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MAPK信号传导通路在髓核细胞研究进展
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是将细胞外刺激信号转换成广泛的细胞内反应的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在许多生理过程中发挥着重要的细胞信号传导的作用[1].在真核细胞生物中,MAPK信号通路在基因表达、细胞增殖、分化、凋亡、新陈代谢等生理病理过程中发挥着重要的作用.在哺乳类动物中,MAPK家族基因有10来个,目前研究发现常见的MAPK信号通路有:细胞外信号调节激酶(ERK1/2),c-Jun氨基末端激酶(JNK1/2/3),p38激酶(α,β,γ,δ)以及大丝裂原活化蛋白激酶(ERK5/BMK1) [2-4].每一个常见的信号通路都存在三级激酶级联,细胞受外部信号刺激后通过MAPKKK转化为细胞内的信号并进一步磷酸化激活MAPKK,后MAPKK通过双重磷酸化进一步激活MAPK,进而引起一系列细胞内信号的改变,在细胞增殖及功能上发挥着重要的作用.研究腰椎间盘退变过程中髓核细胞MAPK信号通路的信号变化将有助于人类对退行性腰椎间盘病进一步认识,并可能从中找到治疗退行性腰椎间盘病的方法.本文将综述MAPK常见信号通路在髓核细胞的研究进展.
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微重力环境下体外构建组织工程化椎间盘
[目的]利用微重力培养环境,构建高质量组织工程化椎间盘.[方法]选用成年新西兰大白兔椎间盘细胞作为种子细胞,复合聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架,分别在微重力培养环境和普通培养板环境下培养,利用倒置显微镜、MTT比色法、扫描电镜、组织学观察椎间盘细胞、支架和复合结构质量.[结果]体外单层培养的椎间盘细胞呈多角形符合传代要求,微重力环境比普通培养环境能更好地促进椎间盘细胞的增殖,同时椎间盘细胞在支架内分布更加均匀.[结论]微重力培养环境更适于椎间盘细胞在三维培养结构中均匀增殖,有利于构建高质量组织工程化椎间盘用于深入研究.
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丝素蛋白多孔支架与兔髓核细胞生物相容性研究
[目的]以丝素蛋白为原料制备三维多孔髓核支架,并探讨其与兔髓核细胞的生物相容性.[方法]以丝素蛋白为原料,采用蜡球致孔结合相分离技术制成三维多孔支架;从兔椎间盘中分离出髓核细胞,培养后获取P1代细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测支架浸提液毒性;将髓核细胞以1×107/ml密度接种在丝素支架上体外培养48 h,通过HE染色、死活细胞染色(LIVE/DEAD染色)、扫描电镜观察细胞在支架上的粘附及活性.[结果]丝素蛋白多孔支架在敷水状态下呈光滑乳白色,分离的髓核细胞呈典型的软骨细胞样形态;经MTT检测支架浸提液对髓核细胞增殖无影响;HE染色和扫描电镜可见髓核细胞呈球状或短梭形均匀地贴附在支架内部.LIVE/DEAD染色显示全部为绿色荧光(活细胞),未见红色荧光(死细胞).[结论]丝素蛋白多孔支架与兔髓核细胞具有良好的生物相容性,可以作为髓核组织工程的支架材料.
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人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养的形态学及活性观察
[目的]观察平面培养体系内人退变椎间盘髓核细胞的形态及活性变化.[方法]收集20例人退变椎间盘髓核,分离髓核细胞行平面培养,倒置相差显微镜和HE染色观察髓核细胞的生长过程与形态变化,流式细胞仪量化细胞周期分布和凋亡率,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色髓核细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,观察平面培养传代对髓核细胞活性和基质合成能力的影响.[结果]原代髓核细胞呈类圆形或多角形,平均7d贴壁,31 d融合至95％,P1代髓核细胞呈长梭形或多角形,平均12h贴壁,6.6d融合至95％,两代细胞增殖能力的差异有统计学意义(P＜0.01).原代与P1代髓核细胞的细胞浆阳性染色聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,生长融合至95％后约90％的细胞分布于G1期,约16％的细胞凋亡,两代细胞的细胞活性和基质合成能力无统计学差异(P＞0.05).[结论]人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养将经历显著的形态学变化.传一代后髓核细胞增殖能力提高,但能维持细胞活性以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成能力.
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高浓度抗生素溶液对椎间盘细胞影响的研究
[目的]检测高浓度的头孢唑林钠及克林霉素对兔腰椎间盘髓核细胞活力及增殖能力的影响.[方法]通过在体外分离、培养新西兰兔髓核细胞,体外扩增培养至第1代,采用CCK-8及RT-PCR等方法,检测4个浓度(0 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml)的头孢唑啉钠及克林霉素对于兔腰椎间盘髓核细胞活力及增殖能力的影响.[结果]当头孢唑啉钠浓度超过0.5mg/ml、克林霉素浓度超过0.25 mg/ml时,髓核细胞Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达下降,浓度在1.0 mg/ml时达到低.头孢唑啉钠浓度超过0.5 mg/ml、克林霉素浓度超过0.25 mg/ml时,明显影响细胞活力,小于以上浓度时细胞活性无明显影响.[结论]高浓度的头孢唑林钠及克林霉素抗生素对于体外培养的兔髓核细胞的活力、增殖能力具有抑制作用.
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BMP-2对人退变椎间盘髓核细胞影响的实验研究
[目的]探讨BMP -2对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响.[方法]分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变推间盘髓核细胞分为2组.A组:加入100 ng/ml BMP -2,B组:加入200 ng/mlBMP -2,C组:对照组,不加干扰因素.通过对试验组和对照组髓核细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达.ELISA检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原含量,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖含量.[结果]髓核细胞中Ⅱ型胶原、糖胺多糖表达水平实验组均高于对照组.[结论] BMP-2蛋白可促进退变腰椎间盘细胞分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原,增加细胞活性,恢复椎间盘的功能和活性,因此运用BMP-2椎间盘内注射有望成为椎间盘退变疾病生物治疗的方法之一.
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流体静态压力对体外培养人椎间盘髓核细胞生物学特性的影响
[目的] 探讨不同流体静态压力下,体外单层培养的人椎间盘髓核细胞生物学特性的改变.[方法] 腰椎外伤或脊柱侧弯手术中取椎间艋髓核细胞分离培养.对第2代单层培养细胞分别施加0.1 MPa(大气压)、0.5 MPa、1.0 MPa、1.5 MPa、2.5 MPa流体静态压力,每天加压2次,每次30 min,连续9 d加压.电镜和光镜观察细胞的形态学变化、细胞活性测定、细胞内超微结构变化.免疫组化染色Ⅱ型胶原.[结果]大气压、0.5 MPa、1.0 MPa压力下髓核细胞活性逐渐升高,而1.5 MPa压力下髓核细胞存活率降低,2.5 MPa压力下髓核细胞存活率降低明显.加压后髓核细胞体积缩小,由多角形、圆形以及不规则形变为长梭形.透射电镜观察加压后髓核细胞的超微结构显示,胞核扭曲变形,染色质凝集成块,粗面内质网扩张,有的细胞核固缩成团或碎裂,基质中可见一些粗颗粒状物,有空泡形成.大气压、0.5 MPa、1.0 MPa压力下髓核细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色强阳性(++++),1.5 MPa、2.5MPa压力下髓核细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色强阳性减弱(+~++).[结论]体外培养的髓核细胞在不同流体静态压力下,细胞形态、细胞内微结构发生变化,过低或过高的异常压力均会降低细胞活性,增加细胞凋亡率.
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羧甲基壳聚糖对体外培养髓核细胞增殖及硝普钠诱导凋亡的影响
[目的]研究不同浓度羧甲基壳聚糖对体外培养椎间盘髓核细胞增殖及硝普钠诱导细胞凋亡的保护作用.[方法]体外培养大鼠椎间盘髓核细胞,Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定;分别加入不同浓度羧甲基壳聚糖培养24h,通过CCK-8细胞计数法检测髓核细胞的增殖情况;采用不同浓度硝普钠诱导髓核细胞凋亡,通过流式细胞仪检测早期凋亡细胞比例,并通过Hoechst 33342荧光染色检测髓核细胞凋亡核的形态学变化.[结果]CCK-8检测结果表明10～500μg/ml羧甲基壳聚糖作用髓核细胞24 h对髓核细胞增殖无明显作用(P＞0.05);流式细胞检测结果表明1～3mmol/L的硝普钠可诱导髓核细胞发生早期凋亡,加入50～200μg/ml羧甲基壳聚糖后硝普钠诱导的髓核细胞凋亡有不同程度的降低(P＜0.05).Hoechst 33342染色结果表明羧甲基壳聚糖可降低硝普钠诱导髓核细胞凋亡.[结论]一定浓度的羧甲基壳聚糖对髓核细胞增殖无明显影响,羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导下髓核细胞凋亡有保护作用.
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成人退变髓核细胞体外培养和细胞周期测定
[目的] 建立成人退变髓核细胞的单层培养模型并观察其形态;测定其细胞周期,探讨传代后髓核细胞生长不佳的原因.[方法] 取24例椎间盘突出症患者手术切除的椎问盘组织,分离出髓核组织,胰酶和胶原酶消化,DMEM/12培养基培养.倒置相差显微镜观察其形态学特征,流式细胞分析仪检测原代和P2细胞周期.[结果] (1)原代髓核细胞生长良好,7 d后贴壁生长的细胞可达90%.(2)原代细胞凋亡率为(38.10±11.7)%,P2代凋亡率为(44.74±17.6)%,原代S期细胞(7.88±2.1)%,P2 S期细胞(2.76±0.7)%.[结论] 传代后的髓核细胞凋亡率增高,S期细胞减少明显.
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TGF-β1干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究
[目的]评价在TGF-β1干预下的兔间充质干细胞移植到兔退变椎间盘后是否可诱导向髓核细胞分化并增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量.[方法]采用体外细胞培养技术,将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和培养,成功传代、纯化后并在TGF-β1干预下植入兔退变椎间盘的模型中.分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化;免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化.所得数据经SPSS 11.5统计学软件进行统计学处理.[结果]原代培养及传代培养显示兔骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力,并且8周内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量的恢复实验组对比模型组增高明显,统计学显示差异有显著性意义.[结论]将TGF-β1干预下的兔间充质干细胞移植到退变椎间盘后可以在一定时间内增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量,从而延缓椎间盘退变.
关键词： 骨髓间充质干细胞 椎间盘 转化生长因子-β1(TGF-β1) 髓核细胞 -
兔髓核细胞体外佳培养条件的探索
[目的]探索髓核细胞培养的佳条件,为进一步作为椎间盘组织工程种子细胞提供可能.[方法]以DMEM/F12(1:1,添加FBS 10%,pH 7.2)作为基础培养液,通过依次改变培养液pH、胎牛血清浓度、抗坏血酸浓度、培养温度、CO2浓度以及培养板处理,计数1Od克隆形成数,检测细胞生长代谢,确定佳培养条件.[结果](1)髓核细胞不易贴壁生长,在未经处理的培养板中进行单层培养细胞增殖能力较弱,克隆形成少;而铺被多聚赖氨酸的培养板中培养可以较快贴壁并形成相对较多的克隆;(2)生长培养液在DMEM/F12(1:1),pH7.0、胎牛血清浓度15%、抗坏血酸30μg/ml、温度37℃以及CO2浓度为5%时,髓核细胞生长良好,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA表达增高.[结论]在佳培养条件下,髓核细胞生长状态良好,为椎间盘组织工程髓核细胞的培养奠定了基础.
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非接触共培养人髓核细胞诱导血管内皮细胞凋亡及抑制迁移的研究
[目的]利用人髓核细胞系(NPCs)与人微血管内皮细胞系(HMEC-1),通过非接触共培养探讨人髓核细胞对血管内皮细胞的凋亡诱导并抑制迁移的影响.[方法]利用过氧化氢诱导NPC衰老,进行细胞衰老β-半乳糖苷酶染色.将正常NPC、衰老NPC与HMEC等比例(1∶1)通过Transwell培养板进行非接触共培养作为实验组,单纯HMEC培养作为对照组,培养24h光镜下观察内皮细胞的生长情况,用流式细胞仪检测HMEC凋亡率,ELISA检测细胞培养液中TNF-α、VEGF的量.各组利用不同细胞条件诱导培养基和Transwell小室检测其纵向迁移能力.[结果]利用200 μmol/L与400 μmol/L过氧化氢处理NPC细胞衰老β-半乳糖苷酶染色阳性比例分别达25％和55％.共培养1d后正常NPC组HMEC凋亡率高于衰老NPC组(P＜0.05).对照组细胞凋亡率均低于5％,明显小于实验组(P＜0.01).ELISA检测培养液中TNF-α、VEGF,正常NPC组TNF-α高于衰老NPC组(P＜0.05).VEGF正常NPC组低于衰老NPC组(P＜0.05).趋化实验正常NPC条件培养基迁移膜下细胞数少于衰老NPC组(P＜0.05),且少于对照组(P＜0.01).[结论]在非接触共培养条件下人髓核细胞可以诱导血管内皮细胞凋亡,并且抑制内皮细胞迁移,髓核细胞衰老之后诱导凋亡能力下降,抑制迁移能力减弱,进而证明随年龄增长髓核细胞的衰老引起椎间盘微环境变化可能为椎间盘退变中血管长入的诱发因素之一.
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人退变髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究
[目的]探讨人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)向类髓核细胞(nucleus pulposus-like cells,NPCs)诱导分化的可能性,为椎间盘退变的防治研究提供种子细胞.[方法]收集腰椎间盘退变患者手术中切除的脂肪组织及髓核组织,采用胶原酶消化法提取原代ADSCs和NPCs,倒置显微镜下观察共培养后ADSCs形态学变化.MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,采用孔径为0.4 μm的Transwell小室建立细胞共培养体系,NpCs置于上层,ADSCs接种于下层,建立2个细胞培养组:ADSCs单独培养组和ADSCs/NPCs共培养组,甲苯胺蓝染色以检测蛋白聚糖表达情况,RT-PCR法检测细胞COL2A1、ACAN和SOX9基因表达水平.[结果]采用胶原酶消化法可较好的分离培养出人脂肪间充质干细胞和髓核细胞.与NPCs共培养后的ADSCs可被甲苯胺蓝染为天蓝色,且Ⅱ型胶原及SOX9基因表达水平上调(P＜0.05).[结论]采用胶原酶消化法分离培养的ADSCs活力较好、增殖旺盛,与退变NPCs共培养后,软骨特异性标记物的表达明显增加,细胞表现出向NPCs分化的趋势,可作为椎间盘组织工程研究的种子细胞.
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酸敏感离子通道1a偶联内质网应激在人髓核细胞退变中的作用机制初探
[目的]模拟人椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)酸性环境,探讨酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)的活化与内质网应激的关系.[方法]体外单层培养人正常髓核细胞(nuc1eus pulposus cells,NPCs)系,不同pH值培养不同时间,模拟椎间盘酸性微环境,建立酸诱导的退变髓核细胞模型.CCK-8检测细胞增殖能力.Western blot、qPCR检测内质网应激.Western blot检测ASIC1a的表达.Fura-2/AM荧光探针检测ASIC1a活化介导的Ca2+内流.流式细胞术检测ASIC1a活化后细胞凋亡率.PcTX1(ASIC1a特异性阻断剂)阻断ASIC1a后,观察细胞凋亡及内质网应激指标变化情况.[结果]酸诱导髓核细胞凋亡,酸激活ASIC1a及内质网应激,PcTX1能降低促凋亡的内质网应激通路和髓核细胞凋亡率(P＜0.05),而未折叠蛋白反应相关指标无明显变化(P＞0.05).[结论]ASIC1a能够调控内质网应激中的促凋亡通路,阻断ASIC1能够保护酸诱导的髓核细胞凋亡.
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人老化椎间盘髓核细胞体外老化模型的建立与细胞老化表型的初步研究
[目的]构建人椎间盘髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)老化模型,探讨老化NPCs中生长因子的表达差异及其与椎间盘退变(intervertebral disc degeneretion,IDD)的关系.[方法]体外单层培养人正常NPCs系(Scien Cell 4800),连续1∶2传代培养,诱导建立NPCs复制性老化(replication senescence cells,RS)模型;不同浓度双氧水作用于未老化细胞,模拟椎间盘氧化应激微环境,诱导建立应激诱导过早老化(stress induced premature senescence cells,SIPS)模型.细胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色检测NPCs阳性表达率.流式细胞仪检测G1期细胞比例及细胞凋亡率.CCK-8检测不同代次细胞增殖活性.应用Agilent表达谱芯片初步筛选出正常与老化NPCs中差异性表达的生长因子,实时荧光定量PCR进一步验证所筛选生长因子的表达差异.[结果] NPCs经连续传代、双氧水诱导可分别构建RS模型及SIPS模型.两种老化模型SA-β-Gal阳性表达的细胞比例均高于70％,G1期细胞比例均高于80％,凋亡率均低于10％.Agilent表达谱芯片筛选出的碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)与血管内皮生长因子a(vascular endothelial growth factor a,VEGF-a)在不同老化模型中,表达差异有统计学意义(P＜0.05),特别是bFGF在SIPS模型中的表达显著高于RS模型(P＜0.05).两种老化模型中的bFGF表达量显著高于正常组(P＜0.05).[结论]双氧水诱导所引起的氧化应激可促进细胞过早老化.老化NPCs上调bFGF,且SIPS模型中的上调幅度显著高于RS,SIPS可能比RS更加上调bFGF.不同老化诱导条件下,生长因子的表达可能存在差异,bFGF可能参与椎间盘再血管化及自我修复.
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低氧环境下共培养的骨膜细胞和髓核细胞骨向分化能力的研究
[目的]探讨低氧环境对体外共培养的骨膜细胞、髓核细胞骨向分化能力的影响.[方法]采用组织块法分离兔骨膜细胞,胰酶、胶原酶消化法获取髓核细胞,传至3代进行共培养实验,实验分为2组:正常氧组(20％O2)、低氧组(5％O2),共培养后用CCK-8检测细胞增殖情况,用AKP试剂盒、BCA试剂盒检测碱性磷酸酶活性,RT-PCR检测骨钙素、Ⅰ型胶原、RUNX2以及HIF-la mRNA的表达,免疫组化试剂盒检测Ⅰ型胶原的表达,茜素红染色检测钙盐沉积或钙结节.[结果]骨膜细胞和髓核细胞在体外成功分离和培养,共培养后保持了较高的增殖率,经过成骨诱导培养后成功诱导为成骨细胞,细胞增殖曲线为“S”型,两组在1、3、5、7、9d的光吸收值(OD)比较差异有统计学意义(P＜0.05);低氧组的骨钙素、Ⅰ型胶原、RUNX2以及HIF-1a mRNA表达水平高于常氧组(P＜0.05),碱性磷酸酶(ALP)活性高于常氧组(P＜0.05),细胞成骨染色(茜素红染色、免疫组化)结果显示低氧组较常氧组表达增多.[结论]低氧条件下体外共培养的骨膜细胞和髓核细胞经成骨诱导后向成骨细胞分化的能力更强.
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年龄因素对大鼠髓核细胞生物学特性的影响
[目的]探讨年龄因素对大鼠髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)生物学特性的影响.[方法]分别从青年(3个月龄)和老年(14个月龄)雄性SD大鼠分离培养NPCs.镜下观察两组NPCs形态特征和生长状况;待细胞传至第3代时,绘制生长曲线评估其增殖能力;衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-beta-galactosidase,SA-β-gal)染色法测定NPCs衰老情况;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9的mRNA相对表达.[结果]两组细胞均呈短梭形或多角形,老年组NPCs胞体略偏大、扁平,胞质的折光性减弱,核变大;青年组NPCs较老年组贴壁、生长快,达到细胞融合状态所需时间短;生长曲线结果显示,进入对数生长期后,青年组NPCs增殖速率显著高于老年组;SA-β-gal染色结果显示,青年组蓝染的NPCs呈散在分布,而老年组多呈簇状分布,其SA-β-gal阳性率显著高于青年组(P＜0.05);细胞周期分析结果显示,老年组G1期细胞的百分比显著高于青年组(P＜0.05),S期细胞百分比显著低于青年组(P ＜0.05);RT-PCR检测结果显示,青年组Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9的mRNA相对表达量显著高于老年组(P＜0.05).[结论]随年龄增长,NPCs衰老后其生物学活性及表型基因的表达降低.
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过表达NDRG2基因促进人髓核细胞衰老的体外实验研究
[目的]研究NDRG2(N-Myc downstream-regulated gene 2)对人髓核细胞衰老的影响,进而探讨NDRG2在椎间盘退变中的作用.[方法]通过慢病毒过表达NDRG2基因稳定感染髓核细胞.设立正常髓核细胞组(空白组)、红色荧光蛋白标记的慢病毒感染髓核细胞组(对照组)及过表达NDRG2慢病毒感染髓核细胞组(实验组).Western blot检测NDRG2蛋白表达水平,细胞衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色检测髓核细胞衰老变化,流式细胞仪检测髓核细胞周期变化,MTT法绘制生长曲线,并分析髓核细胞的增殖情况.[结果]正常髓核细胞感染过表达NDRG2慢病毒48 h后荧光显微镜下观察基因感染效率在95％以上;感染72 h后Western blot检测示NDRG2表达明显升高(P＜0.01);实验组SA-β-gal染色阳性率明显高于对照组和空白组(P＜0.01);MTT生长曲线显示慢病毒感染后髓核细胞增殖速度较对照组和空白组均减慢,潜伏期延长,缓慢进入对数期;细胞周期结果示实验组G0/G1期百分比明显高于对照组和空白组,S期明显低于对照组和空白组,差异有统计学意义(P＜0.05).[结论] NDRG2基因过表达的髓核细胞衰老速度明显加快,提示NDRG2可能通过调控髓核细胞的衰老参与椎间盘退变过程,为椎间盘的退变生物学治疗提供依据.
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新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的实验研究
[目的]观察以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的可行性.[方法]分离培养兔髓核细胞,与丝素蛋白多孔支架在体外复合培养,建立组织工程化髓核模型,通过扫描电镜、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化以及酶联免疫吸附测定观察细胞在支架上1周和3周的生长及增殖情况.[结果]培养1周后,扫描电镜显示细胞呈球状均匀地贴附在支架内部.细胞-支架复合体HE染色可见支架内部有大量髓核细胞,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.培养3周后,扫描电镜显示细胞成层黏附于支架表面,细胞重叠生长,分泌大量细胞外基质,HE染色可见支架内部有大量髓核细胞填满支架孔隙并分泌大量细胞外基质,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.酶联免疫吸附测定:3周组蛋白多糖含量(52.4±4.5) ng/ml明显高于1周组(29.3±3.6) ng/ml,P＜0.05,3周组的Ⅱ型胶原含量(24.3 ± 1.8) ng/ml明显高于1周组(15.16±1.5) ng/ml,P＜0.05.[结论]新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外培养生长良好,分泌大量类似髓核样细胞外基质,可以用于体外构建组织工程化髓核.
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微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞增殖及生长动力学研究
[目的]通过单层培养和微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞对比,研究两种培养方式对其生长活性及增殖能力的影响.[方法]本实验通过Trypan blue法计数细胞并绘制生长曲线,应用3H- TdR放射免疫法检测退变髓核细胞增殖活性,流式细胞仪检测退变髓核细胞周期,比较两种培养方式对细胞增殖的影响.[结果]微载体旋转立体旋转培养较单层培养细胞从贴壁到对数生长期开始时间( 16～20 d)较长,但是严格意义的稳定生长期(3～5 d)很短；对数生长期长,一般14 ～ 17 d,期间细胞增殖活跃.两种培养方式的细胞处于稳定生长期时,细胞增殖能力没有明显区别,而处于对数生长期时,微载体培养的细胞的增殖能力明显高于单层培养组的细胞(P＜0.05).细胞周期测定显示两种细胞停滞在G0/G1期的占71％左右,培养方式对其影响不明显.而微载体培养的细胞的S期明显较单层培养的细胞为长(P＜0.05).[结论]成人退变髓核应用微载体培养后增殖能力及生长活性提高,可解决组织工程学椎间盘种子细胞难以收集的难题,为将来开展椎间盘组织工程学的研究奠定良好的基础.
