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核心蛋白聚糖对鼠肌腱细胞Ⅰ型胶原及其mRNA的影响
目的:探讨核心蛋白聚糖(Decorin,DCN)对大鼠肌腱细胞Ⅰ型胶原的影响,为进一步临床应用提供理论依据.方法:50 μg/μ L的DCN作用大鼠肌腱细胞12h后,采用免疫细胞化学,免疫荧光方法观察DCN对大鼠肌腱细胞Ⅰ型胶原蛋白的影响,采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测DCN对大鼠肌腱细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响.结果:DCN在早期能够明显减少肌腱细胞的Ⅰ型胶原蛋白的合成,免疫荧光定量分析实验组和对照组相差显著;DCN早期还能够显著下调肌腱细胞Ⅰ型胶原蛋白mRNA水平的表达.结论:DCN在早期对大鼠肌腱细胞Ⅰ型胶原的形成起着抑制作用.
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结缔组织生长因子及抗体对体外培养鸡肌腱细胞增殖活性的影响
目的 探讨不同浓度结缔组织生长因子(CTGF)及其抗体对鸡肌腱细胞增殖活性的影响.方法 以来亨鸡趾长屈肌腱为材料,体外分离培养鉴定以后,分别以不同浓度CTGF及其抗体干扰培养;取第四代肌腱细胞,用CCK-8染色法观察细胞增殖情况,CTGF干扰实验根据培养液中含结缔组织生长因子的浓度不同分8组,分别为5、10、20、50、100、200、500 ng/ml组及未加CTGF组为对照组;CTGF抗体竞争抑制实验根据培养液中含CTGF抗体浓度分为5、10、20、50 μg/ml组及未加抗CTGF组为对照组.结果 成功建立了鸡肌腱细胞的分离和体外培养方法.CCK-8染色法检测显示,5、10、20、50、100 ng/ml CTGF组对肌腱细胞增殖随浓度增加而有上升趋势,各组之间差异有统计学意义(P＜0.05);100、200、500 ng/ml CTGF组之间对肌腱细胞增殖的影响差异无统计学意义(P＞0.05),CTGF抗体抑制组对肌腱细胞增殖的影响差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CTGF对体外培养鸡肌腱细胞增殖具有明显促进作用,100 ng/ml为佳浓度;CTGF抗体对肌腱细胞增殖活性无明显影响.
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人胚腱细胞转化生长因子-β受体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ密度分析
目的观察转化生长因子-β受体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)在体外培养的肌腱细胞中的表达情况,探讨TGF-β1对细胞周期及增殖指数PI值的影响.方法采用免疫组化法鉴定受体的表达,流式细胞仪法分析了同一细胞周期不同亚时相的TβR Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ受体数目差别并观察了不同浓度的TGF-β1对细胞周期及增殖指数PI值(S+G2M)的影响.结果TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ在体外培养的肌腱细胞中均有表达,TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ平均荧光强度在G1期分别是7.93±0.20、8.76±0.16、8.46±0.14,而在G2M期分别是17.7±0.36、18.9±0.35、18.3±0.67.细胞周期分析表明:TGF-β1作用下,Go/G1%呈降低趋势,而S%呈升高趋势,反映细胞增殖活力的PI值也呈升高趋势,尤以5 ng/ml以上浓度时为显著(P＜0.05).结论在肌腱细胞周期的不同亚时相,肌腱细胞TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ各自密度均具显著差别(P＜0.01),TGF-β1能促进腱细胞增殖.TGF-β受体系统不同亚时相的差别可能是其调控细胞增殖活动的生物学基础.
关键词： 肌腱细胞 转化生长因子-β受体 流式细胞仪 细胞周期 -
人腱细胞Smad2、Smad4基因MH2结构域的克隆和序列鉴定
目的从人腱细胞内克隆转化生长因子-β特异的细胞内信号转导基因Smad2、4的功能性结构域-MH2结构域.方法原代培养人腱细胞,从培养的细胞中提取总RNA,逆转录合成单链cDNA;设计引物进行PCR,扩增Smad2、4基因MH2结构域的基因片段,将其定向插入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α.挑选阳性克隆并进行核苷酸序列测定分析.结果测序结果与Genebank中克隆的基因序列完全一致.结论从人腱细胞中克隆成功Smad2、4基因的MH2结构域,证实了Smad2、4基因在人腱细胞中的表达;提示人腱细胞内存在SMAD2、4信号转导途径,TGF-β对人腱细胞分化的调节可能是通过SMAD2、4信号转导途径实现的.
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肌腱细胞相关基础研究进展
肌腱缺损的修复是临床常见问题,肌腱移植虽然简便易行,但常受来源紧缺和供区继发损害的制约,而组织工程技术有可能成功解决此问题.肌腱的组织工程化构建已经取得了一定的成果,然而种子细胞的来源问题始终困扰着人们.目前,较多使用的种子细胞有肌腱细胞、真皮成纤维细胞和骨髓间充质干细胞,各有优缺点.肌腱细胞是肌腱的基本功能单位,它合成和分泌胶原等细胞外基质,维持肌腱组织的新陈代谢.
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新型肌腱细胞循环牵伸载荷系统的研制及运行效果观察
目的 研制一种能对体外培养肌腱细胞进行循环载荷牵伸的实验装置并观察其运行效果.方法 用聚二甲基硅氧烷预聚物与固化剂制备微沟槽硅树脂培养皿;用可编程控制器配控制循环载荷牵伸装置的运转速度及时间,调节对培养皿的牵拉频率和时间;更换不同大小凸轮对培养皿实行不同牵拉强度.观察循环牵伸载荷系统的运行情况及稳定性;初步观察不同牵拉强度、频率和时间对体外肌腱细胞的生物学表现.结果 循环牵伸载荷系统能按不同的强度、频率和时间对硅树脂微沟槽培养皿进行牵拉,运行良好且稳定.微沟槽硅树脂培养皿能对其表面生长的肌腱细胞进行改向,细胞呈平行排列,与体内肌腱细胞排列方向具有相似性.结论 本研究研制的新型肌腱细胞循环牵伸载荷系统是一个较好的体外细胞牵伸载荷模型,具有运行稳定、可控性强的优点.
关键词： 肌腱细胞 微沟槽硅树脂培养皿 循环载荷细胞牵伸系统 -
核心蛋白聚糖对兔肌腱细胞增殖及细胞周期的影响
目的 观察核心蛋白聚糖(decorin,DCN)对兔肌腱细胞体外增殖和细胞周期的影响,以探讨decorin在肌腱愈合中对肌腱细胞的作用.方法 原代培养兔肌腱细胞,分别加入不同浓度(0.25、1.25、2.5、5μg/ml)的decorin;培养12、24、48 h用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖速度;镜下观察低浓度DCN作用24 h后对兔肌腱细胞增殖的影响;低浓度DCN培养24 h后用流式细胞仪检测细胞周期.结果 0.25、1.25、2.5μg/ml浓度decorin作用12 h后对兔肌腱细胞增殖有着减少的趋势,但是24 h后却明显地促进其增殖(P＜0.05),但是48 h后差异不显著.而5μg/ml浓度组作品12 h对兔肌腱细胞增殖有着增加的趋势,24 h后促进增殖作用显著(P＜0.05),48 h后却抑制兔肌腱细胞的增殖.0.25μg/ml低浓度decorin作用兔肌腱细胞24h后镜下观察和流式细胞分析,细胞增殖明显增强,S期增加,PI明显大于对照组(P＜0.05).结论 低、中浓度decorin对兔肌腱细胞的增殖起着先延迟后促进的作用,提示在肌腱愈合中如果在肌腱和腱鞘之间运用DCN,可能起到早期隔离TGF-β对腱鞘成纤维细胞的作用,而后期增强TGF-β对腱内膜细胞的作用,从而促进内源性愈合,减少外源性愈合,达到减少粘连的效果.
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表面改性及微沟槽技术对肌腱细胞生长与取向的影响
利用光刻技术制作微格式模板,微接触转印法制作微沟槽PDMS表面,微流道技术裱衬不同浓度的Ⅰ型胶原于微沟槽表面上,比较其对细胞生长形态及生长取向的影响.对照组为未裱衬胶原的微沟槽、平板PDMS及裱衬胶原的平板PDMS.种植SD大鼠肌腱细胞在材料上,于37℃孵箱中培养48 h.采用MTT比色法测定不同浓度的胶原对肌腱细胞的生长增殖的影响.通过倒置相差显微镜、扫描电镜、荧光显微镜观察细胞生长的形态,取向情况.结果显示:Ⅰ型胶原修饰的PDMS微沟槽材料比未裱衬胶原的对照组具有明显的促细胞生长的作用(P＜0.05),并且随着胶原浓度的增加作用越明显.有微沟槽表面的材料对细胞的生长形态和生长取向有明显影响.提示,Ⅰ型胶原修饰的微沟槽材料不仅能规范肌腱细胞的生长取向,而且能促进肌腱细胞的生长,从而得到理想的细胞生长形态,该结果对工程化肌腱的构建有重要的指导意义.
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生物衍生材料构建组织工程肌腱体内植入的实验研究
目的探讨用同种异体肌腱细胞与生物衍生肌腱材料体外联合培养后植入体内,构建组织工程肌腱的可行性. 方法选用四川猕猴15只,手术造成纤维鞘管内屈指深肌腱2.5 cm缺损后,分三组.A组:生物衍生肌腱材料构建的组织工程肌腱移植组;B组:单纯生物衍生肌腱材料移植组;C组:自体肌腱移植组.术后1、2、3、6和12周分期观察植入物的大体形态、组织学和超微结构,BrdU标记表达. 结果 A 组植入体内后肌腱细胞能继续增殖,细胞形态随着时间增加而逐渐趋于正常,形成的肌腱呈白色且有光泽、致密,组织学可见胶原纤维排列较为规则,12周肌腱细胞仍成活并分泌胶原,BrdU表达为阳性;B组植入体内3周后材料逐渐变细,12周后材料被逐渐降解吸收出现中断;C组植入体内2周后桥接部有纤维连接,排列较为规则,肌腱愈合.A组分别于3、6、12周进行扫描电镜观察可见肌腱细胞排列均匀,胶原纤维相互连接形成网状,主体趋势与肌腱走行方向一致;透射电镜下可见细胞核仁清晰,细胞器丰富.随时间的增加A、C组与B组的差异明显增大. 结论同种异体肌腱细胞与生物衍生肌腱材料复合构建的组织工程肌腱,植入免疫功能正常的动物体内能够再生出肌腱样组织,植入的肌腱细胞具有生命力,新生的肌腱组织在大体、组织学方面与正常肌腱相似.
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生长分化因子7体外促进BMSCs向肌腱细胞分化的研究
目的 探讨生长分化因子7(growth differentiation factor 7,GDF-7)在体外能否促进BMSCs向肌睫细胞分化,为改善BMSCs修复肌腱疗效提供依据. 方法 采用密度梯度离心法从绿荧光大鼠骨髓组织中分离培养BMSCs,通过成骨、成脂和成软骨分化鉴定其多向分化能力.取第3代BMSCs根据成肌腱培养液中加入不同浓度GDF-7(0、12.5、25.0、50.0 ng/mL),分为A、B、C、D组.体外诱导培养2周后,实时荧光定量PCR检测各组scleraxis、tenomodulin、tenascin C和Ⅰ型胶原mRNA表达,免疫细胞化学染色观察tenomodulin、tenascin C和Ⅰ型胶原蛋白表达,Western blot法检测A、C组tenomodulin蛋白的表达. 结果 经鉴定,分离培养的BMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的多向分化能力.实时荧光定量PCR检测结果示,B、C、D组的tenomodulin mRNA表达分别较A组增加了2.85、3.41、3.07倍(P＜0.05),scleraxis mRNA表达增加了2.13、1.50、2.56倍(P＜0.05),tenascinC mRNA表达增加了2.45、2.86、1.88倍(P＜0.05),但B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05).B、C组Ⅰ型胶原mRNA表达较A组分别增高了1.92和2.45倍(P＜0.05)；D组较A组有所增高,但差异无统计学意义(P＞0.05).免疫细胞化学染色示,B、C、D组均有tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原蛋白表达,而A组均未表达；除C组Ⅰ型胶原表达高于B、D组外,其他蛋白表达B、C、D组间无明显差异.Western blot检测示C组比A组有更高的tenomodulin蛋白表达. 结论 GDF-7在体外能促进大鼠BMSCs向肌腱细胞分化.
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聚磷酸钙纤维作为肌腱组织工程支架材料的体外实验研究
目的探讨编织的辫状聚磷酸钙纤维(CPPF)支架,在体外物理性能及与肌腱细胞的吸附情况. 方法 CPPF直径15 μm,编织成横截面积为3 mm×2 mm的辫状支架;体外测试其拉伸强度、孔隙率及吸水率.将体外培养SD大鼠原代趾屈肌腱细胞,以5×106 /ml浓度与CPPF辫状支架或Ⅰ型胶原涂层的CPPF辫状支架进行体外混合培养,组织学观察材料与细胞的吸附情况. 结果编织的CPPF辫的平均拉伸强度为(122.80±17.34)N;平均吸水率为61.56%±14.57%;平均孔隙率为50.29%±8.16%.肌腱细胞与CPPF支架纤维的吸附较差,与Ⅰ型胶原涂层后的CPPF支架纤维吸附良好. 结论 CPPF有可能成为一种较理想的构建肌腱组织工程复合型支架的新型材料.
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组织工程化肌腱研究进展
对组织工程化肌腱领域中目前研究的主要成果进行综述,着重阐述了肌腱细胞外基质替代物、肌腱细胞生物学性质及肌腱细胞与细胞外基质材料复合研究中的主要问题.认为,研制适于肌腱细胞生长、粘附和发挥功能的细胞外基质材料;建立生长、增殖可调控的肌腱细胞系;在模拟体内力学条件下,进行肌腱细胞三维培养,将是研究具有特定修复功能的组织工程化肌腱的重要问题.
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肌腱细胞类胰岛素生长因子-1受体密度分析
为了了解类胰岛素生长因子-1(IGF-1)受体在不同代次体外培养的肌腱细胞的分布,同时观察同一肌腱细胞周期中不同亚时相的IGF-1受体数目的差别,采用免疫组化和流式细胞仪分析法,对体外培养的原代、第6代和第13代肌腱细胞的IGF-1受体密度进行了分析,并以第6代肌腱细胞为对象,进行了同一细胞周期不同亚时相的IGF-1受体数目差别分析.结果表明,IGF-1受体在体外培养的原代、第6代和第13代肌腱细胞的密度大体相同,而在同一细胞周期中分裂前期及分裂期(G2M期)的受体数目比DNA合成前期(G1期)的受体数目多(P<0.01).提示,在肌腱细胞培养的传代过程中和在同一细胞周期的不同亚时相,肌腱细胞均维持一个相对稳定的IGF-1受体密度.为组织工程人工肌腱的构建和肌腱细胞生长的调控提供了理论基础.
关键词： 类胰岛素生长因子-1 受体密度 肌腱细胞 流式细胞仪 -
阻断类胰岛素生长因子-1-受体系统对肌腱细胞生长的影响
为了进一步探索调控肌腱细胞生长的方法,在肌腱细胞体外培养条件下, 采用多种手段阻断类胰岛素生长因子-1(IGF-1)-受体系统的不同环节,观察其对肌腱细胞生长的负调节作用.结果发现,IGF-1受体的抗体(IGF-1Rα)和合成的IGF-1受体的mRNA的反义寡核苷酸链,对肌腱细胞的增殖有负调节作用.认为,在人工肌腱的构建或防止肌腱粘连的实践中,可以考虑使用上述两种物质.
关键词： 类胰岛素生长因子-1 受体 肌腱细胞 生长调节 体外培养 -
6-磷酸果糖对肌腱细胞TGF-β及其受体表达的影响
目的 通过体外培养兔肌腱的腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞,观察6-磷酸果糖对3种细胞TGF-β及其受体、TGF-β_1及TGF-β_1 mRNA表达的影响,探讨6-磷酸果糖在肌腱愈合粘连防治中的作用机制提供实验依据. 方法 成年新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重4.0～4.5 kg.取兔前肢趾深屈肌腱分离培养腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞.将每种细胞随机分为2组,实验组加入6-磷酸果糖培养,对照组不加入6-磷酸果糖.分别于培养3 d及24 h后采用酶联免疫吸附实验定量检测TGF-β及其受体的表达,原位杂交检测TGF-β1_mRNA的表达;免疫组织化学染色观测TGF-β_1的表达. 结果 酶联免疫吸附实验显示实验组各细胞TGF-β及其受体的表达均较对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05).TGF-β_1表达平均降低程度从大到小依次为腱鞘细胞(36.1%)、腱内膜细胞(31.2%)、腱外膜细胞(31.0%),TGF-β_2,依次为腱鞘细胞(37.9%)、腱外膜细胞(32.1%)、腱内膜细胞(27.0%),TGF-β_3依次为腱内膜细胞(42.5%)、腱鞘细胞(41.2%)及腱外膜细胞(33.3%).TGF-β受体1、2表达平均降低程度从大到小依次为腱外膜细胞(29.9%、26.2%),腱内膜细胞(27.8%、23.5%),腱鞘细胞(23.1%、20.0%);TGF-β受体3依次为腱内膜细胞(26.1%)、腱外膜细胞(19.2%)、腱鞘细胞(15.8%).实验组各细胞TGF-β_1mRNA阳性表达率及细胞内TGF-β_1mRNA表达强度均较对照组明显降低,比较差异有统计学意义(P<0.05).免疫组织化学染色观察显示实验组各细胞TGF-β_1表达均较对照组明显降低. 结论 6-磷酸果糖能显著降低肌腱细胞的TGF-β及其受体、TGF-β_1及TGF-β_1mRNA的表达,为肌腱愈合过程中调节TGF-β水平提供了一种新途径.
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动态应变下肌腱细胞三维培养的初步研究
目的研究三维培养条件下机械应变对肌腱细胞形态、排列、增殖及代谢的影响.方法采用自行研制的动态应变三维细胞培养装置,将机械应变作用于肌腱细胞-支架材料复合物.结果机械应变对肌腱细胞分裂、DNA合成和代谢的影响与应变作用的强度、频率、周期及作用时间有关.采用特定的应变(10%伸长、0.2 Hz、每小时作用15分钟)作用48小时,加载组肌腱细胞数和3H标记的胸腺嘧啶核苷掺入量都明显高于对照组(P＜0.05);在应变作用下,其细胞形态呈扁平形,沿应变方向延伸;机械应变还引起Ⅰ型胶原合成增加(P＜0 .05).结论周期性机械应变直接作用于肌腱细胞可以刺激其生长,这对于应用机械应变促进组织工程化肌腱的构建具有重要应用价值.
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核因子-κB诱导激酶和IκB激酶在碱性成纤维细胞生长因子作用下基因表达及肌腱细胞增殖
目的探讨核因子-κB(NF-κB)、NF-κB诱导激酶(NIK)和其抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促肌腱细胞NF-κB基因表达信号传递中的作用. 方法用兔的趾屈肌腱细胞,分成三组,分别在无bFGF、2 ng/ml bFGF和10 ng/ml bFGF环境下培养5 d,绘制肌腱细胞生长曲线,5 d时提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NIK、IκB 激酶α(IKKα)、IκB 激酶β(IKKβ)基因表达水平. 结果随使用bFGF剂量增加,肌腱细胞生长曲线前移.2 ng/ml bFGF组的NF-κB、NIK、IKKα、IKKβ基因表达相对值分别为0.4±0.2,0.4±0.1,0.3±0.1,0.2±0.1;10 ng/ml bFGF组各基因分别为1.8±0.5,1.0±0.3,0.8±0.2,1.5±0.4,bFGF加入后4种基因表达均显著增加(P<0.01). 结论 bFGF增强NF-κB通路上各信号传递因子的基因表达并促进肌腱细胞增殖,提示bFGF促进腱细胞增殖的信号传递系统可能为NF-κB系统.
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骨髓间充质干细胞的应用研究进展
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量为丰富,胎儿脐血中亦可分离得到[1].在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力;同时, MSC 还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化[2-5].这似乎突破了MSC仅为中胚层干细胞的概念,展示了MSC具有更为重要的理论研究意义和更为广阔的应用前景.笔者就近年来骨髓间充质干细胞在组织修复中的主要应用研究进展作简要综述.
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转化生长因子-β1对肌腱细胞DNA及胶原合成的影响
近年来的研究表明,转化生长因子-β1(TGF-β1)在肌腱的修复中起重要作用[1,2 ].而TGF-β1对细胞增殖分化作用的调节不仅与细胞来源、实验条件及其他生长因子有密切关系,亦与分化程度、细胞基质及其作用时间和剂量等密切相关[3].笔者通过同位素掺入及RT-PCR法观察TGF-β1不同作用剂量对人胚腱细胞DNA及胶原的合成效应,
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血小板源性生长因子BB对体外培养肌腱细胞增殖的影响
目的 了解不同浓度的血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)对体外培养的肌腱细胞增殖的影响.方法 体外培养并鉴定大鼠肌腱细胞,用含不同浓度的PDGF-BB培养液培养肌腱细胞,根据培养液中所加PDGF-BB浓度不同分为1、5、10、20、50、100、150、200、250 ng/mL PDGF-BB组,分别用含以上终浓度的PDGF及体积分数0.5%FBS的培养液培养.对照组,用含体积分数0.5%FBS的培养液培养.以噻唑蓝法检测细胞增殖能力.于加入PDGF-BB培养前(0 h)以及培养后12、24、36、48、60、72 h,检测20 ng/mL PDGF-BB组及对照组肌腱细胞的吸光度值. 结果分离培养的细胞Ⅰ型胶原染色呈阳性,Ⅲ型胶原染色呈阴性,证明为大鼠肌腱细胞.与对照组相比,除250ng/mL PDGF-BB组外,其他各组细胞的吸光度值均升高(P<0.05或P<0.01).随着PDGF-BB浓度的增加,其吸光度值先逐渐增大,达一定浓度(20 ng/mL)后又逐渐减小.20 ng/mL PDGF-BB组培养12 h肌腱细胞开始增加,至48 h达高峰(0.53±0.04),24～72 h均明显高于对照组(P<0.01).结论 PDGF-BB在一定浓度和时间范围内具有促进肌腱细胞增殖的作用.
