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加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织核转录因子-κB、锌指蛋白A20表达的影响
目的:观察加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织核转录因子-κB 65(NF-κB65)、锌指蛋白A20蛋白及其基因表达的影响.方法:Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、地塞米松和加味小青龙汤组.采用脂多糖气管滴泣联合烟熏方法建立COPD大鼠模型,检测支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量,检测肺组织NF-κB65、A20蛋白及其基因表达,观察加味小青龙汤对上述指标及肺组织病理形态学变化的影响.结果:与正常组比较,模型组TNF-t、IL-1β、NF-κB和A20蛋白及其基因表达均明显上调;与模型组比较,加味小青龙汤组TNF-α、白介素-1β、NF-κB蛋白表达明显降低,加味小青龙汤组A20基因表达显著上调.病理观察结果显示,与正常组比较,模型组肺组织炎症细胞浸润,管腔中有大量中性粒细胞及黏液聚集,管壁明显增厚,胶原染色显示肺间质纤维组织大量增生;加味小青龙汤组肺组织病理改变明显轻于模型组,加味小青龙汤组肺组织少数呈轻度间质性肺炎,仅见少量的纤维组织增生.结论:加味小青龙汤能够减轻COPD模型大鼠肺组织损伤,对COPD模型肺组织有保护作用,其机理可能与其降低TNF-α和白介素-1β含量、下调NF-κB蛋白表达、上调A20基因表达有关.
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NF-κB抑制剂减低LPS致兔腰椎间盘髓核细胞锌指蛋白A20表达升高
目的 观察脂多糖(LPS)刺激退变兔椎间盘髓核细胞前后,锌指蛋白A20(A20)、NF-κB及相关炎性因子的表达及其相互关系.方法 获取正常和退变兔腰椎间盘髓核细胞,分为正常组、退变组、LPS刺激组和NF-κB抑制剂组,HE染色观察椎间盘髓核及纤维环的形态,免疫组化检测椎间盘A20、NF-κB p65蛋白及Ⅱ型胶原(COL-Ⅱ)的表达.Real-time PCR分别检测各组A20、IL-1β、TNF-α、NF-κB和COL-ⅡmRNA的表达.Western blot观察A20、p65和COL-Ⅱ的表达.ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达.结果 退变组髓核细胞数量明显减少,髓核细胞聚集成团,COL-Ⅱ表达下降,A20和p65蛋白表达升高;与正常组相比,退变组A20、TNF-α、IL-1β和p65表达在mRNA及蛋白水平均明显升高,COL-Ⅱ表达降低(P<0.05);LPS刺激组中A20、TNF-α、IL-1β和p65表达较退变组更显著,COL-Ⅱ降低明显(P<0.05);NF-κB抑制剂组较LPS刺激组A20、TNF-α、IL-1β和p65表达回降,COL-Ⅱ表达回升(P<0.05).结论 髓核细胞炎性反应与兔椎间盘退变的发生和发展密切相关,其中A20可能发挥了重要作用.
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电针百会、四关穴对大鼠局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质中Tax1结合蛋白1表达的影响
目的 观察电针百会、四关穴对大鼠局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质中Tax1结合蛋白1(TAX1BP1)表达的影响,探讨电针抑制核因子-κB(NF-κB)信号通路的激活,发挥脑保护作用的可能机制.方法105只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组,每组再分为缺血2 h后再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h五个亚组.改良Longa线栓法制备右侧大脑中动脉梗死再灌注模型.电针组给予电针百会穴和病侧四关(合谷/太冲)穴.检测各组神经功能,缺血区大脑皮质中TAX1BP1蛋白的表达情况、TAX1BP1阳性细胞数、锌指蛋白A20和胞核NF-κB p65蛋白的表达情况.结果 假手术组无神经功能缺损,与模型组相比,电针组在局灶性脑缺血2 h再灌注48 h、72 h时神经功能评分降低(P<0.05).与假手术组相比,模型组在再灌注12 h、24 h、48 h时TAX1BP1蛋白表达增加(P<0.05);与模型组相比,电针组在再灌注12 h、24 h、48 h、72 h时TAX1BP1蛋白表达进一步增加(P<0.05),再灌注24 h为表达高峰.在再灌注24 h后,与假手术组相比,模型组A20表达、TAX1BP1阳性细胞数、胞核NF-κB p65表达增加(P<0.05);与模型组相比,电针组的A20表达、TAX1BP1阳性细胞数进一步增加(P<0.05),胞核NF-κB p65蛋白表达减少(P<0.05).免疫荧光结果显示,TAX1BP1蛋白主要表达在胞浆,电针组TAX1BP1与A20共表达在胞浆.免疫组化结果显示,模型组NF-κB p65主要表达在胞核,电针组主要表达在胞浆.结论 电针抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注后NF-κB信号通路的激活,促进大鼠神经功能恢复,其机制可能是通过上调TAX1BP1蛋白的表达,从而发挥脑保护作用.
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锌指蛋白A20对脂多糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞炎症效应的影响
目的 探讨锌指蛋白A20(zinc finger protein A20)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)炎症效应的影响及可能机制. 方法 分离及培养RPMCs,常规传代及鉴定.取第2代细胞用于实验研究.将细胞随机分成对照组、LPS组、转染A20组、空载体组.脂质体转染A20质粒(pGEM-T easy A20)至RPMCs 12h后分别在LPS刺激不同时间点收获细胞提取蛋白及细胞上清液.用Western b]otting检测细胞TLR4、p-Iκ Bα、IκBα蛋白的表达；用ELISA法检测培养上清液IL-18蛋白水平. 结果 LPS刺激8h后,转染A20组RPMCs TLR4蛋白表达水平无明显增高,与对照组相比,P=0.223;与LPS组及空载体组相比,差异有显著性(P=0.003,0.002).LPS刺激1h后,转染A20组RPMCs p-IκB α蛋白无明显降解,p-I κ Bα/I κ Bα比值与对照组相比,P=0.553.与LPS组及空载体组相比,差异有显著性(P=0.001,0.001).在LPS刺激12h后,转染A20组RPMCs IL-18蛋白分泌水平(479.12±85.79)pg/ml高于对照组(274.34±47.21) pg/ml (P=0.012),但明显低于LPS组(1049.45±185.01)pg/ml及空载体组(1028.77±192.90) pg/ml (P=0.011,0.015).结论 A20通过对LPS信号通路中多个相关功能蛋白的负性调控作用,阻抑LPS诱导的RPMCs炎症效应.
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骨化三醇诱导锌指蛋白A20抑制下游基因表达延长肝移植大鼠生存期
目的探讨骨化三醇延长大鼠肝移植后受体生存期的机理.方法观察肝移植后受体大鼠应用骨化三醇前后锌指蛋白A20及其下游基因表达的变化.结果原位肝移植后预防性应用骨化三醇可以抑制急性排斥反应(RAI 3.0±1.0 vs 8.7±0.6,P＜0.05),保护移植物功能[AST:(334±40)U/L vs(2572±537)U/L,P＜0.01;BIL:(38±11)mmol/L vs(159±47)mmol/L,P＜0.01],延长移植后受体生存期[100d的生存率(83.33±29.81)%vs(66.67±37.65)%,P＜0.01].同时,预防性应用骨化三醇后移植物局部Th1类细胞因子浓度明显降低[IL-2浓度(80.61±18.63)ng/ml vs(770.99±92.92)ng/ml,P＜0.01;IFN-γ浓度(230.05+47.42)ng/ml vs(984.19±166.16)ng/ml,P＜0.01].其上游调控因子NF-κB核内表达水平明显降低,抑制蛋白IκB和锌指蛋白A20表达水平明显增强.结论原位肝移植后预防性应用骨化三醇可以诱导"细胞保护性"基因A20表达,从而抑制蛋白IκB的降解,抑制NF-κB活化,并阻断损伤性细胞因子的表达,抑制急性排斥反应,延长移植后受体生存期.
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锌指蛋白A20在炎症性肠病患儿肠黏膜中的表达及意义
目的 探讨炎症性肠病(IBD)患儿肠道炎症反应与锌指蛋白A20(A20)表达水平之间的关系.方法 收集2008至2010年就诊于我院并行肠镜检查的患儿肠道黏膜标本共57份.将标本分为正常对照组(n=16)、IBD缓解期组(n=12)、IBD活动期组(n=13)和非IBD肠炎组(n=16).内镜下取各组患儿末端回肠黏膜标本,采用荧光定量PCR和免疫组化法检测A20、NF-κB、IL-6、IL-8的表达水平.结果 (1)NF-κB、A20在正常对照组肠黏膜中仅微量表达,IBD活动期组和非IBD肠炎组NF-κB、A20表达水平明显高于正常对照组(P均＜0.01);(2)IBD缓解期组较正常对照组NF-κB[(9.35±4.84)%vs(0.57±0.44)%,P＜0.01]、IL-6(t'=1.34,P＞0.05)、IL-8(t=1.38,P＞0.05)表达水平高,而A20在mRNA水平(t=1.03,P＞0.05)和蛋白水平[(0.36±0.18)%vs(0.87±0.29)%,P＜0.01]上表达均偏低;(3)与非IBD肠炎组相比,IBD活动期组NF-κB[(24.17±11.27)%vs(55.29±21.84)%,P＜0.01]、IL-6(t=2.22,P＜0.05)、IL-8(t=2.97,P＜0.01)表达水平明显升高,而A20在mRNA(t=2.26,P＜0.05)和蛋白水平[(29.23±11.70)%vs(16.8l±5.90)%,P＜0.01]上表达均较低;(4)IBD缓解期组与非IBD肠炎组相比,IL-6、IL-8表达水平差异无统计学意义(t'值和t值分别为0.03和0.28,P均＞0.05),而A20在mRNA水平(t=4.42,P＜0.01)和蛋白水平[(29.23±11.70)%vs(0.47±0.25)%,P＜0.01]上表达均较低.结论 IBD患儿存在肠道炎症反应过度而A20表达水平上调不足的现象;A20表达水平的异常可能参与了IBD的发生和发展.
关键词： NF-kappa B 炎性肠疾病 儿童 锌指蛋白A20 -
锌指蛋白A20抑制NF-κB表达对早期脊髓损伤细胞凋亡和脊髓功能恢复的影响
目的 探讨锌指蛋白A20抑制NF -κB表达对早期脊髓损伤的影响.方法 健康雌性C57/BL/6J小鼠随机分成治疗组、对照组和假手术组,建立小鼠脊髓损伤模型,损伤部位即刻应用A20后,采用RT -PCR法和Western blot法检测A20表达的变化,Western blot法检测NF - κB表达的变化；TUNEL法检测脊髓损伤区凋亡细胞数；BMS法评价脊髓功能的恢复.结果 A20治疗后1h,在治疗局部的脊髓组织内即可检测到A20表达,表达呈逐渐增强趋势；而NF - κB表达量相应逐步降低；治疗后1d,损伤区域内的TUNEL(+)细胞数开始减少,治疗后3周,阳性细胞数显著减少.BMS评分在治疗后1周开始改善,在2、3周,显著高于对照组(P＜0.05).结论 A20可以抑制NF - κB的表达,减少脊髓损伤后的细胞凋亡,促进受损脊髓的功能改善.
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多烯磷脂酰胆碱对非酒精性脂肪肝小鼠的干预及其对肝锌指蛋白A20表达的影响
目的 研究多烯磷脂酰胆碱(PPC)对非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠的干预作用及其对肝锌指蛋白A20表达的影响.方法 从30只C57BL/6雄性小鼠中随机选取10只饲喂普通饲料(对照组),20只饲喂甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料用于构建NAFLD模型,并随机分为模型组和实验组,每组10只.实验组灌胃PPC0.1 mL· kg-1,对照组和模型组灌胃生理盐水10 mL·kg-1,每天1次,连续灌服6周.用苏木精-伊红染色(HE)观察小鼠肝组织病理变化,用蛋白质免疫印迹法检测小鼠肝组织锌指蛋白A20表达,用酶联免疫吸附(ELISA)法测定小鼠血清炎症因子水平,用自动生化仪测定小鼠脂代谢水平.结果 模型组和实验组非酒精性脂肪肝活动度评分(NAS)总分分别为(4.72±0.75),(1.43±1.12)分,均明显高于对照组的0分(均P＜0.01),且实验组低于模型组(P＜0.01).蛋白质免疫印迹法检测可见,锌指蛋白A20表达量从高到低依次为模型组、实验组、对照组.模型组小鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-6(IL-6)水平均显著高于对照组(P ＜0.05,P＜0.01).与对照组比较,模型组小鼠血清三酰甘油及游离脂肪酸水平升高,总胆固醇水平降低(P＜0.05或P＜0.01);与模型组比较,实验组三酰甘油升高,总胆固醇水平降低(均P ＜0.05).结论 PPC可有效降NAFLD模型小鼠血清炎症因子水平,改善肝组织形态及脂代谢水平,可能与降低肝锌指蛋白A20表达量,调控其所介导的核因子-KB(NF-κB)炎症反应通路有关.
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灯盏生脉胶囊干预急性进展性脑梗死的前瞻性研究
目的:探讨灯盏生脉胶囊对急性进展性脑梗死(acute progressive cerebral infarction,APCI)的干预作用及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)趋化因子受体1(CX3C-chemokine receptor1,CX3CR1)、锌指蛋白A20表达的变化.方法:将起病7d以内的100例APCI患者分为对照组和试验组,每组各50例患者,所有病例均采用常规治疗,试验组除常规治疗外还给予灯盏生脉胶囊治疗.分别于入院时、病程d7,d14和d30检测两组患者Scandinavian卒中量表评分(Scandinavian stroke scale,SSS)、PBMC CX3CR1及锌指蛋白A20表达的变化;于入院时、病程d30检测两组患者梗死灶体积.结果:对照组病程d7,d14及d30 SSS均明显低于试验组(P<0.05);试验组病程d30梗死灶体积及病程d7,d14及d30PBMC CX3CR1的表达均明显低于对照组(P<0.05).结论:灯盏生脉胶囊可通过下调PBMC CX3CR1的表达而改善其预后.
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卒中后抑郁患者外周血单核细胞趋化因子受体1、锌指蛋白A20的表达及甲状腺功能的改变
目的:研究卒中后抑郁(PSD)患者外周血单核细胞(PBMC)趋化因子受体1(CX3CR1)、锌指蛋白A20表达及甲状腺功能的变化.方法:PSD组为46例PSD患者,对照组为50例同期住院的老年缺血性卒中患者.入院后d14分别检测两组患者的外周血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺素(TSH)浓度及PBMC CX3CR1和锌指蛋白A20表达的变化.结果:对照组外周血清FT3和TSH浓度较PSD组显著升高,差异有统计学显著性(P＜0.05)；PSD组外周血清FT4浓度和PBMCCX3CR1表达较对照组明显升高,差异有统计学显著性(P＜0.05).PSD组汉密尔顿(HAMD)评分与FT4浓度和PBMC CX3CR1表达成显著正相关(P＜0.05),与FT3及TSH浓度成显著负相关(P＜0.05).结论:外周血清FT3,FT4,TSH浓度及PBMC CX3CR1表达与PSD关系密切,可能是老年PSD患者重要的分子标志物.
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锌指蛋白A20对刀豆蛋白A诱导肝损伤的保护作用
[目的]探讨锌指蛋白A20对刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)引起的肝损伤的保护作用.[方法]以刀豆蛋白A诱发小鼠肝损伤,制造肝损伤动物模型,采用尾静脉注射A20表达质粒的方法,观察A20转基因处理组和试验对照组肝组织内TNF-α(tumor necrosis factor α)、IFN-γ (interferon-γ)、IL-2(interleukin 2)细胞因子的表达水平以及肝病理损伤的程度.[结果]A20组ConA处理后肝组织TNF-α、IFN-γ、IL-2等细胞因子的mRNA表达水平及蛋白表达水平均显著低于A20对照组.病理学检查结果提示,A20处理组16h后小鼠肝病理损伤较对照组有减轻(P＜0.05).[结论]A20能够有效抑制ConA引起的小鼠肝组织炎症反应,并减轻肝组织炎症损伤.
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锌指蛋白A20在呼吸系统疾病中的作用
锌指蛋白A20又称肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3),具有抑制核因子κB(NF-κB)炎症和抗凋亡作用,有泛素调节活性及7个特征性的Cys-Cys锌指结构.A20在哮喘、COPD、肺纤维化等呼吸系统疾病的发病机制及免疫调节中扮有重要作用,具备潜在临床应用价值.
关键词： 锌指蛋白A20 肿瘤坏死因子α诱导蛋白3 核因子κB 呼吸系统疾病 -
锌指蛋白A20抑制脂多糖诱导大鼠腹膜间皮细胞NF-κB活化、CD40表达及TNF-α的分泌
目的:探讨锌指蛋白A20(zinc finger protein A20)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)炎症反应的影响.方法:分离及培养RPMCs,将细胞随机分成对照组、LPS组、转染A20组、空载体组.脂质体转染A20质粒(pGEM-T easy-A20)至RPMCs 24 h后分别在LPS刺激不同时间点收获细胞提取蛋白及细胞上清液.用Western blotting 检测细胞A20和IκBα(inhibitor of nuclear factor-κB-α)蛋白的表达;RT-PCR检测CD40和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达;用ELISA法检测培养上清液TNF-α蛋白水平.结果:与LPS组及空载体组相比,转染A20组RPMCs IκBα蛋白无明显降解(P<0.05);CD40、TNF-α mRNA表达及细胞培养上清液TNF-α蛋白水平均明显降低(P<0.05);与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05).结论:A20可抑制LPS诱导的RPMCs核转录因子-κB(NF-κB)活化及炎症反应.
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大鼠颈动脉球囊损伤局部A20基因转染后内皮细胞再生及血管超微结构的影响
目的:锌脂蛋白A20是核因子κB信号系统活化的产物.研究证实核因子κB的激活是球囊损伤动脉后血管狭窄发生的重要机制之一.实验拟脱察锌指蛋白A20对大鼠颈总动脉球囊损伤局部血管内皮再生和血管超微结构的影响.＃方法:实验于2006-03/2007-06在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成.①实验材料:健康雄性SD大鼠42只,体质量350-400g.②分组及实验过程:采用随机数字表法将大鼠分为3组,每组14只.制备A20质粒DNA,建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型(假手术组只进行颈动脉结扎,不进行球囊损伤术);对照组:球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent+TE缓冲液:治疗组:球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent+TE缓冲液+pCAGGS-GFP/A20重组质粒.A20质粒DNA在球囊损伤大鼠颈动脉的局部转染.③实验评估:荧光显微镜观察A20在损伤动脉壁的转染效率;伊文思蓝染色法评估损伤后颈动脉内皮再生情况:透射电镜观察血管超微结构改变.实验过程对动物的处理符合动物论理学标准.结果:①球囊损伤术和A20转染治疗后2周,治疗组再内皮化百分比大于对照组(P＜0.05).②假手术组大鼠颈动脉平滑肌细胞电镜下呈典型的"收缩表型";对照组球囊损伤后3d可见合成型细胞及过渡型细胞,7d血管平滑肌细胞表型发生明显改变,呈典型的"合成表型",治疗组术后7 d可见接近收缩型的血管平滑肌细胞.结论:局部转染A20基因可促进损伤血管内皮再生,抑制损伤处血管平滑肌细胞表型转化.
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RNAi特异性抑制A20基因对H2O2诱导人脐动脉血管平滑肌细胞增殖的影响
背景:锌指蛋白A20是近年来细胞内源性保护机制研究的新靶点,目前研究表明锌指蛋白A20抑制肿瘤坏死因子,脂多糖等多种炎性细胞因子诱导核因子κB信号通路激活所引起的血管平滑肌细胞增殖,但有关A20抗细胞氧化损伤方面的影响报道甚少.目的:观察锌指蛋白A20基因干扰对H2O2诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞增殖和细胞核中核因子κB表达的影响及可能的分子生物学机制.设计、时间及地点:随机对照实验,于2007-03/2008-06在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成.材料:体外培养人脐动脉血管平滑肌细胞,构建针对Genbank中人A20的基因序列,采用脂质体LipofectamineTM2000介导80pmol siRNA,6 μL转染.方法:将培养的第4代人脐动脉血管平滑肌细胞随机分6组,①空白组:培养基培养,未给与任何干预.②A20siRNA组:转染A20siRNA24 h.③scramble siRNA组:转染阴性对照scramble siRNA 24 h.④H2O2组:H2O2持续刺激6 h.⑤H2O2 +A20siRNA组:转染A20siRNA24h后H2O2持续刺激6h.⑥H2O2+scramble siRNA组:转染阴性对照scramble siRNA 24 h后H2O2持续刺激6 h.主要观察指标:以RT-PCR,Western-blotting检测A20基因表达变化,以四甲基偶氮唑蓝方法测定细胞增殖活性,以流式细胞技术观察血管平滑肌细胞细胞周期的变化,以Western-blotting检测细胞核中核因子κB p65的蛋白含量表达.结果:H2O2组细胞增殖率明显高于空白组,但低于H2O2+A20siRNA组(P＜0.05).H2O2组S期、G2/M期构成百分比,增殖指数均较空白组明显升高,然而较H2O2+A20siRNA组明显降低(P＜0.05),空白组A20mRNA与蛋白有微弱表达,A20siRNA组较空白组表达减少(P＜0.05);H2O2组A20mRNA与蛋白表达明显高于空白组但显著低于H2O2+A20siRNA组(P＜0.05)干扰效率大约55%.细胞核中核因子κB p65有少量表达:A20siRNA干扰后核因子κ B p65含量明显增加;H2O2刺激后核因子κ B p65表达含量显著增加但明显低于H2O2+A20siRNA组(P＜0.05).结论:A20基因可抑制H2O2损伤诱导的血管平滑肌细胞的增殖,其分子机制可能通过其负反馈抑制了核因子κ B介导的信号转导途径.
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锌指蛋白A20在胃癌组织中的表达及其与胃癌病理分期和转移的相关性研究
目的 探讨锌指蛋白A20在胃癌组织中的表达及其与临床病理分期和远处转移的关系.方法 收集2009年1-10月在我院手术切除的42例胃癌及癌旁组织标本,用RT-PCR和Westem blotting法分别检测标本中锌指蛋白A20的表达情况.结果 胃癌组织中锌指蛋白A20的表达低于癌旁正常组织,Ⅲ期+Ⅳ期胃癌组织锌指蛋白A20的表达显著低于Ⅰ期+Ⅱ期胃癌组织(P＜0.05).肿瘤细胞的分化程度与锌指蛋白A20的表达水平呈负相关,有远处转移的胃癌组织中锌指蛋白A20的表达显著低于无远处转移的组织(P＜0.05),有淋巴转移的胃癌组织中锌指蛋白A20的表达显著低于无转移的组织(P＜0.05).但是锌指蛋白A20的表达水平与患者的年龄、性别没有相关性.结论 锌指蛋白A20在胃癌组织中表达降低,A20的表达水平与胃癌细胞的恶性程度、分期、远处转移、淋巴转移有关.
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金钗石斛多糖上调锌指蛋白A20表达减轻大鼠缺血性脑损伤
目的 观察金钗石斛多糖调控锌指蛋白A20表达抑制NF-κB信号通路减轻大鼠缺血-再灌注脑损伤的作用机制.方法 SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血-再灌注模型组、金钗石斛多糖治疗组(200 mg/kg)、金钗石斛多糖治疗+A20沉默组和金钗石斛多糖治疗+空病毒载体组.建立局灶性脑缺血-再灌注模型,观察金钗石斛多糖对锌指蛋白A20 mRNA和蛋白表达的影响.比较各组大鼠神经功能评分和脑梗死体积,检测磷酸化IKKβ蛋白和胞核p65蛋白的表达量.结果 分别从再灌注6 h和12 h开始,金钗石斛多糖治疗组大鼠脑组织A20 mRNA和蛋白水平均较脑缺血-再灌注模型组明显增高(均P<0.01).同脑缺血-再灌注模型组相比,金钗石斛多糖治疗组大鼠神经功能评分明显改善(P<0.001),脑梗死体积明显减小(P<0.01),脑组织磷酸化IKKβ和胞浆p65表达水平均明显下降(分别为P<0.001,P<0.01);而A20沉默则逆转了金钗石斛多糖上述治疗效果,各项指标均明显恶化(均P<0.01).结论 金钗石斛多糖通过上调锌指蛋白A20表达抑制NF-κB信号通路减轻大鼠缺血性脑损伤.
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RNAi特异性抑制A20基因对H2O2诱导的HUASMC细胞表型的影响
目的:通过采用锌指蛋白A20基因干扰技术观察其对H2O2诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞(HUASMC)超微结构影响,以初步研究锌指蛋白A20在氧化还原方面对细胞的保护作用.方法:将培养的人脐动脉血管平滑肌细胞随机分六组,空白组;A20siRNA组;scramble siRNA组;H2O2组;H2O2+A20siRNA组;H2O2+scramble siRNA,采用RT-PCR,Western-blotting方法观察A20基因表达变化,应用透射电镜观察细胞超微结构改变.结果:空白组A20mRNA与蛋白有微弱表达,A20siRNA组较空白组表达减少(P＜0.05);H2O2组A20mRNA与蛋白表达明显高于空白组但显著低于H2O2+A20siRNA组(P＜0.05)干扰效率大约55%.空白组平滑肌细胞(VSMC)电镜下呈典型的"收缩表型";H2O2组VSMC表型发生明显改变,呈"合成表型"H2O2+A20siRNA组成典型的合成表型且肌丝明显减少,细胞器及分泌物增多.结论:A20基因可以抑制H2O2损伤诱导的血管平滑肌细胞表型转化.
关键词： H2O2 锌指蛋白A20 基因干扰 人脐动脉血管平滑肌细胞 超微结构 -
游离脂肪酸诱导肝细胞脂肪变模型中锌指蛋白A20的表达及其作用机制
背景:肝内脂肪酸蓄积是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发生的基础,炎症是促其发展的关键.锌指蛋白A20可通过抑制NF-κB信号通路而发挥抗炎功能,但其对NAFLD作用的研究未见.姜黄素具有明确的抗炎作用.目的:探讨游离脂肪酸(FFAs)诱导的肝细胞脂肪变模型中A20的表达及其对NAFLD的作用机制.方法:以不同浓度混合FFAs(油酸∶软脂酸=2∶1)诱导HepG2细胞脂肪变模型,MTS法测定细胞活力,行油红O染色鉴定,筛选出佳造模浓度.蛋白质印迹法检测A20表达.以不同浓度姜黄素干预肝细胞脂肪变性模型,采用蛋白质印迹法检测A20表达,ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β含量.结果:成功建立HepG2肝细胞脂肪变模型,选择0.25 mmol/L FFAs作为佳造模浓度.随着FFAs浓度增高,A20表达在6h呈增加趋势,而12 h、24h时A20表达呈先减少后增加的趋势,0.5 mmol/L是分界点.与0.25 mmol/L FFAs组相比,20 μmol/L姜黄素干预可显著抑制A20表达,细胞上清中TNF-α、IL-1β含量显著减少(P＜0.05).结论:锌指蛋白A20可能通过抑制NF-κB信号通路激活来抑制炎症的发生,从而发挥保护肝细胞的作用,为防治NAFLD提供了可能的有效作用靶点.
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非酒精性脂肪性肝病小鼠肝锌指蛋白A20的表达与多烯磷脂酰胆碱的干预效果
目的 探讨非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)锌指蛋白A20的表达与多烯磷脂酰胆碱(PPC)对NAFLD的影响.方法 以10、20、40、80、160μmol/L PPC预处理HepG2细胞后24 h,联合0.25 mmol/L游离脂肪酸(FFA)共同孵育24 h,同时设立空白组和0.25 mmol/L FFA组.将28只6周龄、雄性C57BL/6小鼠分为野生组(8只)、甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)组(10只)、PPC组(10只).野生组常规饲养,MCD与PPC组予MCD饲养,PPC组同时予PPC灌胃.饲养6周处死,采血并取肝脏组织检测HepG2细胞、肝组织锌指蛋白A20的表达与血清生物化学、脂代谢指标和相关炎性因子水平.统计学比较采用两样本均数t检验和Kruskal-Wallis检验.结果 与空白组相比,0.25 mmol/L FFA组HepG2细胞锌指蛋白A20表达增强[(5.03±0.12)％比(25.75±0.47)％],差异有统计学意义(t=73.19,P＜0.01),TG、IL-8含量增加[分别为(0.08±0.00) mmol/L比(0.41±0.01) mmol/L;(41.90±1.60) pg/mL比(55.51±1.07) pg/mL],差异均有统计学意义(t=40.67、12.25,P均＜0.01).与0.25 mmol/L FFA组相比,0.25 mmol/L FFA联合40 μmol/L PPC时,HepG2细胞锌指蛋白A20表达[(35.39±0.54)％]开始增强(t=23.25,P＜0.01);联合80、160μmol/L PPC时HepG2细胞内TG[分别为(0.18±0.01)、(0.13±0.01) mmol/L,t=27.36、33.97]、IL-8[分别为(10.62±0.50)、(9.53±0.36) pg/mL,t=66.10、70.63]表达均下降,差异均有统计学意义(P均＜0.01).MCD组和PPC组小鼠肝组织内锌指蛋白A20表达呈双条带,表达均较野生组增强[分别为(2.10±0.43)％、(1.56±0.96)％、(0.89±0.55)％],差异有统计学意义(t=5.20、2.55,P均＜0.05);病理见脂肪变、气球样变、小叶炎性反应.与MCD组相比,PPC组锌指蛋白A20表达减弱,差异有统计学意义(t=2.63,P＜0.05);病理见脂肪变、小叶炎性反应、肝细胞坏死减轻.与野生组小鼠相比,MCD组血ALT[(44.05±12.46) U/L比(126.93±52.73) U/L]、AST[(138.46±43.49) U/L比(276.14±134.88) U/L]和肝内FFA[(1.04±0.33) mmol/L比(1.60±0.32) mmol/L]、肝内TG[(0.40±0.12) mmol/L比(0.87±0.41) mmol/L]水平较高,差异均有统计学意义(t=4.81、3.04、3.65、3.39,P均＜0.05),血TG[(0.44±0.16) mmol/L比(0.10±0.04) mmol/L]和TC[(2.11±0.19) mmol/L比(0.61±0.12) mmol/L]水平较低,差异均有统计学意义(t=5.94、20.45,P均＜0.01).与MCD组相比,PPC组血FFA[(0.77±0.34) mmol/L比(0.42±0.19) mmol/L]和ALT[(126.93±52.73) U/L比(79.27±70.74) U/L]水平较低(t=2.89、2.71,P均＜0.05),肝内TC[(0.67±0.10) mmol/L比(0.94±0.22)mmol/L]和血TC[(0.61±0.12) mmol/L比(1.69±0.25)mrnol/L]水平较高(t=3.41、12.08,P均＜0.01),其余指标比较差异均无统计学意义(P均＞0.05).野生组、MCD、PPT组血炎性因子比较差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 PPC能改善肝内脂肪变和炎性反应,锌指蛋白A20可能是NAFLD防治的作用靶点之一.
