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骨形态发生蛋白2在人骨不连组织中的表达及其临床意义
目的:探讨肥大性骨不连组织与萎缩性骨不连组织在成骨潜能上的差异,进一步指导骨不连的治疗.方法:收集2010年10月至2014年3月入住中南大学湘雅二医院骨科的骨不连患者骨不连处组织40例,按照骨不连性质分为肥大性骨不连组(n=20)、萎缩性骨不连组(n=20);按照不同年龄段分为20～35岁年龄组(n＝18)、36～50岁年龄组(n=18)、＞50岁年龄组(n=4);按照骨不连时间分为9～12个月组(n=21)、13～24个月组(n=14)和＞24个月组(n＝5).利用免疫组织化学SP二步法及IPP6.0病理图像分析软件对骨不连组织中骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表达进行半定量分析,测定其平均吸光度值.结果:肥大性骨不连组BMP-2平均吸光度值为0.1540±0.0408,萎缩性骨不连组BMP-2平均吸光度值为0.1372±0.0372,两组标本BMP-2平均吸光度值差异无明显统计学意义(P＞0.05).20～35岁年龄组BMP-2平均吸光度值为0.1477±0.0379,36～50岁年龄组BMP-2平均吸光度值为0.1419±0.0399,＞50岁年龄组BMP-2平均吸光度值为0.1456±0.0595,三组年龄段标本间BMP-2平均吸光度值差异无明显统计学意义(P＞0.05).在三组不同骨不连时间中,9～12个月组BMP-2的平均吸光度值为0.1449±0.0366,13～24个月组BMP-2的平均吸光度值为0.1472±0.0400,＞24个月组BMP-2的平均吸光度值为0.1445±0.0541,三组不同骨不连时间标本之间BMP-2平均吸光度值差异亦无明显统计学意义(P＞0.05).结论:肥大性骨不连组织和萎缩性骨不连组织在成骨潜能上无显著性差异.
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骨形态发生蛋白-2和神经生长因子治疗骨折的临床研究
目的 探讨骨形态发生蛋白-2和神经生长因子促进骨折愈合的临床作用.方法 分别对47例四肢骨折患者行局部注射骨形态发生蛋白-2,对49例四肢骨折患者行局部经皮注射神经生长因子,与52例四肢骨折患者对照,进行促进骨折愈合的临床治疗观察.结果 治疗组骨折临床愈合时间均较对照组有不同程度的缩短,疗效优于对照组,且骨形态发生蛋白-2组优于神经生长因子组,组间对比有统计学差异(P＜0.01).结论 临床应用骨形态发生蛋白-2和神经生长因子治疗骨折均有促进骨折愈合修复的作用,前者效果优于后者.
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骨形态发生蛋白－2在卵巢癌患者血清中的表达及意义
目的：探讨骨形态发生蛋白－2（BMP-2）在卵巢癌患者血清中的表达及意义。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测51例恶性卵巢肿瘤患者血清中BMP-2和癌抗原125（CA125）的表达，另选取49名健康女性作为对照。结果卵巢上皮癌血清中BMP-2的表达水平明显低于对照组[（26．66±8．68）pg／ml vs （39．34±7．62）pg／ml]，差异有统计学意义（P<0．05）。 ROC曲线分析显示血清BMP-2的检测具有较好的敏感度和特异度。相关性分析显示血清中BMP-2的表达与CA125呈负相关（r＝－0．76，P<0．05）。结论卵巢癌患者血清中BMP-2表达下调，对临床诊断有重要的参考价值。
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人骨形态发生蛋白-2完整成熟肽基因的克隆
目的:克隆人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)完整成熟肽基因.方法:依据Genbank中hBMP-2的序列化学合成两条引物,从人胎儿骨组织中提取得到的总RNA中,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到hBMP-2完整成熟肽基因.将所得的基因片段插入克隆载体pUC-19并转化大肠杆菌JM109,提取重组质粒,酶切鉴定并测序.结果:DNA琼脂糖凝胶电泳显示:PCR产物为一长约400 bp的带,阳性克隆质粒经双酶切可切出约400bp的片段.全自动DNA测序表明与Genbank中的序列完全相符.结论:通过反转录聚合酶链式反应从人胎儿骨组织中成功地克隆了人BMP-2完整成熟肽基因,基因序列完全正确.
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rhBMP-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响
目的探讨人重组骨形态发生蛋白(rhBMP)-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响.方法体外分离与培养骨骼肌卫星细胞,分别用0、50、100、500、1000 ng/ml的rhBMP-2诱导培养基培养48h.利用MTT法测定细胞增殖能力的变化,通过荧光法测定接种后1h的粘附细胞率.结果rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,这种作用从BMP浓度为500ng/ml即可表现出来,并随着浓度的增加而越发明显.在rhBMP-2作用下骨骼肌卫星细胞的粘附率增高,在500ng/ml的浓度时达高,但当BMP浓度进一步增大时,细胞粘附率却不再增加.结论rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,增强其粘附特性.
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腺病毒介导入BMP-2对骨髓间质干细胞成骨能力的影响
目的探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白(BMP-2)转染对体外培养骨髓间质干细胞(MSCs)成骨能力的影响.方法取日本大耳白兔20只自双侧股骨大转子取材培养MSCs,左侧来源细胞为实验组,右侧为对照组.以复制缺陷重组腺病毒介导人BMP-2基因转染MSCs后,用ALP检测两组细胞的ALP活性;骨钙素RT-PCR检测两组细胞Ⅰ型胶原的表达;BGP放免分析检测两组细胞的骨钙素含量.结果转基因组和对照组ALP分泌量(U/L)分别为7.01±0.59、5.23±0.55;RT-PCRⅠ型胶原的表达为1.35±0.12、3.65±0.37;骨钙素(ng/ml)为24.50±0.93和15.45±1.81.两组间差异均有显著性(P＜0.05).结论用腺病毒介导人BMP-2蛋白作用后的MSCs具有成骨细胞的生物学特性.腺病毒介导入BMP-2转基因可以提高MSCs的体外成骨能力.
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成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建
目的 探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因构建含目的 基因的腺病毒载体的可行性.方法 先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的两端.通过T2A Peptide的互补.延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全长PCR产物,利用上游引物的Bgl Ⅱ酶切位点和下游引物的EeoRV酶切位点将其插入到pShuttle-IRES载体中,酶切、测序鉴定;利用同源重组技术将目的 基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体,鉴定阳性克隆;将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞,观察GFP表达,PCR鉴定后进行大量扩增,并用CsCl梯度离心法进行纯化;测量A260,计算病毒感染滴度.结果 克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确.经BglⅡ和EeoR Ⅴ双酶切得到的BMP2-bFGF 2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中;转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达,即病毒包装成功,扩增纯化后滴度为3.6×1011 VP/ml.结论 经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功.
关键词： 骨形态发生蛋白-2 碱性成纤维细胞生长因子 双基因共表达 T2A序列 腺病毒 -
转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究
目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.
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rhBMP-2联合Bio-oss骨粉在前牙美学区种植中的成骨效果
目的 研究重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)联合Bio-oss骨粉在前牙美学区种植位点骨缺损的成骨效果.方法 应用rhBMP-2联合Bio-oss骨粉修复骨缺损同期种植的患者12例共20颗种植体,统计术后6个月唇侧骨高度及骨板厚度的变化,戴牙后运用粉红色美学评分(pink esthetic score,PES)对软组织进行评价.结果 20颗种植体均种植成功,牙槽骨高度平均增长1.9 mm,其中17个种植位点(85％)均有不同程度的骨高度增长,1个种植位点在术前唇侧严重骨开裂的情况下,发生骨板的吸收,牙槽骨高度有所降低;2个种植位点的骨高度未发生明显改变;20个种植位点唇侧骨板厚度均大于1 mm,平均厚度为1.9 mm;PES平均分为9.8分.结论 rhBMP-2联合Bio-oss骨粉能较好地修复前牙美学区的骨缺损,取得良好的美学效果.
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FGF-2/PELA/BMP-2微囊支架促进大鼠骨膜来源干细胞的成骨分化
目的：观察成纤维细胞生长因子-2/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸/骨形态发生蛋白-2（FGF-2/PELA/BMP-2）微囊支架对SD大鼠骨膜来源干细胞成骨分化作用。方法提取SD大鼠骨膜来源干细胞（PDSC），进行流式细胞学表面标记物鉴定及成骨、成软骨、成脂三系诱导并进行茜素红、甲苯胺蓝、阿利新蓝、油红O染色及免疫荧光实验。制备FGF-2/PELA/BMP-2、FGF-2/PELA、PELA/BMP-2、PELA四组材料，进行扫描电镜（SEM）观察微囊表面，通过ELISA实验制作两因子的控释曲线。将4组材料浸提液与第3代骨膜来源干细胞进行共培养，分别在7、14 d进行碱性磷酸酶（AKP）活性检测，分别在7、14、21 d进行qRT-PCR成骨基因表达检测，观察比较各组PDSC成骨分化能力，数据汇总后进行统计学分析。结果流式细胞学表面标记物鉴定显示PDSC表达间充质干细胞表面标记物，三系诱导分化染色结果表面PDSC具有成骨、成软骨、成脂等多向分化能力。AKP活性结果显示，FGF-2/PELA/BMP-2组在PDSC培养的7 d及14 d，AKP活性高，差异显著。FGF-2/PELA/BMP-2组的qRT-PCR结果提示RunX-2、OCN表达量均高于其他组，且在第14天RunX-2表达量达到顶峰，OCN呈持续增长趋势。结论 FGF-2/PELA/BMP-2仿生控释微囊支架中的细胞因子活性得以保留，并相对其他实验组具有更高的促进PDSC成骨分化的能力。
关键词： 骨膜来源干细胞 成纤维细胞生长因子-2 骨形态发生蛋白-2 -
磷酸三钙复合骨形态发生蛋白-2/血小板衍生生长因子-BB修复SD大鼠颅骨标准骨缺损
目的：观察新型生物功能化复合材料在SD大鼠颅骨标准骨缺损中再生修复作用，为骨生物材料的基础研究、成骨及成血管提供实验资料。方法3月龄雄性SD大鼠颅骨标准缺损模型随机分入不同实验组，观察时间6周。实验分为CaPfromGEM21、CaPfromGEM21+10 ng 复合了骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、CaPfromGEM21+100 ng BMP-2、CaPfromGEM21+0.3μg血小板衍生生长因子（PDGF）-BB、CaPfromGEM21+3μg PDGF-BB和空白组。对标本行X线、Micro CT，苏木素-伊红染色（HE染色）及相关的定量分析。结果 X线影像提示各组骨缺损均有不同程度的修复，骨折线逐渐模糊，PDGF-BB组的骨缺损基本修复。Micro CT可见各组骨缺损均有不同程度新生骨长入。新生骨体积定量结果提示添加PDGF-BB组新生骨明显多于BMP-2实验组（P<0.05），具有统计学意义。HE染色切片各组均未见急慢性炎症细胞浸润，缺损中可见染色均一的新生骨组织，新生骨内及周围可见散在的新生血管，新生骨面积百分数提示10 ng BMP-2组新生骨面积百分数及0.3μg PDGF-BB组新生骨量百分数均明显大于单纯材料组（P<0.05），新生血管密度定量提示4个添加因子的实验组的新生血管密度均明显大于空白组及单纯材料组（P<0.05），4个添加因子的实验组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 CaPfromGEM21复合BMP-2/PDGF-BB具有良好的生物相容性，骨缺损修复效果优于单纯材料植入，有望成为理想的新型骨再生修复替代材料之一。
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雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化
目的 探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)/Smad通路在雷奈酸锶(Sr)促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为成骨细胞过程中的作用.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2的拮抗剂noggin及Smad1小干扰RNA(SiRNA).酶标法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smadl/5/8及Runt 相关转录因子-2(Runx2)蛋白的表达.结果 应用0.1～10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggm预处理细胞2h能抑制Sr对磷酸化Smadl/5/8表达的上调作用;应用0.1～5 mmol/L Sr处理细胞6h后,细胞内Rtmx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smadl SiRNA转染细胞后能下调Smadl/5/8、磷酸化Smadl/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用.结论 BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化.
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重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达及纯化
目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2).方法 hBMP-2原核表达载体pYR(pBV220-hBMP-2)转化Ecoli BL21,SDS-PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系.离子交换层析DEAE和分子筛S-300纯化重组蛋白,自然缓降复性法对其复性.结果 SDS-PAGE显示在相对分子质量约为13 000时出现明显外源蛋白表达带,而且当工程菌30℃活化至D600约为0.45时,其表达效率较高;在此状态下,温度诱导表达4 h,目的蛋白表达量高,以后随着时间的延长,表达量稍下降.重组蛋白经纯化后植入小鼠肌肉,组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生以及软骨与骨形成.结论重组hBMP-2具有良好异位成骨活性.
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转染骨形态发生蛋白-2基因的血管内皮祖细胞的构建
目的 通过克隆、构建pEGFP-BMP-2表达质粒载体,观察骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)基因在血管内皮祖细胞(EPCs)中的表达与分布.方法 采用密度梯度法分离兔骨髓的单个核细胞,应用细胞荧光化学法及DAPI染细胞核法鉴定培养的细胞;BMP-2重组于pEGFP-C3中,经酶切、测序分析鉴定后,将其转染入EPCs内并筛选稳定转染细胞.结果 鉴定培养的细胞为EPCs;pEGFP-C3-BMP-2表达质粒载体经双酶切鉴定、测序分析证实其构建成功;成功转染的EPCs中绿色荧光弥散分布于细胞胞质内,表明pEGFP-C3-BMP-2蛋白高表达,表达率为46%.结论 分离与培养出EPCs;构建的pEGFP-C3-BMP-2表达质粒载体转染后,BMP-2蛋白高效表达于EPCs胞质中.
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脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究
目的 观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后mRNA及其蛋白的表达.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染技术,将含hBMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化及免疫印迹法(Western blot)等手段检测转染后hBMP-2 mRNA及其蛋白的表达.结果 通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔BMSCs,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2 后的兔BMSCs内有大量hBMP-2 mRNA 的转录和蛋白的表达.结论 通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转染BMSCs,并使其获得较为稳定的表达.
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BMP-2对人肝癌SMMC7721细胞MMP-2、MMP-9表达的影响
目的:探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对肝癌SMMC7721细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达及分泌的影响.方法:分别采用半定量逆转录聚合酶链反应、Western blot及ELISA法检测BMP-2干预SMMC7721细胞后MMP-2、9 mRNA、蛋白表达和浓度水平的变化.结果:BMP-2呈剂量和时间依赖性促进人肝癌SMMC7721细胞MMP-2、9 mRNA、蛋白表达和分泌.结论:BMP-2可以上调MMP-2、9在肝癌SMMC7721细胞的表达水平,从而促进肝癌细胞的生长和侵袭能力.
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艾瑞昔布不同用药持续时间对大鼠骨折愈合的影响
目的 研究探讨艾瑞昔布不同用药持续时间对大鼠股骨骨折愈合的影响及与BMP-2、VEGF表达的关系.方法 75只SD大鼠构建闭合性股骨骨折,实验随机分为正常组(生理盐水灌胃4周);短期用药组(艾瑞昔布混悬液2 mg/(kg·d),灌胃2周后改用生理盐水灌胃2周);长期用药组(艾瑞昔布混悬液2 mg/(kg·d),灌胃4周),放射性(X线)评估、骨痂骨密度(BMD)测量、血清BMP-2、VEGF浓度测定、HE染色和免疫组化染色评估.结果 短期用药组和长期用药组骨折愈合评分、骨痂BMD、血清BMP-2和VEGF浓度、BMP-2和VEGF阳性表达均降低,其中尤以长期用药组降低显著(P<0.05).短期用药组骨小梁生长稍稀疏,可见软骨细胞,成骨细胞相对较少,骨痂见大量软骨组织;长期用药组骨小梁生长稀疏,可见大量软骨细胞,成骨细胞生长少见,骨痂见大量纤维组织.结论 艾瑞昔布对大鼠骨折愈合有抑制作用,其中以长期用药抑制作用明显,其可能与降低BMP-2、VEGF表达有关.
关键词： 艾瑞昔布 环氧合酶-2 骨形态发生蛋白-2 血管内皮细胞生长因子 骨折愈合 -
BMP-2基因修饰自体BMSCs移植促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究
目的:检测骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因mRNA及其蛋白的表达,探讨BMP-2基因修饰自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对兔下颌骨牵张成骨新骨形成的促进作用.方法:取新西兰白兔36只随机分为3组,每组12只.建立牵张成骨动物模型,在固定期第2天,实验组于牵张间隙注射200 μL的BMP-2基因修饰的自体BMSCs液;对照组注射等量自体BMSCs液;空白组注射等量生理盐水.分别于固定2,6周通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、免疫组化等手段检测BMP-2基因mRNA及其蛋白的表达情况.结果:实验组牵张间隙新生骨组织均可见BMP-2基因mRNA和其蛋白强阳性表达.结论:BMP-2基因修饰的自体BMSCs移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成.
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创伤性胫腓骨骨折患者术后加用益气生血汤临床观察
目的 观察益气生血汤对创伤性胫腓骨骨折患者术后康复的影响.方法 将创伤性胫腓骨骨折患者共68例按随机数字表法分为对照组和观察组,各34例,分别给予西药单用和在此基础上加用益气生血汤辅助治疗,比较两组症状改善时间、骨折愈合时间、治疗前后中医证候积分、视觉模拟量表(VAS)评分、骨痂影像学评分、骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子水平.结果 观察组近期总有效率为94.12%,显著高于对照组的64.71%(P<0.05);观察组症状改善时间和骨折愈合时间均显著短于对照组(P<0.05);观察组治疗后中医证候积分显著低于对照组、治疗前(P<0.05);观察组治疗后VAS评分显著低于对照组、治疗前(P<0.05);观察组治疗后骨痂影像学评分均显著高于对照组、治疗前(P<0.05);同时观察组治疗后骨形态发生蛋白-2和血管内皮生长因子水平均显著高于对照组、治疗前(P<0.05).结论 创伤性胫腓骨骨折患者术后加用益气生血汤可快速有效缓解相关症状体征,加快骨折愈合进程,并有助于提高骨形态发生蛋白-2和血管内皮生长因子水平.
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通淋汤对尿毒症患者骨形态发生蛋白-2表达的影响研究
目的：探讨通淋汤对尿毒症患者骨形态发生蛋白‐2（BMP‐2）的影响。方法选取2010年3月至2013年11月该院就诊的尿毒症患者共115例，根据临床上的不同治疗方法将患者分为治疗组（57例）和对照组（58例）。其中治疗组接受通淋汤联合血液透析来治疗，对照组仅接受血液透析治疗。比较两组患者的BMP‐2、甲状旁腺激素（iPTH ）、钙磷乘积及临床疗效的改善程度。结果治疗组显效率为50．9％（29／57），高于对照组的34．5％（20／58），差异有统计学意义（P＜0．05）；两组患者治疗后BMP‐2、iPTH和钙磷乘积均较治疗前降低，其中治疗组低于对照组（P＜0．05）。结论中药复方通淋汤能够降低尿毒症患者体内BMP‐2和iPTH水平，提高患者临床显效率，值得临床广泛推广。
