cm-2·min-1;对各组的曲线渗透速率进行统计学分析,发现超声促透组和自由透皮组间差异无统计学意义(P＞0.05);脉冲电促透组、直流电促透组分别与自由透皮组比较,发现其间差异均有统计学意义(P＜0.05);直流电促透组与脉冲电促透组比较,其间差异无统计学意义(P＞0.05).在整个实验过程中,各组新乌头碱的累积渗透量均呈持续性增长.结论 在体外透皮吸收过程中,超声对新乌头碱的促透作用不大,直流电和脉冲电的促透作用较明显;直流电与脉冲电促透作用两者间比较,发现差异无统计学意义(P＞0.05);各组自实验开始后50 min内,其新乌头碱的透皮量均随时间延长而持续增多.
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不同配比乌头汤组方中两种生物碱含量变化
目的 研究乌头汤不同配比组方中新乌头碱和次乌头碱含量的变化.方法 采用高效液相色谱法,将乌头汤中制川乌与其余各药以不同量配比,考察对新乌头碱、次乌头碱的影响.结果 所建立的新乌头碱、次乌头碱线性回归方程分别为Y=4.253X+30.98(r=0.999 4),Y=3.713X+96.02(r=0.999 3);线性范围分别为4.95～79.20,12.18～194.80 μg·L-1.乌头汤中制川乌与其余各药不同配比对新乌头碱和次乌头碱含量影响很大,当制川乌、麻黄、黄芪、白芍和炙甘草组方为6,5,13,7,13 g时,新乌头碱和次乌头碱含量之和大.新乌头碱和次乌头碱在线性范围内线性关系良好.结论 以新乌头碱和次乌头碱含量变化研究乌头汤组方配比,能更好地保证乌头汤的疗效,降低其毒副作用.
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HPLC梯度洗脱法同时测定活血镇痛膏中防己诺林碱、粉防己碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱
目的:建立同时测定活血镇痛膏中的防己诺林碱、粉防己碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量的HPLC梯度洗脱法. 方法:采用 Dikma-C18色谱柱(200 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇-乙腈(3∶1)(A)与0.06%二乙胺水溶液(B)为流动相,进行梯度洗脱,检测波长分别为280 nm(防己诺林碱和粉防己碱)、235 nm(新乌头碱、乌头碱和次乌头碱),流速1.0 ml·min-1,柱温30 ℃,进样量为10 μl. 结果:防己诺林碱、粉防己碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱5个成分的质量浓度分别在7.490~149.800、14.610~292.200、4.150~83.000、5.250~105.000、5.140~102.800 μg·ml-1范围内呈良好线性关系,r分别为0.999 9,0.999 8,0.999 2,0.999 6,0.999 9;平均加样回收率(RSD)分别为99.87%(0.49%),97.79%(1.11%),96.97%(1.75%),98.60%(1.50%),97.94%(0.98%)(n=6).结论:本文建立的HPLC梯度洗脱法能同时测定活血镇痛膏中的5个成分,该方法简便、稳定、可靠,可作为活血镇痛膏全面可靠的质量控制方法.
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液-质联用法同时测定大鼠血浆中的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱及其药动学
目的:建立HPLC-MS分析方法同时测定大鼠血浆中的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量,并用于研究大鼠口服附子煎液后乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的药动学.方法:血浆经氨水碱化后用醋酸乙酯进行液-液萃取.色谱柱为Alhima C18柱(250 mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇- 10 mmol·L-1醋酸铵水溶液(75:25).质谱检测方式为选择性离子监测,选择监测的离子为m/z 646.45(乌头碱),m/z 632.38(新乌头碱),m/z 615.64(次乌头碱)和m/z 336.60(盐酸小檗碱,内标).结果:血浆中乌头碱在0.05～5 μg·L-1、新乌头碱在0.5～50 μg·L-1、次乌头碱在2.5～250μg·L-1范围内线性关系良好,定量限为 0.05 μg·L-1,血浆中的平均提取回收率高于90%,批内和批间精密度均小于15%.结论:本法灵敏、可靠、简便,适用于乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的药动学研究.
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新乌头碱对K562细胞及耐柔红霉素的K562细胞凋亡的诱导作用及其机制
目的 观察温阳药新乌头碱对白血病细胞K562和K562耐柔红霉素细胞株(K562/DNR)的抑制作用及可能的分子机制.方法 应用MTT法,结合流式细胞术检测不同浓度新乌头碱对K562和K562/DNR增殖和凋亡的影响.通过Real-time PCR检测不同浓度新乌头碱作用72 h对K562和K562/DNR细胞C/EBPα、Caspase-3、p53凋亡相关基因表达的影响.结果 K562和K562/DNR细胞的增殖抑制率随着新乌头碱浓度增加及作用时间延长而上升,呈浓度、时间依赖性(均P＜0.05).新乌头碱能引起K562和K562/DNR细胞凋亡,且随着药物浓度增加,凋亡率也逐渐升高,差异均有统计学意义(均P＜0.05).Real-time PCR结果显示,经50μmol/L新乌头碱作用72 h,K562和K562/DNR细胞的C/EBPα表达下调,Caspase-3、p53表达上调,与正常对照组相比差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 新乌头碱能够引起K562和K562/DNR细胞发生凋亡,并且凋亡机制可能与下调C/EBPa基因及上调Caspase-3、p53基因有关.
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高效液相色谱法在康复新胶囊中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱含量测定中的应用分析
目的:创建高效液相色谱法并对康复新胶囊中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱含量进行测定.方法:在氨水的基础上进行乙醚提取,利用OasisMCX固相萃取柱纯化提取液,分析柱是ZORBAX SB-C8(250mm×4.6mm,5μm),流动相是0.04mol·L-1三乙胺(磷酸调pH=3)-甲醇(50:50),柱温是40℃,检测波长是235nm.结果:在0.002～1μg的范围里,新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的线性关系相对较好,回收率超过90％,RSD在2％以下.结论:高效液相色谱法操作相对简便,准确率高,分离效果好,能有效测定康复新胶囊中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱含量.
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乌头类双酯型生物碱HPLC分析方法研究进展
乌头类中药主要包括川乌、草乌和附子等,是历史悠久的临床经典药物,常应用于治疗风湿病、跌打扭伤等各类处方及中药制剂中,其特征成分和生物活性成分主要足生物碱,按结构主要分为单酯型、双酯型和胺基醇型[1],其中双酯型毒性大[2].双酯型生物碱主要有乌头碱、次乌头碱和新乌头碱,因这三种生物碱含量高、特征性强,既是有效成分又是毒性成分,所以在含乌头类制剂中常被列为含量测定的目标物.高效液相色谱法具有操作简便、样品用量少、分析重现性好、精密度好、回收率高等特点,能同时对乌头碱、次乌头碱和新乌头碱进行准确定量,分析效率高,故多为药物分析工作者采用.乌头碱、次乌头碱及新乌头碱均属二帖类生物碱,性质不太稳定,易被水解,先水解成焦乌头类生物碱,进而再水解为苯甲酰乌头原碱类生物碱口],为此增加了提取分析的难度,不少学者对其HPLC色谱条件进行了研究,以期提高对双酯型乌头碱分析的准确性.
