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鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶制备及其生物相容性
目的 研究狭鳕鱼皮胶原蛋白肽-透明质酸复合水凝胶的制备方法,并观察该凝胶对体外培养的人脐带间充质干细胞生物学特性的影响.方法 用甲基丙烯酸酐与鱼胶原蛋白肽和透明质酸合成光交联材料,制备凝胶包埋人脐带间充质干细胞进行三维培养.采用二乙酸荧光素染色检测凝胶内细胞的存活情况,采用EdU染色和MTT法检测细胞的增殖情况,采用免疫荧光染色检测细胞形态.结果 凝胶中的人脐带间充质干细胞存活、生长良好.与贴壁生长相比,凝胶中三维培养的细胞形态呈现球形,具有较为平稳的生长速度和更为持久的增殖趋势.结论 鱼胶原蛋白肽-透明质酸复合水凝胶能够满足细胞包埋的需要,具有应用于组织工程各领域的潜力.
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组织工程骨软骨复合体修复羊膝关节骨软骨缺损效果
目的 探讨体外构建的组织工程骨软骨复合体修复羊膝关节骨软骨复合缺损的效果.方法 在自行设计制造的双腔搅拌式生物反应器内,对复合于β-磷酸三钙(β-TCP)支架材料上的羊骨髓间充质干细胞(MSCs)同时进行成骨和成软骨诱导,构建骨软骨复合体.模仿马赛克骨软骨移植术用构建的复合体修复实验组羊膝关节骨软骨复合缺损,对照组使用单纯β-TCP支架修复缺损.术后12周对修复关节进行大体、X线和Ⅱ型胶原免疫组化检查.结果 X线检查显示实验组植入物降解快速,与周围骨质融合好;大体观察见实验组修复软骨颜色和质地与周围正常软骨相似,关节面平整,而对照组修复区可见明显凹陷,有部分软骨样组织;Ⅱ型胶原免疫组化检查显示实验组修复区软骨染色强,胶原纤维整齐.结论 利用自行设计制造的双腔搅拌式生物反应器体外构建的骨软骨复合体可有效修复羊膝关节骨软骨复合缺损.
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新型纳米支架并MSCs修复兔桡骨缺损影像学观察
目的 采用富含血小板血浆(PRP)的新型纳米活性组织工程支架复合骨髓基质干细胞(MSCs)修复兔桡骨中段骨-骨膜缺损,通过影像学手段评价其成骨能力.方法 取健康成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组(A组,8只)、对照组(B组,8只)和空白组(C组,4只).建立双侧桡骨骨缺损模型.A组将PRP纳米支架与MSCs在体外复合培养后植入兔的骨缺损中,B组将PRP纳米支架植入骨缺损处,C组不植入任何材料.分别于术后4、8、12周通过大体观察、X线检查及影像学评分等方法观察骨缺损修复情况.结果 A组复合材料有良好的诱导成骨能力,治疗4周即有明显的成骨反应和新骨形成,治疗12周基本修复骨缺损;B组修复能力较A组差;但A、B组均优于C组.A组和B组对工程支架无明显异物反应.结论 新型纳米活性组织工程支架是修复兔骨缺损的良好移植材料,复合MSCs后能促进骨缺损的修复.
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MSCs和PRP碳纳米管复合修复兔桡骨骨缺损的研究
目的 研究骨髓基质干细胞(MSCs)和富含血小板血浆(PRP)的碳纳米管复合修复骨缺损的能力.方法 将54只兔制备成双侧桡骨15 mm骨缺损模型,根据植入的材料不同分为3组.实验组植入MSCs/PRP/碳纳米管支架,对照组植入PRP/碳纳米管支架,空白组不植入任何材料.术后4、8及12周各组分别处死6只兔,通过大体观察、扫描电镜检查、组织学观察评价修复大块骨缺损的效果.结果 实验组新生骨组织占缺损面积的百分比明显高于对照组和空白组,差异有统计学意义(F=3.56,P＜0.05);且随着时间的增加各组新生骨组织占缺损面积的百分比显著增加(F=77.67,P＜0.05).结论 与PRP/碳纳米管相比,MSCs/PRP/碳纳米管修复骨缺损能力更强,成骨更迅速.
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半月板损伤修复的研究进展
半月板损伤是膝关节常见的疾病,治疗方案由初的半月板全切或全次切除术到目前的保留半月板;手术修复方式主要有由外向内、由内向外和全内缝合3种.组织工程技术和半月板移植术适用于半月板无血供区和复杂性损伤无法修复者.本文就半月板的结构功能、手术修复方式、修复材料及半月板移植和组织工程技术等方面作—综述.
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软骨细胞对滑膜间充质干细胞诱导分化的影响
目的 明确软骨细胞对滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells,SMSCs)向软骨细胞诱导分化情况的影响. 方法 (1)消化分离原代软骨细胞和SMSCs,测定细胞存活率、计数并传代培养.显微镜下观察各代软骨细胞和SMSCs生长情况,并对软骨细胞和SMSCs进行类别鉴定.(2)取第1代兔软骨细胞和第3代SMSCs共培养,第3代SMSCs单独培养作为对照组.(3)5d、10 d后分别对SMSCs进行免疫荧光、免疫组化和流式细胞仪检测,通过观察SMSCs对Ⅱ型胶原的表达情况,了解软骨细胞诱导SMSCs向软骨细胞分化的影响. 结果 (1)原代软骨细胞刚分离初为卵圆形,贴壁后呈三角形或梭形.每100 mg软骨组织可分离出原代软骨细胞为3～5×105个,细胞存活率为90.0％.甲苯胺蓝染色后细胞质内可见散在蓝紫色异染颗粒.(2)原代滑膜细胞刚分离初为圆形,贴壁生长后可见少量较大卵圆形细胞和较多梭形细胞,传代后几乎都为梭形.每100 mg滑膜组织可分离出原代滑膜细胞为1～2×106个.SMSCs表面抗原CD68、CD90和CD105检测阳性率分别为0.5％、92.5％和90.7％.(3)对SMSCs的免疫组化、检测显示,与第1代软骨细胞共培养5d、10d后的第3代SMSCs对于Ⅱ型胶原的表达阳性率比单一生长的第3代SMSCs要高.(4)对SMSCs的流式细胞仪检测显示,与第1代软骨细胞共培养5d、10d后的第3代SMSCs对于Ⅱ型胶原的表达阳性率比单一生长的第3代SMSCs要高,并与免疫组化、检测的结果相吻合.结论 与第1代软骨细胞共培养的SMSCs对Ⅱ型胶原表达持上升,出现向软骨细胞分化的现象.软骨细胞能较好地诱导SMSCs向软骨细胞分化.
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软骨组织工程种子细胞源的研究进展
关节软骨缺损的发病率较高，患者生活质量受到严重影响，传统治疗方式疗效不理想。组织工程技术在临床应用方面进行了初步尝试，为临床软骨缺损修复提供了新的思路与途径。现就组织工程种子细胞的研究进展进行综述。
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干细胞治疗现状、策略与前景展望
当代医学已从分子治疗向细胞治疗过渡.干细胞治疗对一些重大疾病(糖尿病、中风、心肌梗死、肿瘤等)具有明显疗效,但是现有干细胞治疗方法还存在一些问题.缺乏统一的干细胞分类和鉴定方法以及干细胞制剂质量标准;质量合格的干细胞制剂数量不足;干细胞制剂具有适应证和禁忌证;干细胞治疗需要筛选患者,进行长期随访;此外,近年来干细胞研究和应用还发现其他一些问题,如依赖现象、违规治疗现象等.针对这些问题,提出了一些解决方法和应对策略.未来,随着干细胞治疗管理模式的转变,细胞水平的治疗将向组织水平的治疗发展.通过干细胞技术和组织工程技术融合发展起来的原位治疗,将是干细胞治疗发展的重要方向.利用干细胞活性成分(细胞因子等)或亚单位(囊泡或外泌体)进行治疗,是今后干细胞治疗发展的另一个方向.
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成体干细胞在神经组织工程中的研究及应用
组织工程学的基本原理是应用细胞生物学和工程学的原理,将体外培养扩增后具有生物学活力及特定功能的细胞与支架材料复合,用以修复或改善损伤组织或器官的结构与功能,终形成有活力的正常组织或器官,达到真正意义上的生物学重建[1].干细胞是机体存在的一类特殊细胞,他们的显著的生物学特性是既有自我更新的能力又具有多向分化的潜能,在适当条件下可被诱导分化为不同的细胞和组织.干细胞按其发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类.虽然胚胎干细胞更具有全能性,理论上可生成任何组织,但胚胎干细胞诱导分化的细胞和组织若用于病人的细胞和组织替代性治疗,相当于异体移植,存在免疫排斥的问题,而且胚胎干细胞能否分化为肿瘤样的组织,尚是个未知数[2].而成体干细胞来源广泛,而且不涉及伦理问题,成体干细胞与胚胎干细胞相比更具有优势.本文结合近年来国内外对成体干细胞即骨髓间充质干细胞、神经干细胞等在神经组织工程中的研究,着重对研究的现状及面临的问题和未来发展趋势进行综述.
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组织工程骨血管化机理及策略的研究进展
1前言组织工程学是应用生命科学和工程学的原理和方法,研究、开发用于修复、增进或改善人体各种组织或器官损伤后功能和形态的生物替代品的一门新兴科学.于19世纪80年代兴起,由Langer和Vacanti首先提出[1],尽管起步较晚,却已成为生命科学中的一大热门研究.但近期的一项调查结果显示[2]组织工程在"缩水".有人通过对全球知名组织工程科研机构的非连续4年的相关数据做了比较:自2000年以后,每年减少20%的资金投入.在皮肤、软骨以及其他一些较成熟的组织工程上市产品使用量每年减少50%,至2002年投资减少了90%.2002年末,美国有20项组织工程产品申报临床实验,4项获准,无一获利.调查还显示干细胞的研究规模增长了42%.究其原因可能与全球经济下滑有直接关系,同时也给组织工程人一个警示:不能在研究结果不十分成熟的情况下盲目乐观.初组织工程的三要素为组织工程材料、细胞外基质和靶细胞.作者通过收集、研究近几年的相关文献,认为当今的组织工程人越来越注重"根基性"的研究:组织工程化组织、器官的血管化.
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成年鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养的实验研究
目的 探讨从成年鼠坐骨神经分离培养获得大量雪旺细胞的有效手段.方法 取SD大鼠双侧预变性的坐骨神经,预变性后,剪碎至1mm3大小的组织块,单酶消化法进行分离培养,Geneticin液抑制成纤维细胞生长,低浓度酶快速消化传代进一步纯化雪旺细胞,通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了雪旺细胞增值和纯化程度.结果 通过上述方法分离培养获得了经S-100蛋白鉴定纯度为85%的第三代雪旺细胞,细胞数量为2.764×107/ml,细胞形态多数为梭形.结论 本方法可从大鼠预变性的坐骨神经获得形态与活力良好的雪旺细胞.
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经脂肪源性干细胞诱导的施万样细胞用于组织工程化人工神经的实验研究
目的 研究经大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs)体外诱导分化的施万样细胞应用于组织工程化外周神经,修复大鼠坐骨神经缺损的效果.方法 Wistar大鼠48只,体重200～250g,随机分成3组,每组16只,分别用下面3种不同的方法修复15 mm坐骨神经缺损:DMEM组(支架内注射培养基)、诱导组(支架内注射施万样细胞)和自体神经移植组.通过足迹实验(坐骨神经功能指数测定)、神经电生理检测、胫前肌湿重比率测定进行功能检测;应用透射电镜、图像分析系统进行组织学观察.结果 术后12周诱导组的SFI指数、神经传导速度、潜伏期、波幅以及胫前肌重量恢复、神经纤维数目、轴突直径、髓鞘厚度好于DMEM组(P＜0.05),接近自体移植组、再生神经中标记细胞观察显示PKH-26标记的ADSCs,依然呈红色荧光.结论 ADSCs诱导分化后的施万样细胞与去细胞同种异体神经两者构建的组织工程化神经能有效地修复大鼠坐骨神经缺损,其效果与自体神经移植相似;ADSCs经诱导后的细胞可以作为组织工程种子细胞新的来源.
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猕猴去细胞同种异体神经体内移植的组织学观察
目的 观察去细胞同种异体神经体内移植后组织形态学改变,寻找合适的人工神经支架材料.方法 共使用成年猕猴9只,随机取其中的6只,培养自体Scs,应用已经制备好的去细胞神经为支架材料,体外构建组织工程化周围神经移植体修复猕猴尺神经40mm缺损.分实验组、空白组、正常对照组3组.术后5个月取材,观察大体形态、HE染色、免疫组织化学染色及组织形态学改变.结果 3组移植物表面均有不同程度的血管化,HE染色均有细胞核和髓鞘的蓝染成份出现,NF免疫组织化学染色后,均有淡黄色神经微丝出现.实验组、正常对照组效果相似,它们均优于空白组、实验组,正常对照组再生神经纤维的数量差异均无统计学意义(P>0.05).但在实验组与空白组间的差异有统计学意义(P<0.05).结论 去细胞同种异体神经具有良好的生物相容性和促进神经再生能力,是具应用前景的神经修复材料之一.
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组织改造
外科技术和移植免疫学理论的进展为器官及组织移植建立了良好的基础.虽然器官移植已是移植的主要焦点,但在挽救生命和功能重建方面还有许多项目要做.对器官移植远期功能改善所做的努力使得由于免疫因素导致的发病率和死亡率减少,然而可用于移植的器官的量远远少于要接受移植治疗的患者数,因而近些年研究重点转向可供移植器官的组织工程方面.
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骨髓经羟乙基淀粉(HES)处理后分离和培养MSCs的初步探讨
种子细胞、支架材料和生长因子是组织工程的三大要素,而寻找合适的种子细胞是成功的重要因素[1].骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs),因其具有多向分化潜能,如形成骨、软骨、肌组织、皮肤等,成为具代表性的种子细胞[2,3].目前,国内外已分离培养出人,小鼠,大鼠,兔等的骨髓MSCs,并诱导分化出多种组织[4],但由于它在骨髓内含量极少,只占0.01%～0.001%,而组织工程需要短期内有大量的种子细胞再生组织,故需进行体外培养、分化和扩增[5].本实验对骨髓MSCs的两种分离方法进行比较,以期获得更好的方法.
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运用聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜-固定化条件培养液引导骨再生的实验研究
目的:探讨是否可以通过使用条件培养液(CM)和引导骨再生(GBR)技术加速骨再生.材料与方法:CM取自大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs).CM被固定在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)膜上,该膜需用0 5mol/L氢氧化钠(NaOH)处理以提高亲水性.实验分为4个组PLGA膜处理①磷酸盐缓冲液(PBS:PBS-M),②PBS和0.5mol/L NaOH(亲水性处理;PBS-HM),③CM(CM-M),④CM和0 5mol/L NaOH (CM-HM).通过扫描电镜观察这些实验性膜.液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)测定固定在PLGA膜上的来自骨髓间充质干细胞表达的蛋白.细胞增殖实验和碱性磷酸酶(ALP)活性测定分析CM对骨髓间充质干细胞活性的影响.实验性膜被移植到大鼠颅骨骨缺损模型.移植4周和8周后进行显微CT和组织学分析.结果:来自骨髓间充质干细胞的CM可固定于PLGA膜上.PLGA膜的亲水处理可增强CM的固定.LC/MS/MS分析表明,在PLGA膜表面的固定化蛋白质属于细胞外基质蛋白,如胶原蛋白、核心蛋白多糖、纤连蛋白.CM里从PLGA膜释放出的蛋白质,可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的细胞增殖和碱性磷酸酶活性.被CM-HM处理过的骨缺损区域新骨形成明显高于被其他组膜处理对应的骨缺损区域.结论:PLGA膜经0 5mol/L NaOH和CM处理后可促进此大鼠颅骨缺损模型的骨再生.
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组织工程血管研究进展
组织工程血管是一种较为理想的血管替代物.本文复习了国内外组织工程血管研究的有关文献,就组织工程血管研究所取得的进展、存在问题进行回顾和总结,旨在为推动我国组织工程血管研究的进一步深入.
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磷酸钙骨水泥替代骨的制备及其细胞生物相容性实验研究
目的:为了修复骨缺损,研制适宜的骨移植人工替代材料.方法:制备出磷酸钙骨水泥(CPC),检测其成分,并与骨髓基质干细胞共同培养,研究其细胞生物相容性及对骨髓基质干细胞成骨能力的影响.结果:所制备磷酸钙骨水泥主要成分为低结晶度的羟基磷灰石(HA),对骨髓基质干细胞的生存、增殖能力及对其成骨特性的保存无影响.结论:所制备磷酸钙骨水泥细胞生物相容性良好,是适宜的骨缺损修复材料.
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rhBMP-2对不同培养时间骨髓基质干细胞成骨能力的影响
目的:探讨不同培养阶段骨髓基质干细胞成骨能力的变化及BMP-2对其成骨能力的影响.方法:培养兔骨髓基质干细胞,测定第3代和第18代细胞碱性磷酸酶及骨钙素活性;测定BMP-2对不同培养时间骨髓基质干细胞成骨能力的影响;测定rhBMP-2对细胞增殖的影响.结果:细胞传至第18代后,分泌的骨钙素(OC)水平及ALP活力明显降低,与第3代细胞相比,差异显著(P＜0.05).第3代细胞在rhBMP-2的诱导下,分泌的OC水平及ALP活力在原基础上进一步升高,与对照组相比,差异显著(P＜0.05).结第18代细胞在rhBMP-2的诱导下,分泌的OC水平及ALP活力在原基础上升高,与对照组相比,差异不显著(P＞0.05);随培养时间的延长,各组细胞数量均有所增加,rhBMP-2诱导组与对照组细胞无显著性差异(P＞0.05).细胞的传代次数对细胞增殖无明显影响(P＞0.05).结论:rhBMP-2对细胞增殖无影响.随着传代次数的增加,骨髓基质干细胞的成骨能力下降,rhBMP-2促进其成骨的能力亦下降.
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聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞构建组织工程化人工关节软骨
目的:应用组织工程学技术,体外初步构建组织工程化人工关节软骨.方法:制备三维多孔软骨支架材料CPP/PLLA,体外诱导兔MSCs向软骨细胞表型分化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,将诱导细胞与软骨支架材料CPP/PLLA复合,体外培养构建人工关节软骨,1周后终止培养,扫描电镜观察组织工程化人工软骨的微观结构:同时将构建人工软骨移植于兔大腿皮下,3周后处死动物,甲苯胺蓝染色观察.结果:扫描电镜观察可见该复合材料CPP/PLLA为高孔隙率的网状、连通、微孔结构,微孔分布均匀,孔径大小为300-400μm之间;兔MSCs经体外软骨表型定向诱导后,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.诱导后的MSCs可在支架材料内良好贴附生长,细胞被分泌的胶原基质包裹;从体内获取的培养物组织切片观察可见大量的软骨细胞生成,甲苯胺蓝染色阳性.结论:经软骨起源诱导后的MSCs与CPP/PLLA复合培养可以构建自体软骨移植的替代物,为应用软骨组织工程方法修复关节软骨缺损和功能蓖建提供一种新材料,具有较大的潜在应用价值.
