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局部应用重组水蛭素对脑出血模型大鼠血肿周边组织损伤的干预作用
目的探讨脑出血后局部应用凝血酶特异抑制剂--重组水蛭素治疗血肿周边组织损伤的价值和治疗时间窗.方法采用自体血注入方法建立大鼠脑出血模型,分别于50μl自体血注入同时、3h后以及9h后血肿内给予10U重组水蛭素干预,术后72h记录大鼠神经功能缺损评分(neurological deficit score,NDS),检测血肿周边组织髓过氧化物酶(MPO)的活性、脑水含量及TUNEL阳性细胞数量的变化,并通过检测血红蛋白含量评价水蛭素对血肿容量的影响.结果脑出血同时及3h后给予水蛭素可显著减轻大鼠神经功能缺损,降低局部MPO活性、减少脑水含量及TUNEL阳性细胞数量,9h后给予水蛭素仍可减轻局部组织脑水含量.与出血组比较,局部应用水蛭素未导致血肿红蛋白含量增加.结论脑出血后早期(9h内)局部应用水蛭素可减轻血肿周边组织的白细胞浸润、脑水肿和细胞死亡,且无明显再出血副作用,抗凝血酶治疗有可能成为防治出血性脑损伤的有效措施之一.
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重组水蛭素对EAE小鼠脑组织MMP-9表达和NO含量影响的研究
目的 探讨重组水蛭素(Recombinant hirudin)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脑组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达和一氧化氮(NO)含量的影响.方法 48只雌性C57BL/6小鼠随机平均分为3组,EAE组运用MOG35-55构建EAE小鼠模型,CFA组由生理盐水代替MOG35-55构建模型,水蛭素组在EAE基础上给予重组水蛭素腹腔注射,CFA组、EAE组给予生理盐水腹腔注射.HE染色和LBF染色观察炎症及脱髓鞘情况,免疫组化检测MMP-9表达,ELLISA检测小鼠脑组织中NO含量,RT-PCR检测MMP-9和诱导型一氧化氮合酶(iN-OS) mRNA表达.结果 水蛭素组小鼠临床症状、炎症及脱髓鞘程度减轻,与EAE组间的差异有统计学意义(P＜0.05).水蛭素组小鼠脑组织MMP-9蛋白表达和NO含量与EAE组间差异有统计学意义(P＜0.05),重组水蛭素组小鼠脑组织iNOS mRNA和MMP-9 mRNA表达与EAE组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组水蛭素缓解EAE临床症状机制之一可能与抑制EAE小鼠脑组织中MMP-9和iNOS mRNA表达,从而减少MMP-9和NO含量有关.
关键词： 多发性硬化 实验性自身免疫性脑脊髓炎 重组水蛭素 一氧化氮 基质金属蛋白酶-9 -
重组水蛭素抗大鼠静脉血栓形成的实验研究
目的探讨重组水蛭素(rH)抗大鼠静脉血栓形成作用.方法应用Reyers法将大鼠随机分为7组,各组分别自舌静脉注入不同药物或同一药物不同剂量,结扎下腔静脉后6 h,观察血栓形成和血栓干重,并进行统计比较.结果随rH剂量增加,血栓形成和血栓干重呈下降趋势,与正常对照组比较,具有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05).结论rH具有较强的抗静脉血栓形成作用.
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水蛭素及重组水蛭素的应用研究概况
水蛭素及重组水蛭素具有抗凝血、抗肿瘤、降血脂等多种药理活性,临床上用于治疗多种疾病.现综述近年来水蛭素及重组水蛭素在心血管系统疾病、脑血管系统疾病等方面的临床应用及其药代动力学和不良反应,指出水蛭素及重组水蛭素具有广泛的发展前景.
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重组水蛭素研究进展
水蛭素是医用水蛭的唾液腺分泌的一种多肽,一般由65～66个氨基酸组成,是迄今发现的活性强的特异性凝血酶抑制剂.本文介绍了重组水蛭素的表达、分离和纯化的研究进展,并展望了重组水蛭素的应用前景.
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水蛭素明胶微球的制备及体外释放的考察
目的:制备重组水蛭素(rHV2)明胶微球,达到减少胃肠道对其降解和破坏的目的.方法:采用明胶为载体材料,用注入法制成重组水蛭素(rHV2)明胶微球,并考察微球形态、粒径和体外释放情况.结果:制成的明胶微球平均粒径为54.40μm,三批微球的rHV2含量为(2.60±0.05)mg,载药量为(2.67±0.05)mg,包封率为(54.60±1.09)%.三种不同固化时间制备的rHV2明胶微球体外释放试验情况一致,30 min释放量能达到50%,60 min能达到80%以上.结论:结果显示制备的重组水蛭素明胶微球基本达到要求.
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共同担起摘除"肝炎大国"帽子的重任
大连汉信(原大连高新)生物制药有限公司是专业从事人用疫苗研发及生产的高科技生物制药企业.公司围绕着先进的基因工程技术平台和病毒免疫等学科方向,先后承担了国家"863"重点攻关项目"重组(汉逊酵母)乙肝疫苗"、"重组戊肝疫苗";国家"九五"重点攻关项目"重组水蛭素"等的研发工作.
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重组水蛭素抗弥散性血管内凝血的药效学实验研究
目的:研究重组水蛭素(recombinant hirudin,rH)的抗弥散性血管内凝血(DIC)的作用.方法:♂大耳白兔,采用凝血酶(100 U·kg-1·1 h)和氨基已酸(50 mg·kg-1·h-1×1 h)静脉滴注造成急性DIC模型,观察rH对凝血酶原时间(PT)、血小板计数(PLT)、纤维蛋白原(FIB)含量和血浆鱼精蛋白副凝固(3P)试验以及肺、肾微血栓形成的影响.结果:4个剂量的rH(125、62.5、31.25和15.625μg·kg-1)对于DIC的抑制率:用PT表示分别为89.38%、52.60%、49.71%和25.58%;用PLT表示分别为100.01%、61.86%、58.40%和32.68%;用FIB表示分别为85.22%、73.01%、33.60%和14.86%.各剂量组的肺、肾病理切片均未见微血栓形成.当rH剂量为125μg·kg-1时,试验中各项指标均与生理盐水空白对照组一致.结论:国产rH具有强大的抗DIC作用,其作用强度与已被欧共体批准上市的产品重组水蛭素Reflu-dan相同.
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重组水蛭素治疗急性冠脉综合征的研究
重组水蛭素为直接凝血酶抑制剂,本文综述了其分子生物学和药理学特性、作用机理及其在急性冠脉综合征中的应用进展.
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重组水蛭素治疗兔弥散性血管内凝血
目的:观察重组水蛭素对治疗脂多糖致兔弥散性血管内凝血模型的抗凝疗效.方法:建立兔脂多糖弥散性血管内凝血模型,18只新西兰大白兔随机分为3组,静脉注射脂多糖的同时分别予生理盐水、普通肝素和重组水蛭素,于注射脂多糖前,注射后2,4,6 h检测血小板计数、活化部分凝血活酶时间、抗凝血酶Ⅲ、纤维蛋白原、血清纤维蛋白降解产物(FDP);并观察心、肺脏器的病理变化.结果:模型组兔活化部分凝血活酶时间明显延长,血小板计数和纤维蛋白原显著降低,抗凝血酶Ⅲ活性明显下降,与肝素组相比重组水蛭素组血小板和纤维蛋白原消耗减少,抗凝血酶Ⅲ活性下降程度减轻.所有实验动物血清FDP变化无统计学差异.病理检查模型组心、肝、肺、肾、脾脏可见微血栓形成,重组水蛭素组均未见微血栓形成.结论:重组水蛭素具有明显的抗凝作用,可有效治疗弥散性血管内凝血.
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重组水蛭素对恒河猴长期毒性研究
目的:观察连续静注重组水蛭素 30 d对恒河猴的长期毒性.方法:健康雌雄恒河猴分别按体质量随机分为低、中、高剂量组(1.0、3.0和6.0 mg/kg)和空白对照组.连续30 d静注给药.末次给药后处死一半动物做病理解剖,另一半停药后继续观察15 d.观察和检测项目包括:(1)一般症状; (2)心电图; (3)凝血时间(CT)等血液学指标; (4) 凝血酶时间(TT)、部分凝血活酶时间(aPTT)等血液生化指标; (5)尿液检查; (6) 抗体测定; (7) 骨髓检查; (8)病理检查.结果:动物连续给药后,d15及d30给药后30 min采集的血样中,与d0或空白对照组相比,高、中、低剂量组的CT、TT、aPTT明显延长,且有量效关系.d15及d30给药后24 h及d45采集的血样中,上述指标恢复正常.d30及d45病理组织学检查发现每组均有部分动物出现肝、肾淤血,轻度细胞水肿,可能系动物的隐性感染而非药物所致.d30各组均可见部分动物注射部位皮肤出现小灶性出血和局部炎症反应,d45注射部位病理变化消失.其余观察指标未见明显异常.结论:重组水蛭素对猴血液系统有一定的药理毒理作用,主要表现为使高、中、低剂量组猴CT、TT、aPTT时间延长,且有量效关系.因此,重组水蛭素对猴药理毒理作用的靶器官为血液系统,其作用均是可逆的.重组水蛭素对猴的安全剂量为1.0 mg/kg.临床使用时应密切注意重组水蛭素对血液系统的影响.
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乳酸菌表达的重组水蛭素的壳聚糖微粒的口服药效学研究
通过测定小鼠的出血时间(BT)和活化部分凝血活酶时间(AP TT),验证乳酸菌表达的重组水蛭素Ⅲ壳聚糖微粒的口服药效学.重组水蛭素样品是由乳酸菌在摇瓶水平30℃静置培养表达的.它的表达是由乳链菌肽诱导的,且表达的蛋白的量受其调控.水蛭素只经过阴离子交换树脂纯化浓缩.后浓缩的水蛭素样品制成壳聚糖-TPP微粒.30只小鼠,雌雄各半,被随机分为3组:对照组(生理盐水),水蛭素组(500 ATU/kg),阿司匹林组(20 mg/kg).给小鼠灌胃给药后,以剪尾法测定小鼠出血时间,以小鼠毛细管眼眶取血法测定活化部分凝血活酶时间.结果显示给药组与对照组的BT值和APTT值均有显著差异.乳酸菌NICE表达系统分泌表达的重组水蛭素,以壳聚糖-TPP微粒口服制剂口服给药后,证实其口服有效.
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重组水蛭素Ⅲ的质量控制标准研究
通过测定重组水蛭素Ⅲ的质粒中目的基因序列、重组水蛭素Ⅲ分子质量、C末端序列以及菌体蛋白和DNA残留量,对重组水蛭素Ⅲ的质量进行研究.结果:重组质粒经Nhe Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切和基因序列测定,表明工程菌所携带的质粒上含有完整的信号肽基因、Nhe Ⅰ酶切位点、水蛭素HV3基因和HindⅢ酶切位点;还原性SDS-PAGE结果表明在14 000 u处有单一条带,为重组水蛭素Ⅲ二聚体;测定样品分子C端序列为E-D-Y-A-D-E-P-I-P-E-F,与重组水蛭素Ⅲ的理论值一致;重组水蛭素Ⅲ样品中的残留菌体蛋白和DNA含量分别是0.02%和每剂量样品中残留DNA含量低于2.8 ng.结论:从基因水平、蛋白水平和杂质的角度证明重组水蛭素Ⅲ产品符合质量控制标准.
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重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定性考察
研究基因工程菌E.coli ASl. 357在LB培养基中传代50代过程中菌种的稳定性.以菌体和菌落的形态、质粒稳定性(ST)、质粒酶切图谱和水蛭素的表达量以及比活等方面进行考察,以评价工程菌的稳定性.重组水蛭素Ⅲ工程菌在传代50代的过程中质粒稳定性高,传代10代内质粒稳定性(ST)为98%,且表达稳定,表达产物可达发酵液可溶性蛋白总量的60%,产物的抗凝血酶活力大于2.0×103ATU/ml,传代50代的菌体与菌落呈典型的大肠杆菌形态.重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定.
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重组水蛭素的表达纯化及活性检测方法进展
作为直接凝血酶抑制剂,重组水蛭素在临床上的应用已越来越重要.文章综述了重组水蛭素的表达、分离纯化及其理化性质和活性检测方法的进展.
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水蛭素及其衍生物研究进展及展望
天然水蛭素是含有65-66个氨基酸残基的无糖基化单链多肽,分子质量约为7 000 u,由医用水蛭的唾液中分离得到,是凝血酶的特异性抑制剂,在临床治疗血栓疾病中有着重要意义.近年来多种水蛭素的衍生物被成功的开发出来,本文就重组水蛭素的研究进展进行了综述,并对其应用前景进行了展望.
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BAEE法测定重组水蛭素的生物活性
目的 建立重组水蛭素的生物活性测定方法. 方法 用BAEE(N.苯甲酰-L-精氨酸乙酯)作底物,通过测定反应体系中未被水蛭素抑制的凝血酶的量,来间接测定水蛭素抗凝血酶的活力. 结果 重组水蛭素的生物活性测定曲线在3.2～12.8 ATU之间线性关系良好,回归方程为Y=-0.034 8 X+0.7,r=0.999 3. 结论 BAEE法经济、便捷、准确可靠、重现性好,适宜作为该品种的生物活性测定方法.
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重组水蛭素对Beagle犬凝血功能的影响
目的观察重组水蛭素对Beagle犬凝血功能的影响.方法 Beagle犬缓慢静脉注射不同剂量重组水蛭素[6、18、54 mg/(kg*d)],连续14 d,观察其凝血功能的变化.结果用药组犬皮下有血肿,活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间明显延长,但凝血酶原时间无明显变化,高剂量组的血小板聚集率有升高趋势,光镜下观察脾脏等实质脏器有出血灶.结论重组水蛭素抑制内源性凝血系统,引起呈剂量依赖性多个脏器不同程度的出血.
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重组水蛭素的临床应用及实验室监测
水蛭素是作用很强的凝血酶特性抑制剂,具有抗凝、抗血栓等药理作用.重组水蛭素是国内外正在开发的新一代高效特异性抗凝、抗栓药物.此文概述了重组水蛭素在急性冠状综合征、溶栓疗法、深静脉血栓治疗等中的临床应用及其实验室监测,为我国重组水蛭素的开发及其临床研究提供参考.
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局部应用重组水蛭素治疗脑出血后脑水肿的实验研究
目的探讨局部应用凝血酶特异性抑制剂(重组水蛭素)治疗脑出血后保护机制.方法成年雄性SD大鼠随机分为生理盐水组、脑出血组和水蛭素组(出血后3 h).以50 μl自体血注入大鼠尾状核方法建立脑出血模型,应用干-湿重法观察脑水肿变化,前肢放置实验观察行为学.每组每时相点(1、2、3、7、14、28天)各6只大鼠.结果脑出血组和水蛭素组脑含水量与生理盐水组在24 h、48 h、72 h比较P<0.05,7 天时各组间无明显差异(P>0.05);脑出血组大鼠前肢放置实验结果与生理盐水组比较(P<0.05),水蛭素组与脑出血组比较P<0.05.结论脑出血后24～48 h水肿达高峰;重组水蛭素可明显减轻脑水肿,同时可以改善脑出血后的神经功能缺损.
