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中国人群中发现的主要弱D型——弱D15个体的分子背景研究
为了探讨中国汉族人群弱D15型个体的Rh血型系统血型血清学表型及分子背景,采用常规血型血清学技术检测RhD抗原弱阳性个体Rh D、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因;标本测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目.结果表明,血型血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的人群中,有18例为弱D15型(占D抗原弱阳性表型56%),RHD基因全长编码区序列分析发现其第6外显子有一处碱基突变:845G＞A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;检测Rh小因子有3种表型CcEe(2例)、CcEe(2例)、ccEe(14例),分别占弱D15型的11%、11%、78%,血清学检测结果与分子生物学检测结果一致.RHD杂合性试验鉴定显示仅表型为CcEe的2例标本为纯合型RHD+/RHD+,提示基因型为DCe/DcE;其余为杂合型RHD+/RHD-,提示基因型分别是DCe/dce和DcE/dce.结论:弱D15型是中国人群中主要的弱D型,其中大部分为杂合型.
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RH血型系统遗传学研究进展
1940年Landsterner和Wiener用印度恒河猴红细胞免疫兔子，发现兔子的抗恒河猴红细胞抗血清，可以凝集大部分白人的红细胞，进而发现了RH血型系统。半个世纪以来，关于RH血型遗传机理的假说，众说纷纭。其中比较著名的有Fisher-Race学说及Wiener学说等。20世纪90年代，随着分子生物学技术的发展，科学家提出了崭新的观点来解释RH血型系统的遗传。RH系统由1号染色体短臂上两个高度同源的基因RHD和RHCE编码。本文就RH血型系统近几年的研究作一综述。
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深圳地区献血者Rh表型和基因型分布调查
目的探讨Rh阴性个体的分子基础.方法对1999年6月～2002年5月共83 722名首次献血者,应用血清学方法检测样本Rh表型,对部分Rh阴性、弱D表型的RHD基因编码区全长进行序列分析,并应用限制性片段长度多态性(RFLP)技术或双管PCR法分析RhD基因型.结果中国人Rh阴性率(IAT检测)为0.3%;弱D表型个体(包括弱D型、部分D型和其他弱D形式)概率约0.1‰;在IAT确认的Rh阴性者中,RHD基因检出率为36.0%,D放散型(Del)占24.3%.Del个体以RHD 1227A等位基因为主,纯合子占33.3%(9/27);表型为CCee的Del个体占22.2%(6/27),均为纯合子.在真实RhD阴性个体(吸收放散试验排除Del个体)中,RHD 基因检出率为15.5%,以携带RHD-CE(2-9)-D2等位基因为主(占真实RhD阴性个体的11.9%).另外,在IAT确认的Rh阴性者中,如果排除无效基因携带者,E抗原的频率仅为0.018%.结论中国人RhD阴性者的分子背景复杂,且与高加索人和非洲黑人存在较大差异,高频率的Del表型个体和RHD-CE(2-9)-D2等位基因携带者是中国人群Rh阴性个体分子背景的特点.
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RHCE基因分子遗传学及其临床应用研究进展
Rh血型是复杂的血型系统,Rh抗原能引起严重的免疫反应.近年来临床上对RhD抗原引起的免疫性输血反应和新生儿溶血病的成功预防,使人们开始关注红细胞上的其他RH抗原,尤其是与RhD紧密相关的RHCE抗原.据世界各国报道的RhE/e和RhC/c引起的免疫反应分别可达到14.0％和10.7％[1],目前对Rh系统的研究大部分还是集中在RhD抗原的研究,但现在针对C/c和E/e抗原的研究已经越来越多,尤其是国外针对RhCE抗原在输血反应及新生儿溶血病方面的研究已取得一定进展.
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长沙地区汉族RhD阴性个体RHD基因多态性研究
目的:研究长沙地区人群Rh阴性个体RHD 基因多态性的分布及血清学表型与RH 基因型之间的关系.方法:应用PCR-SSP技术检测长沙地区108名Rh阴性献血者的RHD 基因和RHCE基因.结果:108例Rh阴性个体中,ccee表型66例、Ccee32例、CCee 7例、CcEe2例、ccEe1例;108例Rh阴性个体中68例RHD基因外显子完全缺失、24例完整、16例部分缺失.吸收放散试验检测出21例RhD放散型. 结论:长沙汉族Rh阴性人群的RHD基因结构呈现多态性,常规血清学鉴定的RhD阴性者中存在较高比例的RhD放散型(Del型),且有可能带有完整的RHD基因.携带D基因的吸收放散试验阴性个体中具有C抗原者比例较高,但亦有cc表型存在,有别于文献中认为全属RhC抗原表达者的报告.
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PCR-SSP RHD基因定型方法的初步应用
目的采用序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)进行RHD基因定型.方法采用新近报道的PCR-SSP RHD定型方法检测10例RhD阳性个体,包括2例哈萨克族人、2例蒙古族人、2例藏族人和4例维吾尔族人,以及11例RhD阴性个体(汉族10例、维吾尔族人1例),并通过测序和内含子检测分析1例汉族个体的RHD基因型.结果全部样品的PCR-SSP检测结果与血清学表型相符,1例汉族RhD阴性个体鉴定为D放散型,携带RHD1227A等位基因,1例个体的检测结果提示携带融合RHD基因.测序分析显示该融合基因的第1、2和第10外显子序列与正常RHD基因相应外显子相同,而缺失其余外显子,由于RHD基因和RHCE(e)基因的第2外显子序列相同,笔者采用PCR方法检测RHD基因第2内含子,结果为阴性,说明该个体携带的融合基因为RHD-CE(2-9)-D2等位基因.结论 PCR-SSP可用于中国人Rh血型D抗原基因定型.
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RhCE血型基因分型与血清学分型的比较研究
目的 对中国汉族、新疆维吾尔族和哈萨克族人的RHCE基因进行定型,并与血清学分型结果进行了比较.方法 使用PCR-序列特异性引物技术对98例随机非血缘关系汉族RhD阳性样本和RhD和RHD均为阴性汉族人样本230例,新疆维吾尔族人样本72例、哈萨克族人样本18例进行RHCE基因定型.结果 RhD阳性和RhD阴性样本中RHE/RHe等位基因定型结果都与其血清学结果相符;在中国汉族人中,利用RHCE基因第1外显子的nt48的C→G多态性来检测RHC等位基因将产生4.44%的错误,利用109 bp插入序列这一多态性来检测RHC等位基因,将导致4.05%的漏检;表型为RhD阴性的72例随机非血缘关系维吾尔族人和18份哈萨克族人样本的RHE/RHe和RHC/RHc等位基因定型结果与血清学的一致,没有发现假阳性和假阴性.结论 使用PCR-序列特异性引物技术对RHE/RHe和RHc进行基因定型结果准确,与血清学结果相符;利用RHCE基因第1外显子第48位多态性来检测RHC等位基因会因RHc在此位点的突变干扰而导致假阳性结果;利用109 bp插入序列来检测RHC等位基因会因109 bp的缺失而导致假阴性结果,对RHC等位基因定型必须用两种以上的多态性来检测.
关键词： RHCE基因 基因定型 表型 聚合酶链反应.序列特异性引物 -
Rh复合体的结构与功能
Rh血型系统发现距今已有60多年,在临床输血医学中是一个复杂且具有多型性的血型系统,由两个同源性很高的RHD和RHCE基因编码的具有12次跨膜的RhD和RhCE蛋白,RHAG基因编码Rh有关糖蛋白RhAG,这些蛋白和其他膜蛋白(LW,IAP,GPB,Duffy,带3)在红细胞膜上形成一个核心复合物,参与氨的转运.在临床输血中,Rh血型系统可引起胎儿和新生溶血病(HDN)和输血反应.RH基因遗传背景存在种族差异,同时也存在多种类型的RhD变异体,现将Rh血型系统的分子遗传情况及其在临床的应用综合如下.
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华北地区汉族人群Rh(D)抗原弱表现型个体的分子遗传机制研究
目的 探讨汉族人群非血缘关系Rh(D)抗原弱阳性个体的血清学表型及分子遗传机制.方法 采用常规血清学技术从非血缘关系随机献血者中筛检Rh(D)抗原弱阳性个体(包括弱D型、部分D型),对其进行Rh D、C、c、E、e抗原表型的检测;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法同时检测其RHD基因和RHCE基因;测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定其RHD合子型.结果 血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的有32例个体,占无关供者人群比率为0.015%, 其中18例个体为弱D15 型(845G＞A),1例为弱D12型(830G＞A), 1例为携带DEL等位基因(1227G＞A)的弱D型, 8例为部分D表型中的DⅥ Ⅲ型(RHD-CE(3-6)-D), 1例为部分D表型中的DⅤa(Hus) (RHD-CE(5)-D), 3例标本10个外显子检测均未见异常.Rh小因子检测有3种表型CcEe(4例)、Ccee( 10例)、ccEe(18例),其血清学与分子生物学检测一致.RHD杂合性试验鉴定显示仅4例标本为纯合型RHD+/RHD+,其余为杂合型RHD+/RHD-.结论 汉族人群D抗原弱阳性比率明显少于高加索人,汉族人群D弱表现型中,弱D15型频率高;部分D的弱表现型中,DⅥ Ⅲ型占主要比例.
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在中国人群中首次发现1例Rh血型弱D12型
目的分析鉴定1名RhD抗原弱阳性个体的血型血清学表型及分子背景.方法采用常规血型血清学技术检测Rh D、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因,并测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目.结果血型血清学试验证实该标本为D抗原弱阳性表型,与相应Rh抗血清反应为C-c+E+e+;SSP-PCR检测显示RhCcEe基因定型结果与血型血清学完全一致,且有完整的RHD基因; 但RHD基因全长编码区序列分析发现该标本的RHD第6外显子存在1处碱基突变:830G>A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;RHD杂合性试验鉴定显示为RHD+/RHD-杂合型,推测该个体基因型可能为DcE/dce.结论对照国内外文献报道和GenBank记录的基因序列,该个例为在中国人群中首次发现的弱D12 型.
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RHCE基因结构研究
目的研究中国人RHCE基因结构特征.方法根据文献设计RHCE基因检测的引物,采用PCR-SSP法检测RhD阳性100例,RhD阴性300例的RHCE基因结构.结果 RHE/e和RHC/c等位基因定型结果表明,RHE/e和RHc的定型结果与血清学的一致,没有发现假阳性和假阴性.利用RHCE基因外显子1的nt48的C→G多态性检测RHC等位基因将产生6.06%的假阳性,未发现假阴性.利用109bp插入序列这一多态性来检测RHC等位基因,总的假阴性率为4.00%,没有发现假阳性.结论 RHE/e和Rhc基因定型可获得准确结果,对RHC等位基因的定型必须使用2种方法或利用至少2个以上的多态性位点.
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一种新的RHD等位基因的分析鉴定
目的分析新RHD等位基因的基因结构.方法采用聚合酶链式反应(PCR)技术、序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)技术以及DNA序列分析技术,分析1例RhD阴性个体的RHD基因.结果序列特异性引物PCR(PCR-SSP)检测个例RHD基因的第3～7、9～10外显子,结果显示所检测的外显子均为阴性;检测RHD基因第2内含子(Din2)和Rh下游盒子区Box 3,结果显示,Din2为阴性,Box3为阳性;检测RHCE基因,结果显示基因型为Ccee.应用3个PCR反应检测个例RHD基因的第10内含子(Din10),结果显示为阴性.个例的RHD基因编码区全长序列分析结果显示其第1、2外显子序列与正常RHD基因一致,其余外显子缺失.结论综合分析实验结果,个例为RHD抗原阴性,RHD基因阳性的个体,携带新的RHD-CE(2-10)融合等位基因.
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118例汉族人群IAT检测RhD阴性个体RHD基因多态性分析
目的 观察汉族人群IAT检测RhD阴性个体RHD基因多态性.方法 采用常规血清学技术检测Rh D、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法同时检测RHD基因和RHCE基因.结果 抗球蛋白试验(IAT)证实的118例RhD阴性个体中,PCR-SSP方法检测RHD基因结果有28例Del表型个体(23.7%).在余下的90份真正RhD 阴性标本中,有69份标本(76.7 %)RHD基因完全缺失;21份标本带有不表达RHD基因.Del表型个体均带有C抗原,带有不表达RHD基因的真正RhD 阴性个体大多表现为RhC阳性.结论 汉族人群IAT证实的RhD阴性个体呈现RHD基因结构多态性,不表达RHD基因主要以RHD-CE(2-9)-D2为主.
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RHCE* ce(308C＞T)突变型等位基因Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
目的 建立Rh血型系统RHCE* ce(308C＞T)突变型等位基因的Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法,筛查携带该等位基因的个体,并对其RhCE血型抗原进行鉴定分析.方法 针对RHCE基因c.308C＞T突变位点设计特异性引物及Taqman-MGB探针,采用已知携带该突变位点的标本作为阳性对照,建立实时荧光定量PCR方法.应用该方法对800例RhD阴性标本、1 000例RhD阳性标本以及400例D放散型标本进行突变筛查,同时随机抽取200例标本进行RHCE基因外显子2直接测序.对筛查出携带该突变型等位基因的标本进行RHCE基因外显子2测序确证,同时应用多重连接依赖式探针扩增(MLPA)基因检测结合测序方法对其进行Rh血型基因型鉴定,并进行Rh血型血清学检测.此外,采用6种针对不同抗原表位的单克隆抗体对Rhc抗原的表达进行血清学鉴定,并采用4种抗-c进行Rhc抗原的流式细胞检测.结果 成功建立RHCE* ce(308C＞T)等位基因的Taqman探针实时荧光定量PCR方法.应用该方法从800例RhD阴性标本中筛查出2例携带该突变型等位基因标本,RHCE基因外显子2测序结果证实存在杂合点突变(c.308C＞T,p.103Pro＞Leu),但在RhD阳性及D放散型标本中未检出此突变.此2例标本的Rh抗原表型均为CCdee,基因型均为Cde/cvde[cv表示RHCE*ce(308C＞T)突变型等位基因].该2例标本的Rhc抗原血清学和流式细胞检测均为阴性,而RhC抗原表达正常.结论 Taqman探针实时定量PCR方法进行RHCE* ce(308C＞T)等位基因检测快速准确,该等位基因可导致c抗原不表达.
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1条突变型RHCE* ce新等位基因的发现
目的 采用新型Rh血型系统的多重连接依赖式探针扩增(MLPA)检测试剂盒,对广州地区收集的200例RhD阴性献血者进行RHCE基因分型.方法 收集RhD阴性献血者200例,从静脉血提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒进行RHCE基因分型和拷贝数定量分析.对MLPA显示的RHCE拷贝数异常的样本,进行RHCE基因外显子1至10测序分析.对发现的杂合突变进行克隆测序.结果 在200例RhD阴性献血者中,MLPA基因分型结果显示有6例标本RHCE等位基因定量拷贝数下降,测序发现RHCE基因外显子2的一个新杂合突变(c.308C＞T,p.103Pro＞ Leu),克隆测序证实了该突变.结论 在中国人群中,首次发现了一条新的突变型RHCE* ce(308C＞ T)等位基因,该等位基因在广州地区RhD阴性献血者中频率为6/400.
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RHCE基因和RhCcEe抗原研究进展
RHCE基因编码RhCcEe抗原,与RHD基因一样,RHCE基因也存在许多基因变异体并形成许多RhCcEe抗原变异体,这些变异体可导致血清学抗原鉴定或基因分型出现一些假阳性或假阴.
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D-变异体的分析——附1例报告
目的 分析1例D--变异体的分子背景.方法 分别采用血清学方法和序列特异性引物PCR (PCR-SSP)方法检测标本RhD、C、c、E、e抗原和RHCE基因,同时序列分析RHAG、RHCE基因全长编码区序列,后进行RHD合子型分析和家系分析.结果 先证者血清学测定Rh表型为D--,PCR-SSP结果为DC-;RHAG第1-10外显子测序显示,编码区与GenBank NC-000006标准序列一致,未观察到形成Oldeide和Duclos-Like抗原的碱基变异,亦未见形成高频抗原Duclos(RHAG1)的RHAG316C＞G突变,所有序列均未见杂合峰;RHCE基因第1-10外显子扩增显示,缺失第3-5外显子,其余外显子序列与标准序列一致,分析第1、2外显子序列为RHC,提示该等位基因为RHCE(e)-D(3-5)-CE(e);家系分析其父母、弟弟的RHAG序列与先证者完全一致,父母Rh血清学表型分别为DCCee和Dc-cEE,其父亲的PCR-SSP和测序结果一致,其母亲PCR-SSP结果DCcEE与测序结果一致,而与血清学结果不符(Dc-cEE),其弟血清学表型、PCR-SSP和测序结果,均与先证者一致,结合RHD合子型分析结果,该家系父母分别为DCe/DC-和DcE/DC-基因型,先证者和弟弟为DC-/DC-.结论 RHCE-D(3-5)-CE等位基因形成D--表型并稳定遗传.
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中国南方汉族和西藏藏族RHCE基因109bp插入序列和733C＞G多态性研究
目的 研究中国南方汉族人群和西藏藏族人群RHCE基因内含子2中109bp插入序列缺失情况和外显子5中733C＞G多态性,并比较2民族间有无差异.方法 收集186例中国南方汉族人样本和50例西藏藏族人样本,应用PCR-SSP方法对内含子2的109bp插入序列和外显子5的733C＞G多态性进行检测,并用测序方法验证.结果 在中国南方汉族人群中携带RhC抗原个体其RHCE基因内含子2中109bp插入序列的缺失率为1.08％,在西藏藏族人群中缺失概率为0,二者缺失率相比无统计学差异(x2=0.02,P＞0.05).2民族所有样本RHCE基因外显子5的733位核甘酸均为G,未发现该位点存在733C＞G多态性.结论 2民族在内含子2的109bp插入序列缺失和外显子5的733C＞G多态性方面未发现二者有差异.在南方汉族人群中针对RHCE基因内含子2的109bp插入序列来检测RHCc基因会因缺失而导致假阴性错误.
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RHCE基因编码区全长测序方法的建立
目的 建立简易的RHCE基因编码区全长测序方法.方法 依据RHCE基因序列的特异性,设计10对特异性引物分别扩增RHCE基因的10个外显子,同时再设计10条测序引物用于测序.将该方法用于检测3例Rh阳性标本、1例Rh阴性标本、1例D-表型标本及1例弱E表型标本.结果 10对特异性引物在统一的PCR条件下成功扩增出RHCE基因的10个外显子,3例Rh阳性标本及1例Rh阴性标本的测序序列与RHCE基因标准序列一致;D-标本PCR扩增和测序结果显示缺失第3、4和第5外显子,提示该个体携带一种新的由RHCE/RHD基因交换形成的等位基因RHCE-D(3-5)-CE;弱E标本测序结果发现在第5外显子存在一处碱基突变(762G＞C),其他外显子测序结果未发现变异.结论 RHCE基因编码区全长测序方法可用于一般实验室进行RHCE基因测序.
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抗-C引起的主侧交叉配合试验凝集1例
抗-C是由于患者Rh血型系统RHCE基因缺失,不表达C抗原,患者红细胞表面缺乏C抗原.患者通过获得性C抗原的刺激后,机体的免疫系统产生免疫性抗-C抗体(IgG类抗体).如患者输注C抗原阳性的血液,抗-C与C抗原结合,形成IC导致溶血性输血不良反应(血管外溶血)或临床无效输血.由于抗-C为IgG类抗体,在盐水介质配血试验中,形不成肉眼可见的凝集反应,容易漏检,给输血安全带来隐患.现将我院2007年发现的1例抗-C阳性,引起主侧交叉配血不合的病例资料分析报告如下.
