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蛋白激酶B在佛波酯诱导人胃癌细胞系凋亡中的作用
目的 讨佛波酯(TPA)诱导胃癌细胞系凋亡过程中蛋白激酶B(PKB)的作用.方法 通过BrdU处理,流式细胞术检测以及DAPI染色,荧光显微镜观察分析TPA对胃癌BGC-823细胞的影响;免疫印迹法检测TPA对PKB蛋白表达水平、磷酸化的影响;核浆分离获得核浆蛋白,用于免疫印迹法检测TPA对胃癌细胞内PKB和其Ser 473位点磷酸化的核浆表达影响,以及激光扫描共焦显微镜观察TPA是否改变胃癌细胞内PKB的分布. 结果TPA诱导BGC-823细胞凋亡;TPA下调BGC-823细胞内PKB蛋白表达,并且与TPA作用时间和TPA浓度呈正相关,与PP2A降解作用无关;TPA抑制PKB的Ser 473位点磷酸化,而对其Thr 308位点磷酸化没有明显影响;TPA下调细胞核内PKB的表达以及Ser 473位点的磷酸化;TPA并不改变PKB在胃癌细胞内的分布. 结论 PKB的抑制作用可能参与TPA诱导胃癌细胞凋亡过程;由TPA诱导的胃癌细胞凋亡可能部分是由于细胞核内PKB蛋白表达和Ser 473位点磷酸化下降所致.
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激光对细胞内反应氧、钙离子浓度及细胞膜完整性的影响
目的 探讨在激光扫描共焦显微镜(LSCM)观测活细胞的过程中,激光对细胞内反应氧(ROS)、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)和细胞膜完整性的影响.方法 用H2DCFDA、Fluo-4AM和Calcein-AM/PI分别检测488nm激光对脐静脉内皮细胞株(ECV-304)细胞内ROS、[ca2+]i和细胞膜完整性的影响,Ultra view LCI(live cell image)共聚焦成像系统采集并分析结果.结果 激光照射后细胞内 DCF 的荧光强度迅速上升,约80s达到峰值,随后下降并逐渐回到基础水平;Fluo-4的荧光强度在70min内持续平缓地上升;Calcein 的荧光强度明显下降,少量细胞PI阳性染色.结论 488nm激光照射可引起细胞内ROS和[Ca2+],的增加,但对细胞膜的完整性没有显著影响.
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佛波酯处理人胃癌MGC80-3细胞过程中磷酯酶C-γ2的意义
目的 探讨佛波酯(TPA)处理人胃癌MGC80-3细胞过程中磷酯酶C-γ2(PLC-γ2)的意义.方法 通过DAPI染色,荧光显微镜观察分析TPA对胃癌MGC80-3细胞的影响;借助核浆分离手段获得胃癌细胞核浆蛋白,并通过免疫印迹(Western blotting)检测TPA对PLC-γ2蛋白表达水平影响;通过免疫荧光技术处理,激光扫描共焦显微镜观察胃癌细胞内PLC-γ2蛋白的定位和转运;用PLC-γ2的抑制剂(U73122)预处理细胞,免疫印迹和激光扫描共焦显微镜分别检测其对TPA作用胃癌细胞内PLC-γ2的影响;以及荧光显微镜下观察分析U73122是否影响TPA对胃癌细胞的作用.结果 TPA诱导胃癌MGC80-3细胞凋亡;同时TPA提高PLC-γ2蛋白表达水平,并诱导其发生核浆转运;其抑制剂(U73122)可以降低TPA对PLC-γ2蛋白表达水平的作用,但并不能影响TPA诱导胃癌细胞凋亡;而TPA诱导的PLC-γ2核浆转运却没有被PLC-γ2抑制剂(U73122)阻止.结论 尽管TPA提高了胃癌MGC80-3细胞中PLC-γ2表达水平,但PLC-γ2表达水平和TPA诱导的胃癌MGC80-3凋亡没有直接关系,而其核浆转运可能与TPA诱导的胃癌细胞凋亡相关.
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人椎间盘髓核细胞突起的形态学特征
目的 探讨成人腰椎间盘髓核细胞突起的形态学特征.方法 取8例成人腰椎间盘髓核组织标本(Thompson Ⅰ～Ⅱ),分别行冰冻切片和电镜切片,同时进行髓核细胞的分离和单层培养,利用光镜、激光扫描共焦显微镜和透射电镜,从组织、细胞和超微结构水平观察细胞突起的形态学特征.结果 所有的髓核细胞均具有明显的突起结构,相邻的细胞突起间可见缝隙连接.在体状态下均呈类圆形的髓核细胞进行离体培养时却呈现梭形和类圆形两种不同的形态,梭形细胞与类圆形细胞的比例约为2.3∶1.梭形细胞的突起顺着细胞体长轴发出,未见二级突起.类圆形细胞的突起从细胞体四周发出,突起呈树枝状,可见多级突起.结论 突起是椎间盘髓核细胞的形态学特征之一,对突起功能的深入研究将有助于加深对椎间盘退变病理机制的认识.
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p21活化激酶2在爪蟾卵母细胞的细胞质分裂过程中的作用
目的 研究p21活化激酶2(PAK2)在爪蟾卵母细胞的细胞质分裂中的作用.方法 以爪蟾卵母细胞为模型,利用特异性抑制PAK2活性的PAK2-N端(PAK2-NT)片段,显微注射爪蟾卵母细胞.荧光显微镜下比较PAK2-NT mRNA注射组和对照组卵母细胞生发泡破裂的发生.激光扫描共焦显微镜下,时间延迟摄影法观察两组卵母细胞的细胞质分裂过程中肌动蛋白和纺锤体的变化.结果 PAK2-NT mRNA注射组卵母细胞与对照组卵母细胞生发泡破裂发生相似,但PAK2-NT mRNA注射组卵母细胞未见细胞质分裂.结论 PAK2可能参与爪蟾卵母细胞的细胞质分裂过程.
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溶酶体4次穿膜蛋白β在小鼠卵母细胞及早期胚卵中的表达
目的 观察溶酶体4次穿膜蛋白β(LAPTM4β)在小鼠卵母细胞及早期胚卵中的表达,分析新基因LAPTM4β在植入前胚卵发育中的作用,为研究植入前胚卵发育的基因调控提供实验依据.方法 从50只小鼠的子宫或输卵管中收集小鼠卵母细胞及从原核期到胚泡的早期胚卵共50枚.采用激光扫描共焦显微镜技术与免疫组织化学ABC法,观察小鼠卵母细胞及早期胚卵中LAPTM4β的表达;表达结果用Maticam2206图像分析系统进行半定量分析.结果激光扫描共焦显微镜下显示,小鼠卵母细胞和原核期胚卵细胞质的绿色荧光呈不均匀分布,近细胞膜处荧光信号强;2细胞期、4细胞期、8细胞期和桑椹胚卵裂球胞质中绿色荧光均呈局灶性分布,且靠近细胞膜处胞质中绿色荧光均较强,2细胞期中所见极体内也有绿色荧光信号;小鼠胚泡滋养层细胞及内细胞团中均可见中等强度的绿色荧光.免疫组织化学显示,在小鼠卵母细胞中可见LAPTM4β阳性反应颗粒呈浅棕色;原核期、2细胞期、4细胞期、8细胞期胚及桑椹胚,可见深棕色颗粒,且在卵裂球胞质中呈不均匀分布;胚泡的内细胞团及滋养层细胞中均可见棕色阳性反应颗粒.图像分析结果显示,卵母细胞与原核期胚相比,8细胞期与桑椹胚相比,桑椹胚与胚泡相比,LAPTM4β的表达量有显著差异(P<0.05).结论 LAPTM4β在正常小鼠卵母细胞及植入前各期胚卵中均有表达,且具有规律性;不同阶段早期胚卵中LAPTM4β的表达量均高于卵母细胞,推测IAPTM4β与小鼠早期胚卵的细胞分裂、增殖、分化及胚胎发育相关.
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自噬在巨噬细胞清除凋亡淋巴细胞中的作用
目的 研究巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞后自噬结构的形态学特征,探讨自噬对巨噬细胞清除凋亡细胞的作用.方法 用环磷酰胺诱导淋巴细胞凋亡.在扫描电子显微镜下观察巨噬细胞吞噬凋亡细胞的形态学变化,透射电镜下观察巨噬细胞内的自噬前体、自噬体和自噬溶酶体的结构特点,用图像分析仪测量自噬结构的断面面积.以单丹磺酰尸胺(MDC)染色法标记巨噬细胞的自噬体,在激光扫描共焦显微镜下观察和定量分析.结果 巨噬细胞活跃地吞噬凋亡淋巴细胞、凋亡细胞核、凋亡小体或其他细胞碎片,形成异噬体.与对照组比较,吞噬凋亡细胞组的自噬细胞及其自噬体数目增多,自噬前体、自噬体和自噬溶酶体与细胞质的断面面积之比增大.许多自噬体内可见凋亡小体或其他细胞碎片,这些自噬体的体积较大,多位于细胞膜下.未观察到含有整个凋亡细胞或凋亡细胞核的自噬体.结论 巨噬细胞清除凋亡淋巴细胞时自噬功能显著增强.自噬对于凋亡淋巴细胞的清除起着重要的直接和间接作用.
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大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞
目的 采用骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导为心肌样细胞,为干细胞移植治疗心衰提供一种新的细胞材料.方法 取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,分别用终浓度为5、10、15、20 μmol/L的5-氮胞苷(5-aza)定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共焦显微镜技术检测结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌特异性肌钙蛋白(C-TnT)的表达,透射电镜鉴定.在诱导后7d、21 d和28 d,3个时间点以半定量RT-PCR方法检测细胞心肌早期转录因子GATA4和心肌特异性肌凝蛋白重链αMHC的表达.结果 MSCs体外经5-aza诱导后分化的细胞desmin、α-sarcomericactin、C-TnT均表达阳性,5 μmol/L组阳性表达较高,透射电镜下可见到平行排列的肌丝.RT-PCR结果显示,GATA4于诱导后7 d弱表达,21 d表达增强,28 d表达减弱.αMHC在诱导后7 d不表达,21 d弱表达,28 d表达明显.结论 骨髓间充质干细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,是自体心肌细胞一种良好的供体来源.
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人卵母细胞体外成熟前后线粒体分布的变化
目的 研究人未成熟和成熟卵母细胞中线粒体的分布,进一步阐明卵母细胞成熟和线粒体分布的关系.方法 未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞均用Mito Tracker Green FM染色,经多聚甲醛固定后在激光扫描共焦显微镜下观察线粒体的分布.结果 线粒体在细胞质中的分布方式可分为:周边分布、半周边分布和均匀分布.在64.10%(50/78)的GV期卵母细胞中,线粒体呈周边分布.45.16%(28/62)的MI期卵母细胞中,线粒体仍维持周边分布;呈均匀分布的卵母细胞的比例为38.71%(24/62).体外培养成熟以后,线粒体在75.47%(80/106)的卵母细胞中呈现均匀分布.与体外培养成熟的卵母细胞相比,体内成熟的卵母细胞中线粒体分布明显的特点是胞质中央区域线粒体的浓集,荧光强度高于周边区域.结论 人卵母细胞成熟前后,线粒体出现明显的分布变化,由未成熟卵母细胞中以周边分布为主变为成熟卵母细胞中以均匀分布为主.
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不同浓度内皮素对体外人心包间皮细胞内钙离子浓度的影响
目的 探讨不同浓度内皮素(ET)对培养人心包间皮细胞内钙离子浓度的影响. 方法 体外培养人心包间皮细胞,以Fluo-3/AM负载细胞,利用激光扫描共焦显微镜测定10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L内皮素分别作用于23组间皮细胞后细胞内钙离子浓度的变化. 结果 心包间皮细胞内钙离子浓度随时间、ET浓度变化出现明显改变(P<0.001);不同浓度ET与不同时间测定的钙离子浓度之间存在交互作用(P<0.001). 结论 不同浓度内皮素作用于人心包间皮细胞后可引起细胞内钙离子浓度的改变;内皮素可能通过自分泌或旁分泌的方式作用于心包;人心包间皮细胞可能具有重要的生物活性.
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细胞色素C和Bax在创伤后应激障碍大鼠海马神经元的表达及意义
目的 观察细胞色素C(Cyt C)和凋亡相关基因 bax 在创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马神经元中的表达,探讨其在细胞凋亡中的作用及相互关系. 方法 成年雄性Wistar大鼠60只,采用国际认定的无连续单一应激(SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型,取SPS刺激后1d、4d、7d、14d、28d组和正常对照组.应用免疫组织化学、免疫荧光双标、激光扫描共焦显微镜技术和免疫印迹法检测Cyt C 和Bax 蛋白的表达. 结果 Cyt C 蛋白于SPS刺激后4d达到高峰并维持较高水平,SPS刺激7d之后逐渐下降.Bax蛋白于SPS刺激后7d 达到高峰,14d开始下调,28d恢复到正常水平. 结论 在PTSD大鼠海马神经元中,Bax上调并促进了Cyt C的释放,而Cyt C的释放可能是导致PTSD大鼠海马神经元凋亡的机制之一.
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硫化氢对体外大鼠肝星状细胞内Ca2+浓度变化及细胞增殖的影响
目的 研究硫化氢(H2S)对大鼠肝星状细胞-T6(HSC-T6)Ca2+浓度、细胞增殖的影响及其机制. 方法 活化HSC-T6用含10%小牛1血清DMEM培养液制备为1×105个肝星状细胞(HSC)悬液.钙离子荧光探针Fluo-3/AM负载细胞后,在不同刺激条件下,利用激光扫描共焦显微镜动态扫描HSC-T6细胞内Ca2+荧光强度(FI)变化,FI表示细胞内Ca2+浓度.四唑盐比色法,观察不同浓度H2S供体--NasH对HSC-T6细胞增殖的影响. 结果 低浓度H2S(100μmol/L)明显降低HSC-T6细胞内Ca2+浓度(P<0.05),而细胞增殖增加(增殖率为116%);KATP通道阻断剂--格列本脲可阻断H2S的作用.高浓度H2S(Immol/L)刺激HSC-T6细胞内Ca2+浓度增加,但细胞增殖无明显变化(P>0.05). 结论 低浓度H2S通过激活HSC-T6细胞KATP通道降低绌胞内Ca2+浓度,可能通过调节细胞氧化应激促进细胞增殖;高浓度H2S刺激HSC-T6细胞内Ca2+浓度增加.提示H2S在肝硬化门脉高压症的发生机制中具有双重作用.
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CD44介导的透明质酸促进巨噬细胞的吞噬功能
目的研究透明质酸(HA)对巨噬细胞吞噬功能的影响及其机制.方法用免疫细胞化学法标记CD44.在噬动轨迹实验中,用图像分析仪测量细胞吞噬后在其周围形成的无颗粒区面积,扫描电镜下观察巨噬细胞形态.在吞噬荧光微珠实验中,计数吞噬的微珠,观察细胞内F-肌动蛋白的分布.在吞噬HA包被微珠实验中,计数吞噬的微珠,在扫描电镜下观察细胞形态,用激光扫描共焦显微镜分析吞噬HA包被微珠时细胞内Ca2+水平.用CD44阻断抗体处理后,观察细胞吞噬功能的变化.结果巨噬细胞表达CD44.吞噬细胞较圆,板状伪足和丝状伪足较短.在吞噬颗粒和微珠时,细胞膜出现杯状凹陷.在HA组,吞噬氯化金颗粒和荧光微珠的数目增多,吞噬荧光微珠处的F-肌动蛋白丰富.在包被HA微珠组,吞噬微珠的数目增多,吞噬处的Ca2+水平显著升高.阻断CD44后,细胞吞噬氯化金颗粒、荧光微珠和HA包被微珠减少.结论HA促进巨噬细胞的吞噬功能,CD44介导HA对巨噬细胞吞噬功能的作用.
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实验性蛛网膜下腔出血后海马CA1区神经元凋亡的研究
目的探讨实验性蛛网膜下腔出血(SAH)后海马CA1区神经元凋亡及CD95(Fas)分子启动的死亡信号转导机制.方法枕大池二次注血法制备蛛网膜下腔出血模型,HE染色和激光扫描共焦显微镜观察海马CA1区神经元细胞形态学改变,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SAH后海马CA1区CD95(Fas)分子启动的死亡信号转导通路蛋白Fas、FasLmRNA的表达变化.结果蛛网膜下腔出血后6 h海马CA1区神经元凋亡细胞开始出现,3～7 d呈典型凋亡细胞形态学改变.Fas、FasLmRNA的表达在蛛网膜下腔出血后呈上升趋势,3 d时达高,7 d时仍显著高于正常组,14 d时趋于正常. 结论 CD95(Fas)分子启动的死亡信号转导通路在SAH后海马CA1区神经元凋亡中可能起重要作用.
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体外诱导成骨细胞在降解性镁合金表面的附着与增殖
目的 观察诱导后的成骨细胞在Mg-Mn-Zn表面附着与增殖情况. 方法 分离培养兔骨髓基质干细胞(BMSCs),将其诱导分化为成骨细胞后,以1×108/L的细胞浓度种植在Mg-Mn-Zn及对照组纯钛表面,联合培养1、3、5d后,分别用扫描电镜、激光扫描共焦显微镜观察两种金属表面的细胞形态学变化及生长情况.结果 BMSCs以球状体方式进行克隆生长,经诱导后的细胞表达成骨细胞特性,在与镁合金复合培养后, 细胞发生黏附并增殖连接成片. 结论诱导后的成骨细胞在Mg-Mn-Zn表面有较好的分裂增殖能力,提示镁合金有较好的骨诱导生成作用.
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重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞内钙离子稳态的影响
目的 观察重组人内抑素(rhEndestatin)对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞(AA FLSs)内钙离子(Ca2+)稳态的影响,探讨rhEndomafin促进AA FLSs凋亡的离子机制,为RA药物治疗及寻找其治疗新靶点提供实验依据.方法雄性SD大鼠12只,体质量140～160 g,分为正常组(n=3)和从模型组(n=9).模型组大鼠制备从模型,体外培养AA FLSs,应用Ca2+荧光指示剂Fluo-3/AM孵育培养的细胞,激光扫描共焦显微镜检测有、无细胞外Ca2+,而rhEndestatin作用所致AA FLSs胞内Ca2+荧光强度发生动态变化,可以判断rhEndostatin对AA FLSs胞内Ca2+浓度([Ca2+]I)的影响.结果在胞外有Ca2+的情况下,rhEndostatin可引起静态AA FLS[Ca2+];快速增加,rhEndostatin作用10s后,[Ca2+];急剧增加达峰值,继之随时间缓慢下降,停止加药50 s后,[Ca2+]I尚未回复到加药前基础水平;而在无细胞外钙环境中,rhEndostatin未引起AA FLSs[Ca2+]I变化.结论 rhEndestafin可促进AA FLSs胞外Ca2+内流,引起胞内Ca2+超载,从而促进从FLSs凋亡.
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大鼠海马神经干细胞体外增殖、凋亡和分化的激光扫描共焦显微镜观察
目的 采用激光扫描共焦显微镜观察体外培养胎鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖、凋亡及其分化情况.方法 体外分离培养胚胎大鼠海马NSCs,把神经干细胞球培养在共焦显微镜专用培养皿中.用Hoechst 33258染细胞核,免疫荧光细胞化学技术检测巢蛋白(Nestin)的表达以鉴定NSCs,检测神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白(β-Ⅲtubulin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达以测定NSCs的分化能力.通过激光扫描共焦显微镜对神经干细胞球进行光学连续断层扫描,然后用软件进行三维重建,立体动态观察神经球.结果 通过激光扫描共焦显微镜观察到神经球Nestin阳性表达,NSCs的突起随着发育逐渐增长,并相互缠绕,经2次传代后培养7d的NSCs凋亡率为(8.60±2.20)％.在血清诱导下分化后的细胞突起从细胞球向四周呈放射状迁移,且突起相互交错成网状.经2次传代后诱导分化7d的NSCs分化为星形胶质细胞和神经元的比例分别为(68.60±7.64)％和(29.90±8.22)％ (P ＜0.01).结论 对大鼠神经干细胞球的增殖、凋亡及分化的观察激光扫描共焦显微镜发挥了独特的优势.
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金纳米粒用于口服内吞转运机制研究的检测方法
口服纳米载体可以有效地提高难溶性药物的生物利用度,其与肠上皮细胞的相互作用研究也成为一大热点.在该领域的研究中,物理包载或化学偶联荧光基团的纳米载体常常被选择,但是物理包载荧光染料可能会发生泄漏,影响结果分析,而化学偶联荧光探针可能会改变纳米粒结构的表面特征.因此,需要寻找一种简便、准确的检测方法以探究口服纳米粒内吞及跨膜转运的过程、胞内分布和机制.本文选择金纳米粒为纳米模型载体,基于金纳米粒具有光散射的性质,以633 nm波长的激光为激发光源,通过激光扫描共焦显微镜(CLSM)检测金纳米粒溶液,肠道上皮细胞内及大鼠肠道中的金纳米粒.结果通过激光共聚焦显微镜反射光的模式,无论在细胞水平还是大鼠肠道中,都能够准确地检测到金纳米粒的信号,进而分析金纳米粒入胞及跨越肠道上皮细胞的过程和胞内分布,且不受背景的干扰,并能借助层扫模式,构建金纳米粒在细胞内分布的3D模型.因此,在不进行荧光探针偶联的条件下,通过反射光分析金纳米粒跨膜转运是准确、简便的方法.
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激光扫描共焦显微镜观察穿透角膜移植术后角膜的形态学特征
目的 研究活体穿透角膜移植术后各层角膜组织的激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)的形态学特征.方法 应用海德堡视网膜激光断层扫描仪Ⅱ/Rostock角膜模块(HRT Ⅱ)对20例20眼穿透角膜移植术后40天～2年的患者进行检查,记录并分析其各层角膜图像.结果 穿透角膜移植术后早期角膜上皮细胞排列欠规则;Bowman膜和Descemet膜在激光共焦显微镜下无细胞结构;所有患者浅基质层细胞均较深基质层密集;稳定角膜植片其内皮细胞排列紧密,形态为均一六边形结构;所有患者均未发现上皮下神经丛及基质神经;术后植片排斥者有其特殊形态学表现.结论 激光扫描共焦显微镜可活体检查穿透角膜移植术后角膜各层组织结构和细胞的病理改变,为临床诊断及用药提供有价值的客观依据,并在跟踪随访方面具有重大意义.
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一种小鼠胸腺基质细胞和活化胸腺细胞共表达分子的研究
研究抗小鼠胸腺基质细胞(MTSC)Pf18-3单抗识别分子的表达特性。方法：采用流式细胞(FACS)和激光扫描共焦显微镜(CLSM)分析TSC单抗Pf18-3染色特征。结果：FACS分析发现Pf18-3单抗识别分子可表达于胸腺、胎肝和骨髓等不同来源的基质细胞系和腹腔巨噬细胞表面。新鲜分离的胸腺细胞Pf18-3识别分子表达阴性，但ConA活化可诱导并上调其表达，随活化时间延长表达增高，且主要表达于CD4+CD8+和CD4+CD8-两细胞亚群。CLSM分析可见：荧光沿胸腺细胞边缘呈环状分布，活化后荧光明显增厚向胞浆延伸，胞核不着色。结论：Pf18-3单抗识别分子共表达于胸腺基质细胞及活化的胸腺细胞，并与CD4+CD8+和CD4+CD8-亚群胸腺细胞活化密切相关。
