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阻断酸敏感离子通道1a对酸诱导的破骨细胞形成及其骨吸收的影响
目的 观察酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)介导酸诱导的破骨细胞形成和骨吸收的作用.方法 建立巨噬细胞集落刺激因子(maerophage colony stimulating factor,M-CSF)和细胞分化因子(receptor activator of nuclear foetor-κB ligand,RANKL)体外诱导骨髓单核细胞分化为破骨细胞,慢病毒为载体转染细胞沉默ASIC1a,并通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRACP)染色和骨吸收实验检测破骨细胞的形成及其骨吸收功能,采用Western blotting法检测活化T细胞核因子c1 (nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)蛋白的表达.结果 阻断ASIC1a可明显抑制酸诱导的破骨细胞的形成及其骨吸收功能(P =0.000),阻断ASIC1a可抑制酸诱导的NFATc1蛋白表达(P=0.000).结论 阻断ASIC1a对酸诱导的破骨细胞形成和骨吸收具有明显抑制作用,其机制可能是抑制转录因子NFATc1蛋白的表达.
关键词： 酸敏感离子通道1a 破骨细胞 活化T细胞核因子c1 -
酸敏感离子通道与脑梗死
急性脑梗死约占全部脑卒中的70％,病死率和致残率高,且极易复发.但目前针对急性脑梗死在时间窗内溶栓、抗凝等治疗手段不能从根本上切实有效地修复受损脑组织,且伴有出血等风险.寻找脑梗死形成发展的原因并予以治疗迫在眉睫.酸中毒是引起缺血性脑损伤的重要机制.大量实验研究表明,酸中毒能加重神经元的缺血性损伤,且其梗死面积与酸中毒的程度直接相关.但缺血产生的酸中毒如何引起神经元损伤的确切机制尚不明确.近研究发现酸中毒能激活一种在中枢及周围神经中广泛存在的膜通道,即酸敏感离子通道,它对Ca2+通透,能引起细胞内Ca2+超载,同时能激活胞内酶引起细胞内蛋白质、脂类及核酸的降解,加重缺血后脑损伤.本文就酸敏感离子通道1a与脑梗死做一综述.
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酸敏感离子通道1a在小鼠小脑浦肯野细胞的表达
目的 探讨小鼠小脑浦肯野细胞酸敏感离子通道1a(ASIC1a)的表达及意义.方法 选用出生后第0,7,14,21,30天和2个月的SPF级C57BL/6小鼠,乙醚麻醉后取小脑组织制成切片,通过免疫荧光技术观察小鼠小脑浦肯野细胞ASIC1a的表达.结果 出生后第0,7,14,21,30天和2个月的小鼠小脑浦肯野细胞均存在ASIC1a的表达.结论 小鼠小脑浦肯野细胞存在ASIC1a的表达,对认识ASIC1a对小脑浦肯野细胞发育的作用有重要意义.
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酸敏感离子通道1a介导细胞内钙离子内流调节椎间盘终板软骨细胞凋亡
目的:观察酸敏感离子通道1a(ASIC1a)介导的钙离子内流在酸诱导的终板软骨细胞凋亡的作用.方法:SD培养大鼠终板软骨细胞,慢病毒为载体转染终板软骨细胞沉默ASIC1a,钙离子成像分析细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验分析酸诱导的细胞活力;ELISA测定凋亡率;荧光染料Hoechst 33342检测细胞凋亡.免疫印迹检测活化型半胱天冬酶-9 (cleaved caspase-9)、活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)等凋亡相关蛋白的表达.结果:阻断ASIC1a可以抑制酸诱导的[Ca2+]i升高;用ASIC1a-siRNA或PcTX1特异性阻断ASIC1a,明显抑制酸诱导的终板软骨细胞凋亡;胞外钙离子浓度降低抑制酸诱导的终板软骨细胞凋亡,与阻断ASIC1a结果一致,提示ASIC1a介导的钙离子内流在酸诱导凋亡中的作用.阻断ASIC1a,抑制酸诱导的cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白的表达.结论:酸激活的ASIC1a可能通过钙超载促使大鼠椎间盘终板软骨细胞凋亡.
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靶向酸敏感离子通道的神经保护:酸毒性损伤机制的重新审视
生理水平的质子在生物体内分布广泛,具有重要的生理功能.在特定的病理条件下,正常的酸碱平衡被破坏,导致质子大量生成和累积,产生对机体有害的酸毒(acidotoxicity).组织酸化是多种神经系统疾病(如缺血性中风、多发性硬化症以及亨廷顿舞蹈症等)的共同病理特征,也是致这些疾病神经损伤的原因之一.质子可直接激活酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel,ASIC),介导组织酸化相关的生理和病理功能,例如,缺血性神经损伤.一直以来,ASIC引起酸毒性神经损伤被认为主要依赖于通道介导的细胞内钙离子升高.然而,本研究组新近的研究表明ASICla亚型通道能够通过激活受体相互作用蛋白l (receptor-interacting protein 1,RIP1),介导不依赖于通道离子通透功能的细胞程序性坏死.另外,亚细胞定位研究发现,除了在神经元膜表面,ASIC1a还可以定位在线粒体内膜上,通过调控线粒体通透性转变(mitochondrial permeability transition,MPT)过程,在缺血性神经损伤中发挥重要作用.这些进展使人们对于ASIC介导神经元死亡的机制有了新的认识.
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骨癌痛大鼠脊髓背角酸敏感离子通道1a表达的变化
目的 探讨骨癌痛(bone cancer pain,BCP)大鼠脊髓背角酸敏感离子通道1a (acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)表达的变化. 方法 雌性未交配SD大鼠56只,体重180 g～220 g,采用随机数字表法分为3组:正常组(Ⅰ组,12只)、假手术组(Ⅱ组,12只)和BCP组(Ⅲ组,32只).每组随机取8只分别于术前1d及术后3、5、7、10、14、18d测定大鼠体重和机械缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT).Ⅰ组、Ⅱ组于术后18d测完PWMT后,Ⅲ组于术前1d及术后3、7、10、14、18d,同一时段随机处死4只大鼠,取腰段脊髓,采用Western blot法检测ASIC1a的表达.每组于术后14 d取4只大鼠,采用免疫荧光技术观察各组大鼠患侧脊髓ASIC1a和神经元免疫反应阳性产物的共表达. 结果 与Ⅰ组、Ⅱ组比较,Ⅲ组术后7d～18d体重降低(P＜0.01);5 d PWMT[(8.86±2.49)g]开始下降(P＜0.01),术后7[(5.17±1.26)g]、10 [(2.68±0.60)g]、14[(1.85±0.98)g]、18 d[(1.58±0.38) g]PWMT进一步降低(P＜0.01);Western blot显示,Ⅲ组术后3d开始ASIC1a表达上调(P＜0.01),于术后14 d～18 d达到高峰(P＜0.01);免疫荧光发现,Ⅲ组脊髓背角ASIC1a的表达显著增加(P＜0.01),与神经元共标细胞数也相应增加(P＜0.01). 结论 BCP大鼠脊髓背角神经元中ASIC1a表达增多,大鼠BCP的形成和维持可能与脊髓背角ASIC1a表达上调有关.
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酸敏感离子通道1a阻断剂对大鼠全脑缺血-再灌注损伤的保护作用
目的 探讨酸敏感离子通道(ASIC)1a的阻断剂对大鼠全脑缺血-再灌注损伤的保护作用.方法 成年雄性SD大鼠72只,体重250～300 g,随机均分为四组:假手术组(S组)、全脑缺血-再灌注组(IR组)、溶剂组(V组)和ASIC1a特异性阻断剂组(P组).IR组、V组和P组参照四血管阻断法建立大鼠脑缺血-再灌注模型,缺血15 min后恢复灌注.V组和P组分别于再灌注即刻侧脑室注射6μl双蒸水和狼蛛毒素(PcTX1)6μl(500 ng/ml).再灌注6h后处死大鼠取海马组织,每组取其中12只分别采用Western blotting法测定海马钙/钙调蛋白依赖型蛋白激酶Ⅱ磷酸化水平(P-CaMKⅡ)和RT-PCR法检测脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸激酶B(TrKB) mRNA的水平.其余6只于再灌注24 h后,采用HE染色法观察海马神经元形态学变化.结果 与S组比较,其他三组海马P-CaMKⅡ、BDNF mRNA和TrKB mRNA的表达明显上调(P＜0.05)；与IR组比较,P组P-CaMKⅡ表达明显下调、BDNF mRNA及TrKB mRNA的表达明显上调(P＜0.05).IR组和V组海马CA1区锥体细胞稀疏；P组海马CA1区组织破坏和细胞损伤程度减轻,细胞层次基本恢复.结论 ASIC1a的阻断剂减轻大鼠全脑缺血-再灌注损伤,其机制可能与P-CaMKⅡ表达下调、BDNF及TrKBmRNA的表达上调有关.
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ASIC1 a对大鼠关节软骨细胞基质代谢及MAPK信号通路表达的影响
目的：研究ASIC1a(acid-sensing ion channel 1a)对大鼠关节软骨细胞基质代谢及MAPK信号通路表达的影响。方法 SD大鼠关节软骨细胞分离、培养与鉴定,建立软骨细胞ASIC1a 表达沉默模型。将软骨细胞分为正常组( pH 7.4)、pH 6.0酸化组、以及ASIC1a特异性阻滞剂PcTx-1、表达沉默组和非特异性阻滞剂Amiloride处理的酸化组,对二甲基亚甲蓝分光法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中GAG的含量,氯胺T法检测 Hyp的含量, ELISA法检测 MMP-2、TIMP-2的含量,Western blot 法检测酸化及阻断 ASIC1a 后ERK1/2、p38 MAPK 磷酸化蛋白的表达。结果激活ASIC1a明显抑制大鼠关节软骨细胞GAG、Hyp和TIMP-2代谢水平( P<0.01),对MMP-2的代谢水平降低抑制作用较弱(P<0.01),且ASIC1a能引起ERK1/2、p38 MAPK磷酸化水平升高,阻断 ASIC1a后,磷酸化水平升高受到明显抑制(P<0.01)。结论 ASIC1a参与了酸诱导的大鼠关节软骨细胞基质代谢的失衡,其机制可能与激活 ERK1/2和 p38 MAPK磷酸化有关。
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酸敏感离子通道1a 在酸诱导的大鼠关节软骨细胞自噬的作用及其机制研究
目的 研究酸敏感离子通道1a (acid-sensing ion channel 1a) 在体外培养的酸诱导的大鼠关节软骨细胞自噬的作用及其可能机制.方法Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠关节软骨细胞,鉴定后传代培养,观察在不同pH条件下诱导的细胞自噬情况以确定胞外酸化条件;将软骨细胞分为pH 7.4环境下培养的正常组、pH 6.0的酸化组、以及经ASIC1a非特异性阻断剂Amiloride和特异性阻断剂PcTX1处理的酸化组,RT-PCR法检测细胞自噬基因Beclin-1 mRNA的表达,Western blot法检测自噬蛋白LC3及ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白的表达,透射电子显微镜法(TEM)观察自噬小体数量的变化;通过使用ERK1/2、p38MAPK磷酸化抑制剂(PD98059、SB203580),采用RT-PCR和Western blot法观察ERK1/2及p38MAPK对酸诱导的软骨细胞自噬的影响.结果 pH 5.5和pH 6.0胞外酸化刺激均能明显升高软骨细胞自噬水平(P<0.01);与pH 7.4组比较,酸化组软骨细胞Beclin-1 mRNA及LC3、磷酸化的ERK1/2和p38MAPK蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),且自噬小体数量增多,ASIC1a阻断剂组自噬水平及ERK1/2、p38磷酸化蛋白表达水平较酸化组明显降低(P<0.01),且自噬体数量减少;与pH 6.0组相比,ERK1/2磷酸化抑制剂处理后,Beclin-1 mRNA和LC3蛋白的表达均下调(P<0.05,P<0.01),而p38磷酸化抑制剂组自噬水平则无明显变化.结论 胞外酸化环境下能诱发软骨细胞自噬,阻断ASIC1a能明显减弱酸化诱导的软骨细胞自噬,其机制可能与抑制ERK1/2磷酸化有关.
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酸敏感离子通道1a在自身免疫性疾病发病机制中的研究进展
酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是在外周和中枢神经系统中广泛表达的质子门控的阳离子通道,ASIC1a作为其重要的组成部分在许多生理和病理过程中起重要作用.作为细胞外质子的关键受体,ASIC1a参与涉及组织酸中毒的多种病理生理过程,如疼痛、炎症、癫痫发作、多发性硬化等.自身免疫疾病是机体在应对自身抗原发生免疫反应时,过度活化的T、B细胞导致机体多组织器官受损的慢性炎症性疾病.近年来研究发现,ASIC1 a在多种自身免疫性疾病发生中发挥着重要作用,该文就ASIC1a的生物学特征作简要综述,重点探讨ASIC1a在自身免疫性疾病发病机制中的研究进展.
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芍药苷下调PC12细胞酸敏感离子通道1a的表达拮抗酸诱导的钙内流
酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,ASICs)是一类能被细胞外H~+激活的阳离子通道,其中的ASIC1a亚基能介导钙的内流,参与了脑缺血缺氧、帕金森病(Parkinson's disease,PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease,HD)等神经系统疾病的病理过程.
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酸敏感离子通道1a偶联内质网应激在人髓核细胞退变中的作用机制初探
[目的]模拟人椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)酸性环境,探讨酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)的活化与内质网应激的关系.[方法]体外单层培养人正常髓核细胞(nuc1eus pulposus cells,NPCs)系,不同pH值培养不同时间,模拟椎间盘酸性微环境,建立酸诱导的退变髓核细胞模型.CCK-8检测细胞增殖能力.Western blot、qPCR检测内质网应激.Western blot检测ASIC1a的表达.Fura-2/AM荧光探针检测ASIC1a活化介导的Ca2+内流.流式细胞术检测ASIC1a活化后细胞凋亡率.PcTX1(ASIC1a特异性阻断剂)阻断ASIC1a后,观察细胞凋亡及内质网应激指标变化情况.[结果]酸诱导髓核细胞凋亡,酸激活ASIC1a及内质网应激,PcTX1能降低促凋亡的内质网应激通路和髓核细胞凋亡率(P＜0.05),而未折叠蛋白反应相关指标无明显变化(P＞0.05).[结论]ASIC1a能够调控内质网应激中的促凋亡通路,阻断ASIC1能够保护酸诱导的髓核细胞凋亡.
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酸敏感离子通道1a在视网膜色素上皮细胞氧化损伤过程中的作用
目的 观察酸敏感离子通道1a( ASIC1 a)在视网膜色素上皮细胞(RPE)氧化损伤过程中的作用.方法 采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以及Western blot的方法检测RPE在1 mmol/L H2O2诱导的细胞氧化损伤过程中(0.5 ～4.0 h),ASIC1a的表达变化；同时分别采用ASICs阻断剂amiloride和PCTx1,以及通过细胞转染ASIC1a,检测对该氧化损伤过程的影响,并应用噻唑蓝(MTT)比色法评价细胞的活性.结果 实时RT-PCR以及Western blot的结果均显示RPE中ASIC1a在mRNA及蛋白水平均有表达.1mmol/L H2O2处理RPE 1、2、4h后,RPE中ASIC1a的蛋白表达明显降低至(70.5±11.0)％、(40.6±5.6)％和(45.6±7.6)％.PCTx1阻断ASIC1a后,RPE细胞存活率明显降低,至4h细胞存活率为(76.2±5.0)％(与对照组比较,P＜0.05),而过表达ASIC1a能够提高RPE氧化损伤过程中细胞的存活率,与H2O2处理组比较,4h组为(38.0±6.0)％比(16.2±2.0)％(P＜0.05).结论 ASIC1a在RPE中具有表达并对RPE的氧化损伤具有一定的细胞保护作用.
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ASIC1a参与小鼠小脑普肯耶细胞发育的机制研究
目的 探讨ASIC1a参与小脑普肯耶细胞发育的机制. 方法 取C57BL/6初生小鼠,通过体外培养得到小脑普肯耶细胞.将原代小脑普肯耶细胞分为实验组和对照组,分别在细胞发育早期阶段及晚期阶段处理,其中实验组用shRNA-ASIC1a序列重组质粒慢病毒感染以下调ASIC1a表达,对照组用shRNA-对照序列重组质粒慢病毒感染.采用免疫荧光染色观察早期阶段和晚期阶段实验组、对照组小脑普肯耶细胞的形态学结构并计数树突分支;采用Westem blotting检测小脑普肯耶细胞中钙结合蛋白D-28K、胶质纤维酸性蛋白、Zic、小清蛋白以及N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的表达;采用RT-PCR检测小脑普肯耶细胞中内质网应激相关因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)的表达. 结果 免疫荧光染色检测发现:在早期阶段和晚期阶段,实验组、对照组小脑普肯耶细胞形态学差异明显,对照组小脑普肯耶细胞的树突生长发育较实验组好;实验组小脑普肯耶细胞的二、三级树突分支数目较对照组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting检测发现:在早期阶段,只有普肯野细胞特异性蛋白钙结合蛋白D-28K表达在实验组中较对照组明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).在早期阶段和晚期阶段,ASIC1a表达下调后,实验组NMDAR表达较对照组明显上调,差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测结果发现:在早期阶段和晚期阶段,实验组内质网应激相关因子CHOP、PERK表达均较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 ASIC1a在小脑普肯耶细胞发育机制中发挥着重要作用.
关键词： 普肯耶细胞 酸敏感离子通道1a 内质网应激 N-甲基-D-天冬氨酸受体 -
侧柏叶水煎液对耳廓炎症和腹腔炎症模型小鼠的抗炎作用
目的：研究侧柏叶水煎液对耳廓炎症和腹腔炎症模型小鼠的抗炎作用。方法：将小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性对照（阿司匹林0.25 g/L）组和侧柏叶高、中、低剂量[1、0.5、0.25 g（生药）/L]组，依次记为A、B、C、D、E、F组，每组10只，连续ig给药5 d。除A组外，其余各组分别复制耳廓炎症模型和腹腔炎症模型。检测耳廓炎症模型小鼠血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）含量，计算肿胀度和肿胀率；检测腹腔炎症模型小鼠肝组织中TNF-α、IL-1、酸敏感离子通道1a（ASIC1a）含量和腹腔灌洗液中蛋白质浓度（ΔA）。结果：耳廓炎症模型中，与A组比较，B组小鼠血清中TNF-α、IL-1含量增加；与B组比较，C、D、E、F组小鼠血清中TNF-α、IL-1含量减少，肿胀度和肿胀率降低；与C组比较，E、F组小鼠血清中TNF-α、IL-1含量、肿胀度和肿胀率增加；以上差异有统计学意义（P＜0.05）。腹腔炎症模型中，与A组比较，B组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA均增加；与B组比较，C、D、E、F组小鼠TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA降低；以上差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：侧柏叶水煎液对耳廓炎症和腹腔炎症模型小鼠有抗急性炎症作用，其机制可能与降低TNF-α、IL-1及ASIC1a有关。
