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利用PCR快速检测粪便标本中的鸭沙门菌
目的 建立应用PCR技术鉴定鸭沙门菌血清型的方法,并评价其特异度、灵敏度和检测下限.方法 从GenBank下载截至2015年8月的所有沙门菌基因组序列进行比对,得到鸭沙门菌血清型特异的基因序列,设计引物,建立普通PCR检测体系并验证引物的特异度和灵敏度.同时利用模拟粪便样本确定其检测下限.结果 利用鸭沙门菌特异基因AW58_15605建立的PCR检测方法,对全部鸭沙门菌纯菌及其临床样本的扩增结果均为阳性,而对鸭沙门菌血清型以外的沙门菌和肠道菌的扩增结果均为阴性,检测的特异度和灵敏度均为100％.以粪便模拟样本提取DNA为模板进行检测,增菌后该方法检测下限的灵敏度明显提高,样本经过夜选择性增菌后,检测下限可达59.1 cfu/g,较增菌前提高105倍.结论 建立了一种特异度、灵敏度高的筛查鸭沙门菌血清型方法,为快速、准确鉴定鸭沙门菌和及时处置其造成的公共卫生问题有重要作用.
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酶在食品分析中的应用
酶具有催化的高效性、专一性和作用条件温和等特点，利用酶的特性，与生物工程结合，开发新技术应用于食品分析。本文主要阐述了聚合酶链式反应、酶生物传感器在食品分析中的应用。
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无精子症和严重少精子症患者AZF/DAZ基因微缺失的分子生物学检测
目的用分子生物学方法检测无精子症和严重少精子症患者无精子基因(AZF)AZF/DAZ基因微缺失. 方法应用聚合酶链反应(PCR)技术对无精子症47例、严重少精子症4例进行Y染色体AZFa、AZFb、AZFc/DAZ、SRY的微缺失检测. 结果 51例患者缺失率为35.3%(18/51),其中AZFa、AZFb、AZFc的微缺失分别为4例(7.8%)、5例(9.8%)和4例(7.8%).无精子症患者1例(1.9%)为AZFa、AZFb的双重缺失,2例(3.9%)为AZFb、AZFc的双重缺失;2例(3.9%)为AZFa、AZFb和AZFc的三重缺失 ;51例SRY基因PCR扩增均为阳性.5例已有生育的正常男性均无AZFa、AZFb、AZFc、SRY的微缺失. 结论 AZF/DAZ(包括AZFa、AZFb、AZFc/DAZ)基因的微缺失是引起无精子和严重少精子导致男性不育的重要原因之一.AZF/DAZ基因微缺失的分子生物学检测对不明原因的不育男性行胞浆内单精子注射(ICSI)时有指导意义.
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常见食用肉中狐源性成分DNA检测试剂盒的研制与应用
目的 研制狐源性成分DNA提取和检测试剂盒.方法 对经典DNA提取方法进行改良,研制了狐源性成分DNA提取和检测试剂,开发了狐源性成分DNA检测试剂盒,并对试剂盒检测参数进行评价.应用该试剂盒对狐肉与42种市售食用肉制品混合样品进行检验.结果 狐肉DNA检测试剂盒反复冻融处理5、10和20次后依然有效,可于-20℃保存1年.狐肉与42种常见食用肉类混合样品均可检出狐源性成分,试剂盒特异性为100％;样品DNA低检测限为0.1 ng/.μL.结论 狐源性成分DNA检测试剂盒适用于常见食用肉中狐源性成分快速检测,且特异性好、灵敏度高、稳定性强.
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Mycycler PCR电源板原理及故障维修
BIO-MED公司Mycycler PCR是一种用于DNA聚合酶链式反应的仪器,它能以一定的程序精确地对DNA样本升温降温促使DNA不断地复制和扩展.其内部包含了四块功能电路板,分别为两块电源板,一块半导体温度控制板和一块微电脑控制板.两块电源板的结构大致相同,其原理框图如图1所示.220V交流电源通过双向可控硅调整,到样本皿上的盖板加热器对盖板进行加热.主电源通过两个继电器,环形变压器降压,大功率整流桥整流后变成直流42V,再送到DC/DC变换电路进一步降压.DC/DC变换电路采用开关管、二极管和电感组成的非隔离电源变换电路,由PWM芯片UC3843驱动.后直流电源加到由四个开关管组成的桥式电路供半导体温控器工作.
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荧光定量PCR技术在骨关节结核石蜡包埋标本检测中的应用价值
目的 探讨荧光定量聚合酶链式反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)在骨关节结核石蜡包埋标本病理诊断及鉴别诊断中的应用价值.方法 搜集2014年10月至2015年4月首都医科大学附属北京胸科医院病理科诊断形态学符合结核的93例患者的石蜡包埋标本,12例骨肿瘤患者的石蜡包埋标本.所有标本以FQ-PCR技术检测结核分枝杆菌DNA,以抗酸染色法查找抗酸杆菌.以卡方检验分析实验数据,比较FQ-PCR技术与传统抗酸染色法在骨关节结核诊断中的敏感度和特异度;观察不同发病部位与两种技术检测阳性率之间的相关性;以PCR-反向点杂交法对7例结核分枝杆菌DNA阴性而抗酸染色阳性患者进行非结核分枝杆菌检测.结果 所有93例骨关节结核标本中FQ-PCR技术检测阳性77例,敏感度82.8％;抗酸染色查到抗酸杆菌64例,敏感度68.8％.FQ-PCR技术检测敏感度明显高于抗酸染色法(x2=5.659,P=0.021).在不同发病部位FQ-PCR技术敏感度均高于抗酸染色法:在脊柱病变FQ-PCR技术和抗酸染色法阳性率分别为84.0％(42/50)和64.0％(32/50)(x2=0.009,P=0.609);在外周骨关节病变FQ-PCR技术和抗酸染色法阳性率分别为81.4％(35/43)和74.4％(32/43)(x2=12.609,P=0.002).PCR-反向点杂交法检测确定戈登分枝杆菌1例.结论 FQ PCR技术较抗酸染色法显著提高了结核分枝杆菌阳性检出率,并为进一步检测非结核分枝杆菌做出重要提示,FQ-PCR技术在骨关节结核石蜡包埋标本检测中具有良好的应用价值.
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国境口岸常见11种蚊虫DNA条形码分子鉴定研究
目的 通过研究国境口岸常见11种蚊虫的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CO Ⅰ)基因序列差异性,并分析其系统进化关系,建立口岸常见蚊种的分子鉴定方法.方法 设计l对扩增CO Ⅰ部分编码区的PCR引物,对广东、海南和云南等国境口岸采集的致倦库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊等常见11种成蚊进行PCR扩增和序列测定,依据CO Ⅰ核苷酸序列进行系统进化分析.结果 11种蚊虫的CO Ⅰ基因扩增片断长度均为650 bp左右,A+T含量为66.51％～69.97％.同源性比较表明,同一蚊种间核苷酸序列同源性为94.8％～100.0％;不同蚊种间核苷酸序列同源性为77.7％～91.8％.系统进化关系显示,从种的水平上看,白纹伊蚊、致倦库蚊、中华按蚊等上述所有蚊种均聚集成簇,即同种之间呈明显的聚集,与形态学鉴定结果相一致.在属的水平上,库蚊属、阿蚊属、伊蚊属等均聚集成簇,形成各自的单独一支;各属间,阿蚊属与伊蚊属先聚类,再分别与库蚊属、曼蚊属聚类为库蚊亚科,按蚊属与上述蚊种亲缘关系较远.结论 本次研究中的COⅠ基因差异可作为国境口岸常见11种蚊虫分类鉴定的分子标记,为口岸常见蚊种的分子鉴定提供帮助,也可为口岸外来的或新发现的蚊种的鉴别提供分子水平的技术依据.
关键词： 蚊虫 细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ 聚合酶链式反应 序列分析 -
3种不同方法对入境旧书中携带蜡样芽孢杆菌的检测分析
目的 对一株从美国入境旧书中分离的菌株进行鉴定.方法 从旧书表面采集样本分离获得一株菌株,分别采用VITEK生化鉴定、16s rDNA序列分析法及特异性引物PCR3种方法进行鉴定.结果 VITEK生化鉴定判定可能属于蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的一种.16s rDNA通用引物PCR检测结果显示该菌株与芽孢杆属同源性高达99％.特异性引物PCR检测结果判定为蜡样芽孢杆菌.结论 初筛和特异性检测方法相结合,可以有效的对入境货物携带的致病微生物进行鉴定.
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广东国境口岸不同蚊种COI序列分析和分子鉴定方法
[目的] 建立国境口岸不同蚊种的细胞色素C氧化酶亚基I(COI)分子和氨基酸鉴定方法并分析其系统进化关系.[方法] 设计1对扩增COI部分编码区的PCR引物,对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定,分析COI核苷酸和氨基酸的系统进化关系.[结果] 5种蚊种的COI基因扩增片断长度均为415bp,A+T含量为68.77%～70.6%.同源性比较表明,不同蚊种间COI片断碱基变异颠换数都明显高于转化数,核苷酸序列及其编码的氨基酸序列同源性分别为85.1%～93.7%和92.0%～99.3%.COI核苷酸系统进化关系显示,所有蚊虫的COI分子鉴定与其形态学结果吻合,但骚扰阿蚊位于一单独的分支上,其亲缘关系与其它蚊种远.Col基因编码的氨基酸系统进化与蚊虫形态学亲缘关系一致,库蚊属、伊蚊属、阿蚊属聚类为库蚊亚科,中华按蚊与其它蚊种的亲缘关系远.[结论] 建立的COI核苷酸和氨基酸鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的属和种的区分,后者更能区分高级分类阶元亚科和正确反映蚊虫的系统发育关系.这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点,为广东口岸和其它国境口岸范围内外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据.
关键词： 蚊虫 细胞色素C氧化酶亚基I 聚合酶链式反应 序列分析 -
水产品中致病性弧菌PCR快速检测研究
[目的]建立一种快速、准确、特异的方法,快速检测和鉴定出食品中的非致病性和致病性霍乱弧菌与副溶血性弧菌.[方法]针对霍乱弧菌的种特异性基因ompW、毒力基因tcpA、ctxA和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh设计引物,建立PCR检测体系.[结果]检测结果显示,该方法能够特异性检出副溶血性弧菌或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdh、tcpA或ctxA毒力基因,检测的灵敏度可达到5×10(1)cfu/ml菌浓度.[结论]与传统方法比较,该方法快速、特异、灵敏,能在较短时间内对大量水产品样品进行检测.
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新疆地区巨细胞病毒孕期感染的检测分析
近年来病毒感染引起早孕流产、早产、死胎、发育迟缓等已被重视,并认为人巨细胞病毒(HCMV)是常见的病原体[1].该病毒对胎儿的危害,越来越受到人们的关注.本文应用聚合酶链式反应(PCR)方法对新疆地区206例孕妇进行HCMV的检测分析,现报告如下.
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6例性发育异常病残儿的SRY基因分析
目的:对6例性发育异常患儿进行SRY基因检测,为临床诊断提供参考,并对性发育异常机理进行初步探讨.方法:应用PCR扩增及PCR产物直接测序进行SRY基因分析.结果:1例45,XO男性患儿,SRY基因阳性;1例46,XX男性,SRY阴性;1例46,XY女性,SRY基因阳性,对其SRY基因保守区测序结果表明,该区无突变;3例46,XY男性性异常患儿,SRY基因均为阳性.结论:45,XO男性患儿是由于SRY基因易位所至.女性性反转非SRY基因保守区突变所至.男性性反转可能由于常染色体上与性别决定有关的基因突变所至.
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聚合酶链式反应-变性高效液相色谱法检测5种食源性致病菌
目的 建立聚合酶链式反应与变性高效液相色谱(polymerase chain reaction-denaturing high-performance liquid chromatography,PCR-DHPLC)相结合的方法,快速检测5种食源性致病菌(沙门菌、副溶血性弧菌、福氏志贺菌、大肠埃希菌O157:H7和单核细胞增生李斯特菌).方法 针对16S rRNA基因保守区设计引物,PCR 扩增产物用变性高效液相色谱仪检测,并进行敏感性、特异性、检出率等指标测定.结果 柱温61.4℃时,5种致病菌PCR产物分别呈现特异DHPLC色谱图,保留时间均为7 min左右.对沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌检出限均为5～10 CFU/ml,福氏志贺菌和大肠埃希菌O157:H7均为1～5 CFU/ml.对83株目的分离株的检出符合率为100%,38株非目的分离株检测均为阴性;对人工污染食品中的5种致病菌均可正确检出.结论 该PCRDHPLC方法具有较高的敏感性和特异性,可用于食品中5种食源性致病菌的高通量快速检测.
关键词： 变性高效液相色谱 聚合酶链式反应 食源性致病菌 16S rRNA基因 -
潲水油聚合酶链式反应鉴定技术研究
目的 建立特异的潲水油聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法.方法 以猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、哺乳动物等动物源性基因及大米物种特异性基因作为靶基因,采用PCR及荧光PCR方法鉴定潲水油.结果 6个自制的粗制潲水油样品全部被鉴定为潲水油,7个疑似潲水油样品中的5个被鉴定为潲水油,而4个正常食用植物油全部被鉴定为非潲水油.结论 以潲水油中可能混杂的动物源性基因和大米基因作为靶标,采用普通PCR或荧光PCR方法可有效鉴定潲水油.
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CK20 mRNA在胃癌病人外周血中的表达及意义
目的探讨胃癌病人外周血中CK20 mRNA的表达及临床意义.方法采用巢式RT-PCR技术检测70例胃癌病人手术前、后外周血CK20 mRNA的表达情况,并以20例健康志愿者为阴性对照,以胃腺癌细胞株BGC-823作阳性对照.结果 CK20 mRNA术前阳性表达率为32.9%,阳性表达率与组织学类型具有相关性(P＜0.01),而与TNM分期、肿瘤的部位、病人性别无明显相关性(P＞0.05).术后CK20 mRNA阳性表达率明显高于术前(P＜0.05);20例健康志愿者无一例阳性表达,胃腺癌细胞株BGC-823均为阳性表达.结论 CK20 mRNA作为标志物用于检测胃癌的血循环微转移是可靠的;手术操作可促使肿瘤细胞释放入血.
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HPV16阳性宫颈组织标本L1蛋白表达的初步检测
目的:分析HPV16阳性宫颈标本衣壳蛋白L1的表达,找出L1蛋白表达的规律,为宫颈癌的早期预防和治疗提供理论指导.方法:PCR法筛选出宫颈炎、CIN Ⅰ～Ⅱ、原位癌、早期浸润癌及中晚期癌中HPV16阳性标本,采用Western Blot及免疫组化两种方法定性、定位检测检测HPV16 L1蛋白的表达.结果:Western Blot实验中,宫颈炎组在56KD处出现明显的显色条带,随着损伤程度加重,条带逐渐变淡.中晚期癌标本除1例在56KD处呈现浅色条带外,其余无目的条带出现.免疫组化结果:阳性反应限定在上皮层之内,随损伤程度的加重,阳性反应强度减弱.至晚期宫颈癌,除1例呈淡染外,余均无阳性反应.反应强弱受分化状态影响.结论:HPV16阳性标本中,L1的表达随宫颈组织病变程度的加重而逐渐降低,但L1蛋白的表达水平亦受癌变组织分化状态的影响.早期检测HPV L1蛋白,将有助于早期预知宫颈病变程度及其恶性进展趋势,也为今后研制靶向于L1的检测试剂盒、指导HPV L1疫苗的使用提供重要理论依据.
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中国人3种常见缺失型α-地中海贫血快速检测及产前诊断
目的建立一种准确快速并能同时检测中国人3种常见缺失型α-地中海贫血(简称α-地贫)的聚合酶链式反应(PCR)技术并应用于产前α-地贫的人群筛查和高危胎儿的产前诊断中. 方法采用跨越断裂点PCR(gap-PCR)方案设计3组PCR引物,并对PCR反应条件进行优化以扩增代表这3种α-地贫存在的特异性DNA片段.应用血液学分析法对孕妇及其配偶各6 135例进行α-地贫表型的初筛,gap-PCR法用于α-地贫表型阳性病例的确诊和32例α-地贫高风险胎儿的产前诊断. 结果一次PCR同时成功地检出3种α-地贫的纯合子、杂合子或双重杂合子;孕妇及其配偶中共筛出541例携有--SEA突变基因,及其HbBart's和HbH病的高风险胎儿17例和15例,并对其中的31例进行了产前诊断,5例HbBart's水肿胎儿和4例HbH病胎儿被终止妊娠. 结论该法简便快速、准确可靠、重复性好,适合于人群筛查时检出α-地贫携带者和高风险重症α-地贫胎儿的产前诊断.
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荧光定量聚合酶链式反应种植前胚胎β-地中海贫血基因诊断
目的用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法进行种植前β-地中海贫血一种中国人常见突变类型CD41/42(-TCTT)的基因诊断. 方法来源于β-地中海贫血病人或携带者的289个淋巴细胞和人体外受精-胚胎移植志愿者剩余的胚胎分离137个单细胞用荧光定量PCR方法进行分析. 结果用单个淋巴细胞诊断β-地中海贫血扩增效率达96 %,准确率达99 %～100 %,等位基因丢失(ADO)率仅0～5 %.单个胚胎细胞扩增效率86 %. 结论荧光定量PCR技术是一种敏感、快速、可靠和准确的技术,适合包括β-地中海贫血在内的单基因疾病的种植前诊断.
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福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法的建立及应用
目的 建立基于O抗修饰基因的福氏志贺菌血清型PCR鉴定方法.方法 根据福氏志贺菌O抗原合成及修饰特异基因设计引物,以常见的14种福氏志贺菌血清型(包括1a、1b、1c、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、Y、X、Xv和F6)为标准菌株,建立福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法；并以痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍氏志贺菌和腹泻相关的其他菌属菌株验证特异性；应用该方法对106株福氏志贺菌临床分离株进行PCR血清分型.结果 建立一种福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法,通过8个PCR反应,能够鉴定目前已知的15种血清型中的14种(Xv除外).检测灵敏度在10 pg至1 ng DNA(20μl反应体系).对106株福氏志贺菌临床分离株的检测结果提示,PCR分型方法与玻片凝集法具有很高的一致性.结论 本研究建立的福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法具有特异性、灵敏性,可用于临床检测.
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应用改进的聚合酶链反应快速检测水中的肠道病毒
近年来，聚合酶链式反应(PCR)技术由于特异性强、操作简便已广泛用于环境中肠道病毒的检测。常规PCR 1次只能检测1种病毒，而水中病毒有多种，因而不能满足实际应用的需要。Tsai等［1］用多重PCR1次检测脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒和轮状病毒3种病毒，这种方法需要引物较多，引物之间易相互干扰，检测3种以上病毒就比较困难。Zoll等［2］采用通用引物PCR技术检测肠道病毒，但是这种方法只能证明有无肠道病毒的存在，不能鉴别病毒种类。我们首次将通用引物PCR和多重PCR相结合用于肠道病毒检测，兼顾了两者的优点，克服了各自的不足。
