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人工髓核材料的研究进展
椎间盘退变性疾病是一种临床常见疾病，40%的下腰背疼痛是由腰椎间盘退变引起的。临床手术治疗只能在短期内缓解症状，无法达到根治的目的。在髓核摘除术后，人工髓核组织材料包括早的硅橡胶、不锈钢和现在使用的水凝胶材料被用来填补病变的髓核组织，维持椎间盘足够的高度。随着组织工程和材料科学的不断发展，有希望使用干细胞或多能细胞来修复病变椎间盘或逆转其退变过程，重塑椎间盘的生理功能。现阶段组织工程仍然需要面临的问题是能否找到一种近似于髓核组织结构和功能的细胞外支架，为种子细胞的生长和生理活动提供合适的环境。文章就人工髓核材料的发展历史以及目前的研究情况展开综述。
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人髓核细胞体外培养及冻存的实验研究
目的 研究颈椎手术所取髓核组织培养髓核细胞的可行性,适合作为种子的代次,冻存复苏是否影响其传代.方法 测量传1～5代次髓核细胞免疫组织化学法照片光密度(OD)值,观察胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量的差异.通过噻唑蓝(MTT)试验观察冻存(实验组)与未冻存(对照组)髓核细胞增殖活力的差异.通过免疫组织化学法观察冻存对髓核细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量的影响.结果 ①采用酶消化法可成功分离并培养出人髓核细胞,传1、2代细胞形态呈短梭型、三角形或多边形,传3代以后,细胞形态逐渐变为长梭型.②Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学法测OD值,传1与2代比较差异无统计学意义(P＞0.05).③实验组细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学法测得OD值与对照组细胞比较,差异无统计学意义(P＞0.05),实验组细胞与对照组细胞MTT比色法测OD值比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ①经颈椎手术取得的髓核组织,可体外培养出髓核细胞,并可获得传代细胞.②传1、2代髓核细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量差异较小,细胞形态分化不明显,适宜做髓核组织工程学种子细胞.③冻存复苏处理未能使髓核细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量减少,细胞增殖活力亦未降低.
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白藜芦醇抑制IL-1β诱导髓核细胞活化NF-κB
目的:探讨白藜芦醇(Res)抑制IL-1β诱导髓核细胞活化NF-κB.方法:髓核细胞的培养,实验分组与处理,Western blot检测NF-κB p65核易位水平.结果:与阴性对照组比较,髓核细胞经IL-1β刺激后,NF-κB p65亚基核易位水平显著增高;应用5～50 μ mol/L浓度的Res作用后,其NF-κB p65亚基核易位水平随Res浓度而降低至对照.结论:Res对IL-1β诱导髓核产生的NF-κB具有抑制作用,能下调和消除过度的炎症反应,缓解椎间盘退变和改善临床症状.
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白藜芦醇对IL-1β诱导的髓核细胞增殖的影响
目的:探讨白藜芦醇(Res)对IL-1β诱导的髓核细胞增殖的影响.方法:采用CCK-8法检测并比较不同浓度Res对IL-1 β诱导髓核细胞的增殖率.结果:当IL-1β在浓度为0.1ng/mL时能显著促进髓核细胞增殖(P＜0.01);当IL-1β在浓度为0.1～5ng/mL时,IL-1β均能促进髓核细胞增殖(P＜0.01),且呈一定的浓度依赖性;Res在浓度为5 μ mol/L时即能显著抑制IL-1β诱导髓核细胞增殖(P＜0.01);在5～50 μmol/L的浓度范围内,Res均能抑制IL-1β诱导髓核细胞增殖,且呈一定的浓度依赖性.结论:Res对IL-1β诱导的髓核细胞增殖具有抑制作用,Res能降低或延缓椎间盘炎症环境,对椎间盘具有一定的保护作用.
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TGF-β1基因转染修饰人退变腰椎间盘髓核细胞的临床研究
目的:研究分析转化生长因子β1 (TGF-β1)基因转染修饰人退变腰椎间盘髓核细胞.方法:选取珠海市人民医院2012年10月至2014年10月收治的60例腰椎间盘退变患者,将其随机分为观察组和对照组,每组30例,观察组使用含有TGF-β1基因的腺病毒载体转染修饰细胞,对照组用EGFP基因(增荧光绿色蛋白基因)转染细胞.观察比较两组相应的编码蛋白表达情况.结果:观察组患者细胞中出现了生长因子TGF-β1,转染率约为30％,对照组没有出现生长因子,但是外源基因均转染成功,有绿色荧光表达,且持续了一个月.结论:使用腺病毒载体能将TGF-β1基因转染患者退变的腰椎间盘髓核细胞,使之产生生长因子TGF-β1,这为腰椎间盘退变的基因治疗提供了基础.
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绿原酸保护大鼠髓核细胞对抗氧化应激的作用机制研究
目的:探讨绿原酸(CGA)对过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠髓核细胞凋亡的作用机制.方法:采用体外培养大鼠髓核细胞,传代后取第3代细胞进行实验.随机分成5组:正常对照组、H2O2处理组、CGA +H2O2组、CGA组和CGA+ PI3K/Akt抑制剂(LY294002)干预组.流式细胞术检测各组的细胞凋亡率及细胞内活性氧水平;Westem blot检测各组髓核细胞中Akt,p-Akt,BCL-2的表达.结果:与正常对照组比较,H2O2组诱导的髓核细胞凋亡数显著增高,细胞内ROS含量显著增高;CGA预处理后显著抑制了髓核细胞凋亡和ROS产生,增加了细胞内p-Akt和BCL-2的表达,但LY294002抑制剂显著抑制了CGA对氧化应激后髓核细胞的上述功能.结论:绿原酸可通过激活PI3K-Akt信号途径抑制细胞内活性氧的产生、上调抗凋亡BCL-2蛋白水平的表达来保护髓核细胞免受氧化应激引起的损伤.
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瘦素通过 JAK2／STAT3途径调控椎间盘髓核细胞的分解代谢
目的：探讨瘦素对椎间盘髓核细胞中退行性变相关分解代谢基因的影响，并探讨其机制。方法：培养SD大鼠髓核细胞，行cytokeratin 19和II型胶原免疫组化进行鉴定。使用瘦素和（或）白细胞介素1β（ IL－1β）作用于髓核细胞，real－time PCR分析MMP－1、MMP－3、MMP－9、MMP－13、ADAMTS－4、ADAMTS－5、aggrecan 和COL2A1的表达水平。阿利辛蓝染色和免疫组化分析II型胶原和蛋白多糖的生成。 Western blot 分析激活的信号通路，并使用不同通路的抑制剂来分析信号通路的作用。结果： Real－time PCR显示单用瘦素可以提高MMP－1、MMP－13、ADAMTS－4和ADAMTS－5的表达水平；IL－1β和瘦素可以协同提高MMP－1、MMP－3和ADAMTS－5的表达水平；瘦素降低髓核细胞II型胶原的表达，PI3K／Akt通路和JAK2／STAT3通路均被激活，但使用抑制剂后显示只有JAK2／STAT3信号通路参与瘦素对髓核细胞的作用。结论：瘦素通过调节JAK2／STAT3信号通路促进髓核细胞的分解代谢，可能是肥胖与椎间盘退变相互关联的机制。
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腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘对髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响
目的:观察腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(Ad/CMV-hTGF-β1)对兔椎间盘髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响.方法:纯种成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组和对照组,每组10只.于实验组兔腰3、4椎间盘髓核内注射Ad/CMV-hTGF-β1(6×106pfu),注射量为20μl,对照组则注射20μl磷酸盐缓冲液(PBS).术后3周取出椎间盘,免疫组织化学方法观察椎间盘髓核细胞中Ⅰ型、Ⅱ型胶原的表达情况,并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析.结果:免疫组织化学染色显示:实验组椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达比对照组低;而Ⅱ型胶原的表达则比对照组高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论:体内转染腺病毒介导的hTGF-β1基因能降低椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达、提高Ⅱ型胶原的表达,提示hTGF-β1可以抑制椎间盘的退变.
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Piezo机械敏感性离子通道研究现状及其在骨与关节组织的研究进展
机械敏感性离子通道是一类与生物力学机械信号传递密切相关的离子通道,一经发现即引起国内外学者的广泛关注.近,在哺乳动物中已经发现了一类几乎无处不在的膜通道,即Piezo1和Piezo2,被认为在哺乳动物的机械生物学中起着至关重要的作用.骨细胞、软骨细胞、髓核细胞、骨肉瘤细胞和成骨细胞等均可感受细胞外环境中的力学机械刺激,通过机械敏感性离子通道激活细胞信号转导途径,影响细胞的增殖、分化、迁移及凋亡.本文就有关Piezo机械敏感性离子通道的研究现状及其在骨与关节领域的研究进行综述.
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Rock信号通路抑制剂对大鼠髓核细胞生物学特性的影响
目的 探讨Rock信号通路抑制剂对大鼠髓核细胞的基质代谢及凋亡等生物学特性的影响.方法 qPCR和western blot检测TNF-α与Rock通路抑制剂Y-27632对大鼠原代髓核细胞Cox2、MMP3、MMP13的表达调控;MTS细胞增殖试验检测不同浓度Y-27632刺激下对髓核细胞增殖的影响;Annexin/PI法检测Y-27632对髓核细胞凋亡的影响.结果 予Rock抑制剂Y-27632刺激后,髓核细胞MMP13的表达水平上调(P＜0.05),髓核细胞的凋亡率增加(P＜0.05),但予Y-27632刺激后髓核细胞的增殖速度无明显差异(P＞0.05).结论 Rock信号通路可能通过调控髓核细胞MMP13表达水平及其凋亡等生物学特性从而参与了椎间盘的退变.
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白介素-1β对髓核细胞MMP-1、2、9、13表达的影响
目的 探讨IL-1β对人椎间盘髓核细胞表达基质金属蛋白酶MMP-1、2、9、13的作用.方法 分离人椎间盘髓核细胞进行单层培养并利用甲苯胺蓝、番红O染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定,而后分别用10 ng/ml和50 ng/ml重组人IL-1β刺激体外培养的髓核细胞,RT-PCR检测基质金属蛋白酶-1、2、13的表达,定量PCR检测基质金属蛋白酶-9的表达.结果 10 ng/ml和50 ng/ml重组人IL-1β均可促进髓核细胞基质金属蛋白酶-1、2、9、13的表达(P<0.05);基质金属蛋白酶-9、13表达随IL-1β浓度升高而升高(P<0.05).结论 IL-1β可以促进人椎间盘髓核细胞表达基质金属蛋白酶-1、2、9、13.其加速了椎间盘基质分解的作用亦可能通过上述细胞因子的介导.
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周期性应力下大鼠髓核细胞中Src蛋白磷酸化及其作用的实验研究
目的 探讨周期性应力下大鼠髓核细胞中Src蛋白的磷酸化水平及其意义. 方法 体外培养SD大鼠髓核细胞,取第2代细胞按1×105/mL的密度接种于玻片上.将玻片随机分成4组(n=8):对照组、加压0.5h组、加压1.0h组、加压2.0h组.加压0.5h组、加压1.0h组、加压2.0h组细胞以0 ～ 200 kPa的压力、0.1Hz的频率分别加压0.5、1.0、2.0h,对照组在无压力环境下培养.应用Western blot检测各组磷酸化Src(pSrc)蛋白的表达.应用PP2[4-氨基-5-(4-氯苯)-7-(t-丁基)吡唑啉酮(3,4-d)嘧啶]抑制Src蛋白,另取细胞玻片,随机分为3组(n=8):对照组、加压6h组、PP2+加压6h组.使用荧光实时定量多聚酶链式反应(RT-PCR)检测3组细胞中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的基因表达.结果 对照组、加压0.5h组、加压1.0h组及加压2.0h组pSrc/磷酸甘油醛脱氢酶灰度比值平均分别为0.244 ±0.013、0.477±0.044、0.530±0.014、0.700±0.063,4组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05),除加压0.5h组与加压1.0h组之间外,其余组别之间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).荧光RT-PCR检测3组Ⅱ型胶原和蛋白多糖的基因表达结果显示:对照组表达量低(1.001±0.039、1.004 ±0.104),加压6h组高(5.404 ±0.219、2.127 ±0.028),PP2+加压6h组居中(3.038 ±0.237、1.678±0.125),3组之间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 周期性压力能促进髓核细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的分泌,Src蛋白磷酸化在压力传导中起信号传递作用.
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不同代次兔髓核细胞中Ⅱ型胶原和SOX9的表达
目的:通过培养不同代次兔髓核细胞,检测其Ⅱ型胶原和SOX9的含量变化,观察其细胞生长规律.方法:取2 ～ 3个月龄新西兰大白兔8只,空气栓塞致死后取出胸、腰椎段髓核进行细胞传代培养.将原代细胞作为对照组(A组,n ＝ 8),传代后的2、3、4、5代细胞分别为B、C、D、E组,显微镜下观察不同代次细胞的形态变化;MTT法绘制细胞生长曲线;RT-PCR和免疫组化法检测不同代次细胞Ⅱ型胶原和SOX9的表达.结果:原代细胞(A组)生长缓慢,20 ～ 30 d达80%融合可传代;B组生长速度快,7 ～ 10 d可传代,C、D、E组生长速度依次减慢.RT-PCR和免疫组化法检测可知A组和B组的Ⅱ型胶原及SOX9的表达明显高于C、D、E三组(P ＜ 0.05),A、B组之间差异无显著性(P ＞ 0.05),C、D、E组之间差异无显著性(P ＞ 0.05).结论:不同代次兔髓核细胞的生长规律、Ⅱ型胶原及SOX9含量不同,第2代兔髓核细胞生物学特性与原代细胞相似,可作为种子细胞进行实验研究.
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成人退行性变椎间盘髓核细胞的体外培养研究
目的:采用组织块细胞培养法或酶消化细胞培养法进行成人退行性变椎间盘细胞培养,并探讨不同浓度胎牛血清对成人髓核细胞体外培养的影响.方法:采用组织块细胞培养法与酶消化细胞培养法培养成人退行性变椎间盘细胞,分析两种方法是否能成功获得细胞,并比较不同浓度胎牛血清对成人髓核细胞体外培养的影响.结果:采用组织块细胞培养法及酶消化细胞培养法两种方法都可获得原代髓核细胞;髓核细胞在胎牛血清20%浓度组的开始贴壁时间、50%细胞贴壁时间、90%细胞贴壁时间均短于15%浓度组及10%浓度组(P均＜0.01).结论:两种细胞培养方法均成功建立髓核细胞体外培养模型;20%的胎牛血清浓度相比15%及10%浓度胎牛血清更有利于成人退变髓核细胞的体外培养.
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腰椎间盘髓核细胞活性与MRI退变分型的相关性研究
目的 通过对不同退变程度腰椎间盘的髓核细胞进行培养及活性测定,明确髓核细胞活性与MRI退变分型的相关性.方法 取腰椎间盘髓核组织20例,均为我科收治单一手术节段患者,其中A组2例,为正常椎间盘髓核组织(Pearce Ⅰ&Ⅱ型);B、C、D三组分别6例,分别为MRI分型轻、中、重度(PearceⅢ型,Ⅳ型,V型),退变椎间盘髓核组织均在同样条件下进行体外髓核细胞的分离与原代培养,于5d,10 d,15 d,20 d,25 d五个时间段消化细胞,细胞计数了解各组细胞活性,CCK-8比色法绘制各组细胞的生长曲线,比较各组差异.结果 髓核细胞计数在同时间点上A组明显高于B、C、D组,B、C、D组之间均存在显著统计学差异(P＜0.01).在同时间点上A组OD值(吸光值)明显高于B、C、D组,B、C、D各组之间OD值(吸光值)均存在统计学差异(P＜0.01).结论 ①正常腰椎间盘组织髓核细胞活性明显高于退变椎间盘髓核细胞.②MRI分型轻、中、重度退变腰椎间盘髓核细胞活性与其分型基本相符.
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骨形态发生蛋白-7对胚胎小鼠髓核细胞成骨分化和Notch信号表达的影响
目的:探索骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)诱导胚胎小鼠椎间盘髓核细胞(nucleus pulposus,NP)的成骨分化及对经典Notch信号通路的调控作用.方法:重组腺病毒BMP-7(recombinant adenovirus-mediated bone morphogenetic protein-7,Ad-BMP-7)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,Ad-GFP)在HEK293细胞中扩增,感染NP细胞.实验分为BMP-7组(n=3)、GFP组(n=3)、空白组(n=3).RT-PCR检测BMP-7的mRNA水平表达;Real-time PCR检测成骨指标骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)以及经典Notch信号通路分子的mRNA表达水平;Western blot检测成骨转录因子Runx2和OPN的蛋白表达水平;采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)读数和ALP染色检测ALP活性.结果:Ad-BMP-7和Ad-GFP在HEK293细胞中高滴度的扩增.NP细胞中BMP-7的基础表达很低,Ad-BMP-7感染NP细胞可高表达BMP-7,并明显提高OPN、OPG的mRNA水平表达(OPN:BMP-7组21.16±0.45,GFP组1.00±0.07,空白组2.84±1.27,F=613.815,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=-0.000; OPG:BMP-7组2.05±0.37,GFP组1.00±0.06,空白组1.22±0.36,F=10.046,P=0.012,BMP-7组与GFP组比较P=0.016,与空白组比较P=0.047),成骨转录因子Runx2及OPN的蛋白表达水平也均高于对照组,特异性成骨指标ALP的活性明显增强,ALP染色呈紫蓝色,明显高于对照组(BMP-7组222 676.8±7 643.2,GFP组31 455.5±4 930.6,空白组42 407.3±10 926.8,F=513.417,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000).AdBMP-7感染3d可促进Notch信号通路Notch-1、Notch-2、Jag-1、Hey-1的mRNA水平表达增高(Notch-1:BMP-7组5.90±0.66,GFP组2.83±0.32,空白组1.00±0.05,F=94.574,P=0.002,BMP-7组与GFP组比较P=0.003,与空白组比较P=0.004; Notch-2:BMP-7组150.35±11.78,GFP组1.94±0.46,空白组1.01±0.19,F=318.962,P=0.001,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000;Jag-1:BMP-7组7.97±0.00,GFP组2.22±0.71,空白组1.00±0.00,F=166.476,P=0.001,BMP-7组与GFP、空白组比较均P=0.000; Hey-1:BMP-7组11.23±0.4,GFP组0.42±0.00,空白组1.00±0.10,F=1 082.054,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000),但第7天回复到基础表达水平,其余信号分子表达无明显差异.结论:腺病毒介导的BMP-7可诱导NP细胞成骨分化,可能与Notch信号通路部分分子的一过性上调相关.
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白血病抑制因子对退变髓核细胞胞外基质的影响及其机制研究
目的:探讨退变椎间盘髓核组织白血病抑制因子(leukemia inhibit factor,LIF)表达及其对胞外基质表达的影响.方法:40只新西兰兔随机分5组(1组为对照组,4组为实验组),每组8只.针刺法建立L4/5、L5/6椎间盘退变模型,术后0、2、4、8周对椎间盘进行MRI扫描及HE染色评价退变程度,免疫组化检测髓核组织LIF的表达.体外原代培养兔髓核细胞,不同浓度重组LIF蛋白刺激髓核细胞24、48、72 h,Western blot检测聚蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(COLLA2α1)的表达,免疫荧光检测大浓度组和对照组Aggrecan的表达并行Western blot检测金属蛋白酶组织抑制物-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP-1)和基质金属蛋白酶-3(matrixmetalloproteinase-3,MMP-3)的表达.结果:影像学和组织学评分显示椎间盘退变随造模时间延长而加重,各组间差异有统计学意义(1.000±0.000,2.000±0.535,2.750±0.463,3.875±0.354,P=0.000;4.000±0.000,7.375±0.518,9.375±1.302,11.750±0.463,P=0.000).免疫组化显示2周组LIF表达高,随着椎间盘退变加重,其表达降低,但各组均高于0周组,差异有统计学意义(559.608±68.689,16 135.613±577.329,8 149.739±457.189,2 018.254±211.870,P=0.000).细胞学实验显示,加入不同浓度LIF刺激后,Aggrecan、COLLA2α1的蛋白表达与LIF刺激浓度呈正相关,各处理组与对照组差异有统计学意义(0.191±0.020,0.212±0.020,0.321±0.041,0.511±0.032,0.561±0.042,P=0.000),Aggrecan免疫荧光结果与之相符.处理组TIMP-1表达明显高于对照组(0.454±0.022,0.211±0.012,P=0.000),MMP-3明显低于对照组(0.243±0.013,0.362±0.021,P=0.000).结论:LIF在退变髓核组织中表达上升,且具有促进胞外基质合成作用,其潜在机制与LIF能够上调TIMP-1并下调MMP-3作用相关.
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Id1基因在BMP-2维持椎间盘细胞软骨特性中的作用
目的 构建Id1基因过表达和RNAi慢病毒载体,并以兔椎间盘髓核细胞为研究对象,观察Id1基因表达水平调整后,BMP-2诱导髓核细胞分泌软骨特性因子的变化.方法 ①设计针对Id1基因过表达和RNA干扰的序列,应用基因重组技术将目的基因片段连接到慢病毒载体,转染293T细胞后测定病毒滴度.②将2种慢病毒分别感染髓核细胞,QRT-PCR和Western blot检测髓核细胞Id1mRNA和蛋白表达.③重组腺病毒AdBMP2感染髓核细胞,利用已制备的2种慢病毒再次感染细胞,QRT-PCR检测细胞表达软骨特性分子的能力.结果 ①慢病毒感染髓核细胞后,Id1基因的mRNA与蛋白的表达量与未感染病毒组(0.428±0.079)及空载病毒组(0.400±0.045)相比,过表达组(0.848±0.154)增加,RNAi组(0.115 ±0.014)下降,差异具有统计学意义(P＜0.01),符合预期结果.②细胞内Id1的表达增加可促进colⅡ(0.407±0.083)和ACAN (0.284±0.074)的mRNA表达增加,与GFP组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01).③ADBMP2处理细胞后,Id1的表达增加可使colⅡ(0.590±0.072)和ACAN(0.351 ±0.066)的mRNA表达进一步显著升高;Id1表达降低时,以上因子的表达被明显抑制[colⅡ:(0.244±0.060),ACAN:(0.168±0.034),差异具有统计学意义(P＜0.01)].结论 Id1能够促进椎间盘细胞软骨特性分子的表达,细胞内Id1基因水平变化能够显著影响BMP-2诱导细胞分泌软骨特性因子,推测Id1是BMP-2维持椎间盘细胞软骨特性作用的关键因子.
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NF-κB抑制剂对脂多糖刺激的退变人椎间盘髓核细胞炎症因子表达的影响
目的 观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激退变人椎间盘髓核细胞前后,核因子kappB(NF-κB)与炎症因子表达及相互关系.方法 体外培养退变的人椎间盘髓核细胞,设立对照组、LPS (500 μg/mL)刺激组、NF-κB抑制剂(BAY11-7082)+LPS(500 μg/mL)刺激组.ELISA方法检测各组细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β的含量,免疫荧光法检测各组髓核细胞内p65的表达及定位,Western blot检测TNF-α、IL-1β、NF-κB结合蛋白p65以及磷酸化p-p65的表达,Real-time PCR检测TNF-α及IL-1β的表达.结果 LPS刺激髓核细胞后,p65入核增多,p-p65表达明显增加,ELISA实验结果表明LPS刺激组细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平升高(P＜0.05),Western blot及Real-time PCR检测结果也表明其髓核细胞内炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显上升(P＜0.05);而与LPS刺激组相比,NF-κB抑制剂+LPS刺激组p65入核减少,p-p65表达明显降低,细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平降低(P＜0.05),Western blot及Real-time PCR检测结果也表明其髓核细胞内炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显下降(P＜0.05).结论 LPS能够通过激活人退变髓核细胞NF-κB信号通路,促进炎性因子TNF-α及IL-1β表达增多,抑制NF-κB信号通路后可明显减轻炎性因子的表达.
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骨形态发生蛋白9激活PI3K/Akt信号通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡
目的 研究骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对退变髓核细胞炎症反应和凋亡的影响,并探究其与PI3 K/Akt信号通路的关系.方法 通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型;重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)将BMP9转染人人髓核细胞内(human nucleus pulposus cells,HNPCs),实验共分5组:Control组(正常培养的HNPCs)、OGD组(氧糖剥夺模型)、AAV组(氧糖剥夺模型,转染AAV空载体)、AAV-BMP9组(氧糖剥夺模型,转染AAV-BMP9),AAV-BMP9+LY294002组(AAV-BMP9组基础上添加PI3K抑制剂LY294002).免疫荧光方法检测蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen,Col2a1)的表达;Western blot检测p-Akt和p-mTOR的蛋白表达;酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表达;流式细胞术检测细胞的凋亡.结果 在氧糖剥夺培养模型中Aggrecan和Col2al表达明显降低;AAV-BMP9组中p-Akt和p-mTOR的表达明显高于OGD组和AAV组(P＜0.05);此外,AAV-BMP9组HNPCs分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8明显减少,细胞凋亡被显著抑制(P＜0.05);LY294002的加入能够显著逆转BMP9的上述效果.结论 BMP9能够抑制退变HNPCs的炎症反应和凋亡,并且这种作用是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的.
