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20cm与8cm SDS-PAGE检测钙ATP酶同工异构体分子量比较
目的 比较在蛋白质组学中使用的20 cm SDS-PAGE和传统的8 cm SDS-PAGE在细胞膜钙ATP酶(PMCA)同工异构体表观相对分子质量测量的差异.方法 人晶状体上皮细胞(HLE B-3细胞)经培养至90%融合后,收集其膜蛋白.部分样品行20 cm SDS-PAGE,条件为16 mA/gel,然后改为24 mA/gel,共4～5 h.另一部分样品行8 cm SDS-PAGE,条件为200V 45 min.在同一胶上同时电泳已知相对分子质量的蛋白质标记物.分离厚的蛋白转移到PVDF膜上,用针对细胞膜钙ATP酶(PMCA)同工异构体PMCA1、PMCA2和PMCA4的特舁性抗体进行Western印迹检测.通过电泳移行距离与对数相对分子质量的线性关系计算各个同工异构体的表观相对分子质量.结果 从电泳条带的形态上看,8 cm胶中蛋白条带较细而浓集,而20 cm胶中较宽而扩散.在8 cm胶208 000和126 000条带之间的距离为6.1 mm,而在20 cm胶此距离为32.8 mm.在8 cm胶126 000和97 000条带之间的距离为5.2 mm,而在20 cm胶为20.2mm.20 cm胶中各蛋白条带的移行距离较8 cm胶增加.但是在8 cm胶中蛋白质条带的浓集性较好.在8 cm胶中PMCA 1、2、4的表观相对分子质量分别为153 800、153 500和152 900;在20 cm胶中,则分别为153 1130、125 500和147 400.结论 首次证实20cm和8cm SDS-PAGE均能成功榆测HLE B-3细胞中PMCA 1、2、4的存在,但是检测出的表观相对分子质量有所不同.PMCA 1、2、4的相对分子质量在8 cm胶中分别为153 800,153 500和152 900,而在20 cm胶中分别为153 100,125 500和147 400.PMCA2很可能在20 cm胶长时间的电泳过程中发生了蛋白水解现象.
关键词： 电泳 聚丙烯酰氨凝胶 Ca2+转运ATP酶 白内障 -
RNA干扰治疗慢性心力衰竭大鼠的实验研究
目的利用RNA干扰(RNAi)技术抑制心力衰竭(心衰)大鼠受磷蛋白(PLN)mRNA的表达,改善心脏功能.方法选用SD大鼠40只,对照组7只;其余33只造心衰模型,存活21只,随机分为心衰组、rAAV2-phRi1组,rAAV2-phRi2组,每组7只;rAAV2-phRi导入后30天测定血流动力学,逆转录聚合酶链反应检测心肌PLN mRNA,定磷法测定肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)活性.结果rAAV2-phRi导入30天时,与心衰组比较,rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2对PLN mRNA的抑制效率为85.32%和67.65%,SERCA2a活性增加了104%和74%,血流动力学显著改善(P＜0.05),达到对照组水平(P＞0.05);rAAV2-phRi1的抑制效率、对心功能的改善显著优于rAAV2-phRi2.结论体内水平上,RNAi能够抑制心衰大鼠PLN mRNA表达,改善心脏功能.
关键词： 心力衰竭 充血性 RNA干扰 Ca2+转运ATP酶 大鼠 -
外源性钙调素入核转运及其在大鼠心肌肥厚时的变化
目的探讨大鼠心肌细胞核对外源性钙调素入核转运的调节机制及其在大鼠心肌肥厚时的变化.方法制备腹主动脉缩窄心肌肥厚大鼠模型、差速离心提纯心肌细胞核、酶学方法测定钙-ATP酶活性、荧光分光光度计测定荧光标记钙调素向细胞核转入量.结果离体纯化的大鼠心肌细胞核在ATP存在下,外源性钙调素经核孔向核内转运量具有显著钙离子浓度依赖性,随核外钙离子浓度的增加而递增(P<0.05).在钙离子浓度为10-3 mol/L时,钙-ATP酶抑制剂thapsigargin (5 μmol/L)、兰尼碱受体拮抗剂钌红(ruthenium red ,50 μmol/L)和IP3受体拮抗剂肝素 (10 μg/ml)使外源性钙调素的细胞核孔转运分别降低90%、20%和89% (P<0.05).腹主动脉缩窄术后4周大鼠心肌显著肥厚,伴有明显的血流动力学异常,与对照组相比,腹主动脉缩窄心肌肥厚大鼠外源钙调素入核转运明显减少 (P<0.05),心肌细胞核钙-ATP酶活性显著下降 (P<0.001).结论外源性钙调素入核转运可能受核外钙离子浓度和核钙摄取、释放系统所调节,心肌肥厚时,钙调素入核转运减少、心肌细胞核钙-ATP酶活性下降,可能在相对稳定核功能紊乱的调节中起负性反馈作用.
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腺苷A1受体拮抗剂DPCPX对脑神经元低氧复氧损伤的影响
目的 观察腺苷A1受体拮抗剂DPCPX对脑神经元低氧复氧(H/R)损伤的影响及其机制.方法 通过建立体外培养大鼠大脑皮质神经元H/R损伤模型,观察终浓度分别为0(对照组)、25、50、100nmol/L的DPCPX对常氧(低氧0h)和低氧暴露8、12、24h后复氧24h的H/R神经元乳酸脱氢酶(LDH)释放量的影响,并检测了100nmol/L DPCPX对低氧暴露12h的H/R神经元丙二醛(MDA)含量及黄嘌呤氧化酶(XO)、Ca2+-ATP酶活性的影响.结果 与对照组比较,100nmol/L DPCPX显著增加低氧暴露12h的H/R神经元LDH释放量(P<0.05),明显升高其MDA含量(P<0.01)和XO活性(P<0.05),明显降低其Ca2+-ATP酶活性(P<0.05).结论 DPCPX可加重培养神经元H/R损伤,其机制可能包括降低神经元抗氧化能力及Ca+-ATP酶活性.
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性激素对老龄大鼠颏舌肌细胞肌浆网Ca2+-ATP酶活性及其基因表达的影响
目的:观察雌、雄激素对老龄大鼠颏舌肌细胞肌浆网(SR)Ca2+-ATP酶活性及其基因表达的影响,探索性激素影响上气道稳定性的机制.方法:将24只老龄雄性大鼠随机分为3组:老龄对照组、老龄雌激素组(肌注苯甲酸雌二醇,每次0.1 mg/kg,每周2次,共4周)和老龄雄激素组(肌注丙酸睾酮,每次2.5 mg/kg,每周2次,共4周).采用定磷法检测颏舌肌SR Ca2+-ATP酶活性,荧光定量RT-PCR测定SR Ca2+-ATP酶mRNA表达的变化.结果:与对照组相比,老龄雌激素组颏舌肌SR Ca2+-ATP酶活性[前者34.24 ± 6.14 μmol Pi/(mg protein·hour),后者 38.39 ± 8.49 μmol Pi/(mg protein·hour)]及其mRNA表达水平(前者0.029 7 ± 0.014 0,后者0.031 4 ± 0.017 4 )差异无统计学意义(P＞0.05);老龄雄激素组SR Ca2+-ATP酶活性[22.91 ± 4.56 μmol Pi/(mg protein·hour)]下降到对照组的67%(P＜0.01),其mRNA表达水平(0.017 2 ± 0.008 6)亦明显下降(P＜0.05).结论:雄激素可能通过降低颏舌肌SR Ca2+-ATP酶活性、抑制其mRNA的表达而影响老龄大鼠颏舌肌的功能;而雌激素没有此项作用.
关键词： 雌激素类 雄激素类 呼吸肌 肌浆网 Ca2+转运ATP酶 -
转基因过表达肌浆网钙ATP酶基因治疗慢性心力衰竭的实验研究
目的研究肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)转基因在非缺血性和缺血性心力衰竭中的治疗价值.方法构建含SERCA2a cDNA的重组腺病毒和腺相关病毒载体,制备腹主动脉缩窄和心肌梗死心力衰竭两种心衰大鼠模型,分别采用经膈将病毒液(2×1011病毒颗粒)注入心包腔,和局部心肌注射方法导入病毒,术后10～30 d经颈动脉插管至左心室进行血流动力学检测.结果重组腺相关病毒rAAV2-SERCA2a导入主动脉束扎心衰大鼠心包腔后10 d、30 d其血流动力学与对照治疗组(rAAV2-EGFP)组相比有明显改善,30 d左室收缩压(LVSP)、左室内压大上升速率(+dp/dt)、左室内压大下降速率(-dp/dt)分别提高57%(94 mm Hg vs 147 mm Hg)、110%(5350 mm Hg/s vs11225 mm Hg/s)和99.8%(4198 mm Hg/s vs 8390 mm Hg/s),左室舒张末压(LVEDP)则降低60%(22 mm Hg vs 9 mm Hg).转导SERCA2a后,rAAV-SERCA2a导入组在30 d时SERCA2a蛋白质表达明显高于心衰组和rAAV2-EGFP导入组,达到对照组大鼠水平.重组腺病毒rAV-SERCA2a导入心肌梗死心力衰竭心衰大鼠心肌后21 d血流动力学明显优于rAAV2-EGFP导入组,LVSP、+dp/dt和-dp/dt分别提高28%(86 mm Hg vs 110 mm Hg)、41%(4272 mm Hg/s vs 6026 mm Hg/s)和71%(2789 mm Hg/s vs 4756 mm Hg/s),LVEDP则降低70%(3.89 mm Hg vs-5.34 mm Hg),但未能纠正至对照组水平.结论重组腺相关病毒rAAV2-SERCA2a和腺病毒rAV-SERCA2a,介导SERCA2a在大鼠心肌过表达,可有效改善心衰大鼠模型血流动力学状况.
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过量氟对肾细胞内游离钙及钙泵的影响
目的探讨过量氟对肾细胞内游离钙([Ca2+]i)及钙泵(Ca2+-ATPase)的影响及[Ca2+]i在肾损害发生机制中的作用.方法应用饮水投氟方式喂养Wistar大鼠20周和原代培养肾小管上皮细胞染氟,采用生物化学方法检测血清内离子钙和总钙水平及肾细胞Ca2+-ATPase活性变化;使用Ca2+指示剂Fura-2测定肾细胞[Ca2+]i.结果肾细胞[Ca2+]i水平在常食投氟组和偏食投氟组较相应对照组明显增多;暴露于低钙高氟环境中的大鼠血清总钙降低,离子钙降低达到显著程度,该组肾细胞的钙泵(Ca2+-ATPase)活性比富钙投氟组明显低;低氟(1.0～5.0 mg/L)处理肾小管上皮细胞钙泵活力明显增高,但随着氟水平的提高(＞7.5 mg/L),Ca2+-ATPase活力明显下降.结论高氟直接抑制钙泵活性很可能造成肾细胞内[Ca2+]i潴留,而[Ca2+]i升高很可能是过量氟导致肾损害的一种重要机制.
关键词： 氟化物 肾 钙 离子 Ca2+转运ATP酶 -
D-α-生育酚调节蛋白激酶C活性对糖尿病视网膜病变的影响
目的探讨蛋白激酶C(PKC)在糖尿病视网膜病变(DR)中的作用和D-α-生育酚对糖尿病视网膜毛细血管组织病理的影响.方法实验大鼠分为4组:正常对照组(C组)、D-α-生育酚处理的正常对照组(T组)、糖尿病组(D组)、D-α-生育酚处理病鼠组(DT组).血糖、HbA1c和D-α-生育酚含量以及原位PKC、ATPase活性在处理后6个月被检测,毛细血管床形态立体定量评估DR.结果病程6个月时,D组大鼠深、浅层毛细血管呈现周细胞减少、基底膜增厚的特征性改变,成模6个月后糖尿病大鼠视网膜PKC活性显著增高＞100%,D-α-生育酚可阻止此升高.同一大鼠视网膜,D-α-生育酚也可阻止糖尿病诱导的Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力下降.D-α-生育酚可显著改善糖尿病视网膜微血管周、内皮细胞截面积和深浅层毛细血管基底膜厚度,而对血糖、HbA1c无影响.结论糖尿病诱导的组织病理异常可能大部分由PKC介导,D-α-生育酚可改善糖尿病视网膜毛细血管超微结构.
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毛囊角化病的分子遗传学研究进展
毛囊角化病由位于12q23-q24.1上一种编码肌浆网/内质网肌浆蛋白ATP酶(SERCA)的ATP2A2基因突变所致.近年来国内外学者对该病进行了深入的研究,从分子遗传学角度阐述其发病机制.关于ATP2A2基因突变与钙泵结构功能改变的相关性、基因型与临床表型的关系以及小鼠模型等方面的研究有新进展.
关键词： 角化病 毛囊 Ca2+转运ATP酶 基因突变 -
TNF-α的心肌负性肌力作用机制研究
目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对心肌的负性肌力作用机制.方法:采用离体大鼠乳头肌张力测定,细胞内双波长钙荧光检测和ATP酶分析方法.结果:①TNF-α抑制大鼠右心室乳头肌的收缩力,20 U/ml和200 U/ml TNF-α灌流10 min后,乳头肌收缩力分别减小到对照的91%和76%(P均<0.01);②TNF-α处理后对心肌细胞钙瞬态变化幅度无明显影响(0.97±0.05 vs 0.95±0.07,P>0.05);③TNF-α明显抑制肌浆网Ca2+-ATPase活性,平均抑制率达到20%;④TNF-α拮抗肌浆网Ca2+-ATPase对底物中不同水平的Ca2+和ATP的正反应性;⑤TNF-α对肌膜Ca2+-ATP酶和Na+/K+-ATP酶活性无明显抑制作用.结论:TNF-α抑制心肌收缩力的负性肌力作用机制可能部分与心室肌浆网Ca2+-ATP酶活性下降有关,而与膜上的Ca2+-ATP酶和Na+/K+-ATP酶活性无关.
关键词： 肿瘤坏死因子 Ca2+转运ATP酶 Na+/K+-ATP酶 肌浆网 -
原发性高血压患者红细胞[Ca2+]i浓度变化及影响因素
目的观察原发性高血压患者红细胞[Ca2+]i,多巴胺β羟化酶及ATP含量变化并分析其结果. 方法测定35例高血压患者的红细胞[Ca2+]i、ATP、血清多巴胺β羟化酶活性、血糖及血浆胰岛素含量,并以30例健康成年人为对照. 结果高血压患者的红细胞[Ca2+]i、ATP、多巴胺β羟化酶均明显高于对照组(P<0.05,P<0.01),但血糖与胰岛素未见明显变化. 结论高血压患者血清多巴胺β羟化酶活性增强伴随ATP与[Ca2+]i升高.
关键词： 高血压 红细胞 多巴胺β羟化酶 腺苷三磷酸 Ca2+转运ATP酶 -
实验性面神经麻痹面肌Ca2+-ATP酶活性观察
目的:探讨面瘫时眼轮匝肌(眼肌)和口轮匝肌(口肌)损伤程度差异(损伤差)的机制.方法:应用酶组织化学及图象分析技术观察眼肌和口肌失神经支配后Ca2+-ATP酶的活性变化.结果:眼肌和口肌均由Ⅰ型及Ⅱ型肌纤维构成,眼肌以Ⅰ型肌纤维为主,口肌以Ⅱ型肌纤维为主.失神经支配后,眼肌酶活性减弱程度大于口肌.结论:眼肌酶活性损失大于口肌,判定面瘫程度用局部评价系统是合理的.
关键词： Ca2+转运ATP酶 面神经麻痹 面部肌肉 组织细胞化学 -
肌浆网钙泵在心房颤动患者心房肌中的表达
目的:研究肌浆网钙泵在调节心房颤动(AF)患者心房肌细胞内Ca2+稳态中的作用.方法:慢性AF患者10例(AF组),对照组6例.采用三电极直流等离子体原子发射光电直读光谱法测定二级心房肌细胞内Ca2+含量,采用免疫组化和Western blot技术测定心房肌肌浆网(SR)钙泵(Ca2+-ATPase)蛋白质表达的变化.结果:AF组心房肌细胞内Ca2+含量较对照组高4.4倍以上[(1329.63±796.57)μg/ml vs(301.67±30.89)μg/ml,P＜0.01];SR Ca2+-ATPase蛋白质的相对含量明显低于对照组(0.74±0.07 vs1.02±0.04,P＜0.05).结论:慢性AF患者心房肌细胞内Ca2+超载,SR Ca2+-ATPase功能减低是细胞内Ca2+超负荷的重要因素.
关键词： 心房颤动 Ca2+转运ATP酶 心肌 -
维药迪娜口服液对急性肝损伤小鼠肝脏组织MDA、GSH-Px含量及Ca2＋-ATPase活性的影响
目的：探讨维药迪娜口服液对四氯化碳（CCl4）致急性肝损伤小鼠肝组织丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力及 Ca2＋转运 ATP 酶（Ca2＋-ATPase）活性的影响及其保肝作用机制。方法取小鼠60只随机分成正常对照组、模型组、阳性对照药联苯双酯组（3．75 mg／kg）及迪娜口服液低、中、高剂量组（分别为4．78、9．55、19．10 g 迪娜口服液／kg 体质量，相当于人用量95．5 g／d 的5、10、20倍），每组10只。各实验药物组及阳性对照组分别按剂量灌胃给药0．2 mL／10 g 体质量，正常对照组、模型组给予等容量蒸馏水；连续给药7 d，禁食不禁水12 h，除正常对照组外，其他各组动物腹腔注射0．15％CCl4-花生油溶液（0．1 mL／10 g）。造模24 h 后取肝脏做组织匀浆，检测 MDA 含量、GSH-Px 活力与 Ca2＋-ATPase 活性的变化。结果与正常对照组比较，模型组 MDA含量明显升高，GSH-Px 活力与 Ca2＋-ATPase 活性均明显下降，差异有统计学意义（P ＜0．05）；与模型组比较，阳性对照组和迪娜各剂量组 MDA 含量均降低，GSH-Px 活力及 Ca2＋-ATPase 活性提高，其中迪娜中剂量组 MDA 含量降低及组织 Ca2＋-ATPase 活性提高为明显（P ＜0．05），迪娜高剂量组 GSH-Px 活力上升较为明显。结论迪娜口服液对 CCl4所致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用，其机制可能与清除自由基损伤和保护酶活性有关。
关键词： 迪娜口服液 急性肝损伤 丙二醛 谷胱甘肽过氧化物酶 Ca2+转运ATP酶 -
失血性休克大鼠血管平滑肌细胞钙超载的三磷酸腺苷酶机制
目的探讨失血性休克大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙超载的三磷酸腺苷(ATP)酶机制. 方法雄性Wistar大鼠24只,随机分为对照组(C组)、休克开始组(S0组)、休克后2,4 h组(分别为S2和S4组),每组6只.以改良Wigger法,即股动脉插管放血并维持血压40 mm Hg 2 h建立失血性休克大鼠模型,观察休克后大鼠VSMC胞浆游离钙离子浓度及细胞膜、线粒体膜Ca2+-ATPase,Na+-K+-ATPase活性变化. 结果 C、S0、S2、S4组VSMC胞浆游离Ca2+浓度平均通道荧光对数值分别为2.03±0.15、2.37±0.32、2.55±0.46、2.80±0.43, 呈休克时间依赖性升高,S0组显著大于C组(P<0.05), S2、S4组非常显著地大于C组(P<0.01).细胞膜Ca2+-ATPase活性:C组为(36.0±7.2)μmol*mg-1*h-1;S0组[(35.3±8.5)μmol*mg-1*h-1]与C组比较,差异无显著性意义;S2、S4组分别为(26.5±6.9)、(24.3±4.7)μmol*mg-1*h-1,均显著低于C组(P<0.05和P<0.01);细胞膜Na+-K+-ATPase活性:C组为(34.0±5.8)μmol*mg-1*h-1;S0、S2组分别为(37.3±6.9)、(32.2±6.3)μmol*mg-1*h-1,与C组比较,差异无显著性意义;S4组为(27.0±4.9)μmol*mg-1*h-1,明显低于C组(P<0.05).线粒体膜Ca2+-ATPase活性:C组为(8.8±2.3)μmol*mg-1*h-1,S0、S2、S4组分别为(10.7±2.4)、(13.5±3.1)、(11.2±3.4)μmol*mg-1*h-1,均显著高于C组(P<0.05);线粒体膜Na+-K+-ATPase活性:C组为(5.3±1.1)μmol*mg-1*h-1 ;S0、S2组分别为(10.1±1.7)、(9.7±1.8)μmol*mg-1*h-1,非常显著地高于C组(P<0.01),S4组为(7.3±1.2)μmol*mg-1*h-1,显著高于C组(P<0.05). 结论休克后VSMC出现钙超载,其机制可能与休克后VSMC细胞膜Ca2+-ATPase、Na+-K+ -ATPase活性下降以及线粒体膜Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性升高有关.
关键词： 休克 失血性 Ca2+转运ATP酶 Na+-K+交换ATP酶 血管平滑肌细胞 钙超载
