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IL-1β通过p38、JNK和NF-κB信号通路促进髓核细胞增殖
目的:探讨白细胞介素1β(IL-1β)对髓核细胞增殖的影响,并深入研究其机制.方法:体外培养人髓核细胞,用IL-1β处理髓核细胞,通过CCK-8实验和Ki67免疫荧光实验检测IL-1β对髓核细胞增殖能力的影响.用Western blotting检测IL-1β对MAPK和NF-κB信号通路的影响.通过对细胞信号通路进行特异性抑制,观察上述通路在IL-1β作用于髓核细胞过程中的作用.结果:CCK-8实验和Ki67免疫荧光实验均提示IL-1β提高髓核细胞的增殖能力.Western blotting实验显示IL-1β显著激活髓核细胞中的MAPK和NF-κB信号通路.使用p38、JNK和NF-κB的抑制剂均能明显抑制IL-1β诱导的髓核细胞增殖,而ERK的抑制剂则不能.结论:IL-1β通过p38、JNK和NF-κB信号通路促进髓核细胞增殖.
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平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究
目的:探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的影响,为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法.方法:体外培养兔髓核细胞,分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组,利用倒置显微镜、扫描电镜进行髓核细胞形态学观察,MTT法测定各组髓核细胞增殖情况,HE染色、免疫组化分析髓核细胞Ⅱ型胶原的表达,阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖(GAG)含量.结果:经过两周的培养,两组髓核细胞均能够增殖;与平面培养组相比,三维培养组细胞增殖率、Ⅱ型胶原表达量、GAG合成量均增高(均P<0.01).结论:髓核细胞能够与PLGA支架很好地黏附并增殖;PLGA支架三维培养较平面培养能促进髓核细胞增殖,提高Ⅱ型胶原和GAG的合成量,可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法.
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椎间盘生物学及细胞表型的研究进展
椎间盘退变是腰背痛的主要原因,研究椎间盘发育、退变,结构功能以及椎间盘中各种细胞的特异性标志物有助于椎间盘疾病的治疗.近年来的研究发现,椎间盘起源于脊索,椎间盘退变始于髓核细胞类型和数量的改变,同时也伴随着纤维环细胞和终板软骨细胞的改变.髓核细胞有相对系统的标志物,而纤维环细胞和终板软骨细胞尚无明确的标志物.作者就椎间盘的生物学特征以及椎间盘内各种细胞标志物的研究进展作一综述.
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骨髓间充质干细胞对退变椎间盘修复的新进展
近年来,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)修复退变椎间盘一直是研究热点,它对细胞重建及功能恢复提供了一种全新的治疗策略.作者就MSCs对退变椎间盘修复的新进展进行了综述.
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离心应力下构建组织工程髓核
目的:探讨离心应力对髓核细胞功能表达和组织工程髓核结构的影响.方法:取兔胸腰段椎间盘髓核组织,经胰蛋白酶.Ⅱ型胶原酶消化分离出细胞,在含15%灭活胎牛血清的DMEM/F12培养基中体外扩增至第3代,以3×107/ml的细胞悬液种植于PIGA无纺网支架上.实验组在离心力下培养(实验1组相对离心力为134.16g,实验2组相对离心力为301.86g,每天2次,每次离心20 min),对照组静态培养,每组4个标本,培养4周后取出髓核细胞与支架复合物,行大体标本,扫描电镜,组织学和免疫组织化学染色观察离心应力对组织工程髓核结构及Ⅱ型胶原分泌情况的影响.结果:离心应力下构建的组织工程髓核的厚度和直径大于对照组,细胞外基质明显多于对照组,Ⅱ型胶原免疫组化染色,实验1组阳性染色面积为(14.36±2.82)%,实验2组阳性染色面积为(18.71±2.14)%,对照组为(9.13±1.58)%,实验1组、实验2组与对照组差异有统计学意义(P<0.01),实验2组与实验1组差异有统计学意义(P<0.05).结论:一定范围的离心应力刺激髓核细胞增加Ⅱ型胶原的分泌,有利于在体外构建组织工程髓核.
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正常及退变髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向分化效果比较
目的:分离培养SD大鼠退变髓核细胞(degenerative nucleus pulposus cells,dNPCs)、正常髓核细胞(nucleus pulposuscells,NPCs)及骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),通过Transwell非直接接触体外共培养方法比较dNPCs和NPCs对BMSCs诱导作用.方法:针刺抽吸法制备SD大鼠退变椎间盘动物模型,取正常及已退变的生长良好的第2代NPCs及生长良好的第3代骨BMSCs,将dNPCs或NPCs等比例与BMSCs分别复合藻酸盐接种于Transwell共培养系统中进行体外非接触共培养(上室接种BMSCs,下室接种dNPCs或NPCs作为dNPCs共培养组和NPCs共培养组)7d后回收上室BMSCs.单独NPCs和单独BMSCs培养组分别作为阳性和阴性对照.对各组Ⅱ型胶原(collagenⅡ)和多功能蛋白聚糖(aggrecan)行RT-PCR和Western blot检测.结果:collagenⅡ和aggrecan的mRNA表达在两共培养组均有较高表达,但NPCs共培养组较dNPCs共培养组更加接近单纯NPCs组,而单纯BMSCs组未见明显表达;collagenⅡ和aggrecan的蛋白表达量在两共培养组中均较高,但NPCs共培养组较dNPCs共培养组更加接近单纯NPCs组,而单纯BMSCs组未见明显表达.结论:在Transwell非直接接触共培养条件下dNPCs和NPCs均能诱导BMSCs向髓核方向分化,并且NPCs对BMSCs向髓核方向分化的诱导作用更加明显.
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脂联素通过AMPK/mTOR通路抑制H2O2诱导的大鼠髓核细胞凋亡及细胞外基质退变
目的:探讨脂联素(adiponectin,APN)对氧化应激下大鼠髓核细胞凋亡和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)退变的保护作用及相关机制.方法:原代培养SD大鼠髓核细胞,CCK-8法检测细胞活力,以确定APN的适保护浓度.将细胞分为对照组、H2O2组、APN+H2O2组及Compound C+APN+H2O2组,流式细胞术检测凋亡率,Western blot检测Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)及带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5,ADAMTS-5)等蛋白的表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原(collagen typeⅡalpha 1 chain,COL2A1)、蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)的mRNA水平,Western blot评估5’-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化水平.结果:1μg/mL APN对200 μmol/LH2O2所致的细胞毒性起佳拮抗作用.APN预处理显著抑制H2O2诱导的髓核细胞凋亡.相应地,Bax/Bcl-2比值及Cleaved Caspase-3表达的增加也被APN抑制.尽管对ADAMTS-5无明显抑制作用,APN降低了H2O2诱导的MMP-13的表达.此外,H2O2对COL2A1及ACAN转录的抑制作用也被APN显著缓解.APN还促进AMPK磷酸化并抑制mTOR磷酸化,而AMPK抑制剂Compound C显著减轻了APN对mTOR磷酸化的抑制作用.APN对凋亡、分解代谢的抑制作用及其对合成代谢的促进作用也均被Compound C逆转.结论:APN通过AMPK/mTOR通路抑制H2O2诱导的大鼠髓核细胞凋亡及ECM退变.
关键词： 脂联素 髓核细胞 凋亡 细胞外基质退变 AMPK/mTOR通路 -
FasL受体在突出腰椎间盘髓核细胞中的表达及意义
目的:检测突出的腰椎间盘髓核中FasL受体的表达情况,探讨其与腰椎间盘突出症发生与发展的关系.方法:根据美国矫形外科学会(AAOS)及国际腰椎研究会(ISSLS)分类,将20例术中取出的腰椎间盘突出症患者髓核标本分成退变组(10例)、脱出组(10例),并以7例外伤性脑死亡青年患者作为正常对照组,应用免疫组化法检测髓核中FasL受体表达情况并通过电镜查找凋亡细胞.结果:(1)FasL受体主要定位于细胞膜,呈均匀的棕黄色细颗粒状或粗细不等;(2)3组FasL阳性表达率明显不同(P＜0.05);(3)Fas阳性表达率的高低同年龄有关(r=0.4102,P＜0.05),但与性别及病程无关;(4)电镜可观测到细胞凋亡的一些形态学变化.结论:腰椎间盘、突出髓核细胞中存在FasL受体的表达,突出类型不同,FasL受体表达的程度也不同,其异常表达诱导了髓核细胞的凋亡,可能在腰椎间盘突出症的发病过程中起着重要作用.
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重组BMP7腺病毒的构建及转染兔髓核细胞的表达
目的构建重组BMP7腺病毒(Ad-BMP7),观察其转染兔髓核细胞后的表达.方法(1)真核表达载体pcDNA3.1(+)-BMP7经一系列特定的限制性内切酶酶切,重组了BMP7的腺病毒载体,并转染293细胞进行扩增、滴度测定.(2)取20只新西兰大白兔,15只作为实验组,5只作为实验对照组.实验组椎间盘注射Ad-BMP7,实验对照组注射携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺病毒(Ad-GFP),另设空白对照组.分别于注射后1周、2周和4周各处死5只实验组兔子,注射后1周处死全部实验对照组兔子.RT-PCR和免疫组织化学染色检测BMP7的表达情况.结果(1)重组Ad-BMP7经限制性内切酶PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切获得BMP7基因片段,PCR扩增得到特异的扩增片段,表明重组的Ad-BMP7载体构建成功.(2)实验组的髓核细胞显示了BMP7染色阳性结果,1、2和4周组的阳性染色率差异无显著意义(P＞0.05).结论重组BMP7腺病毒的构建及其在兔髓核细胞的表达,为研究其对体内髓核细胞生物学行为的影响奠定了基础.
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腺病毒介导的基因在人退变髓核细胞的表达
目的通过对人退变髓核细胞的原代培养,了解其生物学特性,并将绿色荧光蛋白基因转染至细胞内,观察基因在细胞内的表达情况.方法培养人退变髓核细胞,建立体外髓核细胞培养模型,同时进行细胞活力测定,并用腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染至髓核细胞内,观察基因的表达情况.结果 (1)人退变髓核细胞贴壁及生长的速度均十分缓慢;(2)随着培养时间的延长及传代,细胞活力逐渐降低;(3)转染了绿色荧光蛋白基因的髓核细胞可以持续发出绿色荧光达4周.结论 (1)兔腰椎间盘髓核细胞的生长能力较弱;(2)外源性的基因可以在髓核细胞内得到持续的表达.
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转染BMP7基因对兔髓核细胞生物学行为的影响
目的 观察转染重组BMP7腺病毒(Ad-BMP7)后,兔髓核细胞BMP7和Ⅱ型胶原的表达情况.方法 (1)取20只新西兰大白兔,15只作为实验组,5只作为实验对照组.实验组椎间盘注射Ad-BMP7,实验对照组注射携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺病毒(Ad-GFP),另设空白对照组.(2)分别于注射后1、2、4周各处死5只实验组兔子,注射后1周处死全部实验对照组兔子.RT-PCR和免疫组织化学染色检测BMP7的表达情况,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达情况.结果 (1)实验组的髓核细胞显示了BMP7染色阳性结果,1、2、4周组阳性染色率差异无统计学意义(P>O.05).(2)实验组的髓核组织问质Ⅱ型胶原呈阳性染色,1、2、4周的灰度值单因素方差分析,差异有高度统计学意义(P<0.01);SNK两两比较,第1周与第2、第4周差异有统计学意义(P<0.05),第2、第4周间差别无统计学意义(P>0.05).结论 Ad-BMP7转染兔髓核细胞后,能获得长期表达,并能促进Ⅱ型胶原合成.
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三维共培养对髓核细胞与骨髓间充质干细胞增殖的影响
目的 建立椎间盘髓核细胞(NPCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架三维共培养系统.方法 分别培养乳兔NPCs和BMSCs至原代融合和第3代,将两种细胞按2:1 (BMSCs:NPCs)比例混匀,以6×106/ml的终浓度分别接种于培养板作为平面共培养组(A组)和PLGA支架(直径10 mm,厚3 mm)作为三维共培养组(B组)；每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液100μl,体外培养2周,利用倒置显微镜、扫描电镜进行细胞形态学观察；MTT法测定各组细胞增殖情况.结果 细胞与材料支架黏附良好.经过2周的培养,A组和B组细胞均能够增殖；与A组相比,B组细胞增殖率增高(P＜0.01).结论 共培养的NPCs和BMSCs均能够与PLGA支架很好地黏附并增殖；PLGA支架三维共培养NPCs和BMSCs较平面共培养更能促进细胞增殖.
关键词： 椎间盘组织工程 髓核细胞 骨髓间充质干细胞 聚乳酸-乙醇酸共聚物支架 -
兔椎间盘髓核细胞体外退变模型的建立
目的 建立兔椎间盘髓核细胞体外退变模型.方法 体外分离培养兔椎间盘髓核细胞,并传至第5代,细胞被分成原代细胞组和第5代退变细胞组,用细胞爬片进行HE染色,流式细胞术测定细胞周期,RT-PCR测定Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚合素的mRNA水平的表达,化学和免疫组织化学的方法 定量测定DNA、糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的含量.结果 退变细胞由原代细胞的多角形退变成纤维细胞样的梭形,原代细胞处于S期细胞显著多于退变细胞;退变细胞的Ⅱ型胶原和聚合素的表达显著下降,而Ⅰ型胶原的表达显著升高(P<0.01);退变细胞的DNA含量及精胺聚糖和Ⅱ型胶原与DNA的比值较原代细胞显著下降(P<0.01).结论 兔椎间盘髓核细胞传至第5代会发生显著退变,主要功能基质mRNA水平的表达和含量显著的下降;Ⅰ型胶原显著升高,有退变为纤维细胞的趋势.
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正常与退变髓核细胞对骨髓间充质干细胞诱导分化的对比研究
目的 正常髓核细胞(nNPCs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)有诱导分化作用,而退变髓核细胞(dNPCs)对MSCs的诱导作用是否存在差异尚未阐明,文中对比nNPCs与dNPCs对MSCs向髓核细胞分化诱导作用的差异.方法 细胞株/退变患者来源的人NPCs与细胞株来源人MSCs行体外三维共培养,分为5组:nNPCs对照组、dNPCs对照组、MSCs对照组、nNPCs-MSCs组(nNPCs诱导的MSCs)、dNPCs-MSCs组(dNPCs诱导的MSCs),共培养7 d后,行RT-PCR及Western blot检测各组细胞聚集蛋白聚糖(ACAN)、II型胶原(COL-2)、SOX-9、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-3的表达水平.结果 RT-PCR结果显示,与nNPCs对照组相比:dNPCs对照组ACAN、COL-2、SOX-9的表达较低(P<0.05),MMP-1、MMP-3的表达相对较高(P<0.01);nNPCs-MSCs组ACAN的表达相对较低(P<0.05);dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达相对较低(P<0.05).与dNPCs对照组相比:nNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达相对较高(P<0.05),MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.01);dNPCs-MSCs组MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.01).与MSCs对照组相比:nNPCs-MSCs组及dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达均相对较高(P<0.01).与nNPCs-MSCs组相比:dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达相对较低(P<0.05).Western blot结果显示:与nNPCs对照组相比:dNPCs对照组ACAN、COL-2、SOX-9的表达较低(P<0.05),而MMP-1、MMP-3的表达较高(P<0.05);nNPCs-MSCs组MMP-1、MMP-3的表达相对较低(P<0.01);dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9、MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.05).与dNPCs对照组相比:nNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达较高(P<0.05),MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.01);dNPCs-MSCs组MMP-1、MMP-3的表达较低(P<0.01).与MSCs对照组相比:nNPCs-MSCs组及dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达均相对较高(P<0.01).与nNPCs-MSCs组相比:dNPCs-MSCs组ACAN、COL-2、SOX-9的表达均相对较低(P<0.05).结论 nNPCs及dNPCs均能诱导MSCs向髓核样细胞分化,与nNPCs共培养后,MSCs的ACAN、COL-2、SOX-9的表达水平与nNPCs相当,优于同样培养条件下dNPCs对MSCs的诱导.
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椎间盘退变的分子治疗研究进展
椎间盘退变主要表现为椎间盘细胞和细胞外基质成分的变化,如髓核细胞由软骨细胞表型转变为纤维软骨细胞表型,细胞外基质中蛋白多糖、水及Ⅱ型胶原蛋白丢失破坏了正常椎间盘和椎体的解剖结构,直接导致椎间盘力学特征丧失.
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细胞凋亡与腰椎间盘退变的关系
腰椎间盘退行性病变是导致的腰腿痛主要原因之一。在多种因素作用下可导致椎间盘突出、椎管狭窄、退行性脊柱侧弯、脊柱失稳等。而髓核细胞的数量和功能又与椎间盘退变密切相关［1-2］。以往认为椎间盘退变是一种形态学的改变，表现为局部生物力学失稳现象，近年来研究表明，髓核内细胞数量的丢失可引起椎间盘退变。研究发现细胞凋亡是退变椎间盘组织细胞数量下降的重要原因［3］。为此将细胞凋亡在腰椎退变中扮演着重要的角色作一综述。
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反分化早、晚期髓核细胞的建立及AV-TGFβ1对其蛋白多糖的影响
目的 建立反分化早、晚期兔腰椎间盘髓核细胞模型,并比较腺病毒(AV)介导TGFβ1对其蛋白多糖合成的生物学作用.方法 选用一月龄纯种新西兰兔3只.无菌分离髓核组织,并用0.125%的胰蛋白0.25%的Ⅰ型胶原消化分离细胞.通过反复消化传代的方法建立反分化早、晚期髓核细胞模型并通过细胞形态的观察和Ⅱ型胶原表达水平的的检测对其鉴定.采用Antonopulos法检测AV-TGFβ1转染后反分化早、晚期髓核细胞蛋白多糖的含量.结果 原代培养细胞呈多欠形或圆形,反分化早期细胞呈梭形,反分化晚期细胞类似于成纤维细胞.伴随着细胞形态的改变,Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达亦逐渐降低.AV-TGFβ1可促进反分化早期髓核细胞蛋白多糖的合成.而对于反分化晚期髓核细胞,AV-TGFβ1则抑制其蛋白多糖的合成.结论 体外传代培养的方法可用于建立反分化早、晚期髓核细胞模型.AV-TGFβ1仅可促进反分化早、期髓核细胞蛋白多糖的合成.
关键词： 转化生长因子β1(TGFβ1) 腺病毒 髓核细胞 蛋白多糖 -
类髓核细胞复合藻酸盐支架治疗椎间盘退变的实验研究
目的 通过判断类髓核细胞移植到退变椎间盘中对基质金属蛋白酶3(MMP-3)、白细胞介素1(IL-1)的影响,来判断类髓核细胞复合藻酸盐治疗退变椎间盘的可行性.方法 采用针刺法诱导兔椎间盘退变,体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)成类髓核细胞;将类髓核细胞复合藻酸盐植入退变椎间盘,以Western blot方法检测不同阶段退变椎间盘中MMP-3、IL-1的变化.结果 成功诱导兔椎间盘退变模型;成功诱导BMSCs成类髓核细胞(强表达Ⅱ型胶原及蛋白聚糖);Western blot显示在实验组中MMP-3、IL-1含量随着植入时间的延长逐渐降低,且较对照组、空白组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 类髓核细胞移植到退变椎间盘中可以抑制MMP-3、IL-1的表达,为类髓核细胞复合藻酸盐治疗退变椎间盘提供了理论依据.
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髓核细胞老化机制研究进展
椎间盘是由位于中央的髓核、周围的纤维环以及上下两侧的软骨终板构成的一个可以缓冲机体自身张力与抵抗外部压力的完美闭合系统.由其退行性变所导致的颈部及腰腿部位疼痛一直都是骨科临床中为常见的症状之一.在引起椎间盘退变的遗传、年龄、炎症因子、凋亡、老化等诸多因素中,髓核细胞的老化是已经确认的引起椎间盘退变的重要原因[1],老化可导致髓核细胞活性减低、功能减退,进而发生椎间盘退行性变[2].鉴于此,在探寻髓核以及椎间盘的退变机制时,深入研究髓核细胞的老化机制将会是一个重要且不容忽略的重要切入点.本文从近年来髓核细胞老化的新研究成果入手,通过归纳分析,希望可以明晰究竟是哪几条信号通路在髓核细胞老化过程中发挥作用并引起终的生物学效应,从而为今后从分子水平上阻断并逆转髓核细胞退变过程、进而治疗椎间盘退变性疾病提供相关依据.
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信号通路对髓核细胞调节作用研究进展
椎间盘退行性改变是影响人类健康的重要疾患之一,而髓核是椎间盘的重要组成部分,与椎间盘退变有密切关系.由于髓核缺少血液供应,且有低pH值和营养缺乏的限制,因此髓核细胞的增殖率是比较低的.而它特殊的解剖学构造及胞外基质的组成,使其处于低氧及高渗状态.在这种特殊理化环境下,各种信号通路的调节作用已成为近年研究热点.本文旨在对此调节作用的研究进展作一综述,为改善椎间盘退变提供新思路.
