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CD138磁珠分选结合间期荧光原位杂交在浆细胞病遗传学诊断中的应用价值
目的:通过CD138磁珠分选(MACS)结合间期荧光原位杂交(I-FISH)技术研究浆细胞病的细胞遗传学特征,阐明MACS-FISH在浆细胞病遗传学诊断中的应用价值,以及探讨我国浆细胞病FISH检测标准化的问题.方法:收集初诊浆细胞病患者232例,其中MM 203例,AL淀粉样变性24例,意义未明单克隆免疫球蛋白血症(MGUS)5例.应用MACS-FISH检测浆细胞病的细胞遗传学异常.比较染色体核型分析、常规间期FISH(C-FISH)与MACS-FISH细胞遗传学异常检出率的差异.按骨髓浆细胞比例分组,比较C-FISH与MACS-FISH的检测敏感性.分析C-FISH、MACS-FISH异常阳性细胞率与浆细胞比例的相关性,以及比较C-FISH和MACS-FISH克隆大小的检出差异.结果:MACS-FISH检出MM、AL淀粉样变性、MGUS的细胞遗传学异常的发生率为分别为85.9％、62.5％和60％.应用染色体核型分析和C-FISH检出MM细胞遗传学异常的发生率分别为20.0％和64.7％,均显著低于MACS-FISH(P ＜0.001).MACS-FISH检出14q32异位、del(14q32)、t(11;14)、+17p13和并存2种及≧3种细胞遗传学异常的阳性率均显著高于C-FISH检测结果(P＜0.05).当骨髓浆细胞比例≦5％时,MACS-FISH的阳性检出率显著高于C-FISH(P=0.001),且MACS-FISH在不同浆细胞比例分组的阳性检出率均无统计学差异;而C-FISH在浆细胞比例≦5％时的阳性检出率显著低于其余3组(P=0.013,P=0.001,P＜0.001).C-FISH组各遗传学异常和MACS-FISH组中+1q21、14q32异位的阳性细胞率与浆细胞比例呈显著正相关(P＜0.05).MACSFISH组各种细胞遗传学异常的克隆大小显著大于C-FISH组(P＜0.001).结论:MACS-FISH可以显著提高浆细胞病细胞遗传学异常的检出率,能更好的反映浆细胞病的细胞遗传学异常发生情况及其克隆大小.MACS-FISH可推荐作为国内浆细胞病遗传学诊断的标准方法,用于MM和SMM的危险分层,以及MGUS、AL淀粉样变性的遗传学诊断和研究.
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免疫磁珠分选两步法纯化原代小胶质细胞
目的 神经系统感染研究需获得纯度高、细胞生物学状态接近体内的小胶质细胞.既往分离纯化方法 不能满足研究需要,需建立新的高效纯化方法.方法 获得小鼠全脑单细胞悬液后,应用磁珠分选阳选法,经过两步分选获得小胶质细胞.用流式细胞仪检测小胶质细胞的纯度,瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态,采用7-AAD染色鉴定分选后细胞的活性.结果 应用免疫磁珠分选一步法可以获得纯度达(59.98 ± 13.61)%的小胶质细胞;两步法进一步将细胞纯度提高至(97.62 ± 1.35)%.该方法 所获得的小胶质细胞活性良好,形态正常.结论 免疫磁珠分选两步法能够稳定地获得高纯度的小胶质细胞,对小胶质细胞的活性和形态无显著影响,可用于后续中枢神经系统急性感染的体外研究.
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CXC受体4阳性表达骨髓间充质干细胞的分选及其骨向分化的能力
目的 研究磁珠分选法分选表面CXC受体4(CXCR4)阳性表达的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分选效率,以及分选后BMSC的增殖、迁移和成骨能力是否受到影响.方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSC,通过生长曲线、成骨成脂诱导分化和流式检测BMSC表面标记蛋白表达,鉴定大鼠BMSC.流式检测细胞表面CXCR4的阳性率,通过生长曲线及克隆形成实验检测细胞的增殖活性及克隆形成能力,Transwell体外趋化实验检测细胞迁移能力,通过检测成骨诱导早期细胞ALP活性和成骨相关基因的表达,分析细胞成骨能力,数据采用单因素方差分析处理.结果 通过全骨髓贴壁法获得具有自我更新和多向分化能力的大鼠BMSC.磁珠分选阳性细胞表面CXCR4表达[(55.13±0.67)％]较未分选组[(6.49±0.59)％]显著增加(LSD-t=63.66,P<0.001).分选阳性细胞的克隆形成能力[(16.22±1.68)％]以及培养后期细胞增殖活性(A450(5 d)=1.40±0.04;A450(7 d)=1.60±0.01)较未分选细胞[CFU=(17.00±1.76)％;A450(5 d)=1.49±0.07;A450(7 d)=1.60±0.12]均无明显变化;而培养早期(第1、3天)分选阳性细胞的增殖活性[A450(1 d)=0.50±0.01;A450(3 d)=0.81±0.05]较未分选细胞[A450(1 d)=0.57±0.01;A450(3 d)=0.96±0.06]稍低[LSD-t1 d=5.208,P1 d=0.002;LSD-t3 d=3.563,P3 d=0.012].分选阳性细胞的基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)定向迁移能力(71.33±5.69)较未分选细胞(23.33±1.53)显著增强(LSD-t=17.211,P<0.001).在成骨诱导早期,分选阳性细胞的Runx2 mRNA(0.93±0.12)较未分选组(0.51±0.14)表达上调(LSD-t=4.703,P=0.003),而ALP活性及ALP mRNA、OCN mRNA的表达均无明显变化(P>0.05).结论 磁珠分选法可有效分选CXCR4+BMSC,显著提高BMSC向SDF-1α的迁移效率,对细胞的增殖活性影响不大.
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磁珠分选法与密度梯度离心法分离精子对辅助生殖结局的影响
目的 比较新型磁珠分选法(MACS-DGC)与传统的密度梯度离心法(DGC)分离精子对辅助生殖(ART)结局的影响.方法 回顾分析2014年1至12月在浙江大学医学院附属妇产科医院生殖中心进行精子DNA碎片率(DFI)检测并进人体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期的病例.根据DFI将病例分为3组:DFI异常(DFI≥20)且使用新型精子磁珠分选法(A组);DFI异常(DFI≥ 20)且使用传统精子密度梯度离心法(B组);DFI正常(DFI＜ 20)且使用传统精子密度梯度离心法(C组).根据受精方式的不同,将常规体外受精(IVF)标记为1组,卵细胞质内单精子显微注射(ICSI)标记为2组.对各组的正常受精率、优胚率、临床妊娠率,胚胎种植率、抱婴率等临床结果进行统计分析.结果 在IVF三组中(A1、B1、C1)正常受精(2PN)率、优胚率、临床妊娠率,胚胎种植率、抱婴率差异均无统计学意义(均P ＞0.05).在高DFI的ICSI患者(A2、B2)中,A2组对比B2组发现优胚率(87.8％比46.3％,P＜0.001)、临床妊娠率(66.7％比29.2％,P=0.031)、胚胎种植率(50.0％比19.5％,P=0.010)、抱婴率(66.7％比25.0％,P=0.016)差异均有统计学意义.结论 新型精子磁珠分选法对比传统梯度分离法对于IVF的临床结果差异无统计学意义,但在ICSI受精周期中临床结局得到了显著改善.
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少量造血细胞RNA提取方法学探讨
骨髓中的造血细胞是一个包括了从多能造血干细胞至成熟细胞不同分化阶段及粒系、淋系等不同分化系列的复杂群体.为了解不同细胞群体各种基因的表达情况,需要采用流式细胞术或磁珠分选出特定的细胞群,再进行RNA提取、PCR等过程.不过造血干/祖细胞等细胞群往往数目不多.而'TRIzol等常规RNA提取方法要求细胞数应该在105以上,因此需要采用特殊的少量细胞RNA提取方法.我们将对两种少量细胞RNA提取方法作一比较.
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体外纯化乳鼠许旺细胞的4种方法比较
背景:许旺细胞是外周神经系统中修复神经损伤及神经疾病的主要种子细胞之一.但是,许旺细胞的来源有限,且由于成纤维细胞的污染,使许旺细胞的纯度受到影响.有学者提出了其他的纯化方法,但每种方法都存在其不足之处而不能很好的满足临床应用的需要.目的:比较差速贴壁消化法、冷喷注法、磁珠分选法和G418筛选法4种体外纯化乳鼠许旺细胞方法的差异.方法:取SD大鼠坐骨神经得到所需神经组织.分别用差速贴壁消化法、冷喷注法、磁珠分选法和G418筛选法纯化许旺细胞.比较4种方法获得细胞的活力,免疫组织化学法鉴定许旺细胞并计算纯度.结果与结论:差速贴壁消化法所得到的细胞纯度稍低,活力尚可;冷喷注法获得的细胞纯度和活力均较高;磁珠分选法获得的细胞纯度和冷喷注法相当,但是活力稍差:G418筛选法活力差,纯度高.
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CD271磁珠体外诱导人胚胎干细胞分化为成骨细胞的可行性
背景:来源于人胚胎干细胞的成骨细胞研究结果引人关注,但是能够产生大量有效的成骨细胞且不含有其他杂细胞的诱导方法仍然没有建立起来.目的:探讨利用CD271磁珠从体外诱导分化的人胚胎干细胞中分选出成骨细胞的可行性.方法:人胚胎干细胞株SYSU-2形成拟胚体6 d,贴壁分化14 d后,通过CD271磁珠分选技术获得CD271阳性细胞,进一步检测CD271阳性细胞核型,表面抗原表达及分化潜能.结果与结论:CD271阳性细胞与骨髓来源的间充质干细胞形态相似,为长梭形,并可在体外保持稳定核型至14代左右.同时,这种细胞也具有与骨髓来源的间充质干细胞相似的表面抗原标记(CD45阴性和CD73,CD105,CD166阳性).分化潜能鉴定证明CD271阳性细胞只能诱导形成成骨细胞.这对于研究成骨发育的机制和为骨组织工程提供足量安全有效的种子细胞都有着重要意义.
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Accutase酶在精原干细胞原代分离中的应用
背景：有研究报道胰酶消化在一定程度上会破坏精原干细胞表面抗原并影响细胞活性，对后续的细胞分选及下游实验有一定影响。Accutae 酶具有蛋白酶和胶原酶的双重活性，在消化结束时无需终止和清洗，有保护细胞表面抗原的特殊作用，因而被应用于多种干细胞的培养及消化传代中。
目的：比较Accutase酶和胰酶在原代消化分离睾丸组织获取精原干细胞中的作用。
方法：新生5-7 d昆明雄鼠45只，取双侧睾丸胶原酶初步消化，混悬液定容后分为Accutase酶组、胰酶组、混合酶组(透明质酸酶+胰酶组)，不同组别小鼠睾丸组织分别于酶消化1，3，5 min后显微镜下观察并拍照，比较各组不同时间点的消化状态及形成单细胞所需的时间；获取单细胞悬液后分别计算单位体积内所得细胞总数及死亡率；通过差速贴壁方法去除间质细胞及支持细胞，经包被有干细胞标志分子 CD90.2的免疫磁珠进行分选，将所得 CD90+及 CD90-细胞用精原干细胞表面标志分子--胶质细胞源性神经营养因子受体α1标记，流式细胞仪检测不同组别CD90+及 CD90-细胞群中胶质细胞源性神经营养因子受体α1精原干细胞的阳性率。
结果与结论：不同类别的消化酶对小鼠睾丸的消化作用有明显差异，其中 Accutase 酶能更快获取单细胞悬液，其细胞团及破膜细胞明显少于胰酶组和混合酶组，其所得细胞总数高于其余2组，而细胞死亡率则低于其余2组。差速贴壁后细胞免疫磁珠分选结果显示Accutase酶组CD90+精原干细胞得率高，流式分选结果显示胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90+细胞为72.24%，高于胰酶组及混合酶组(51.16%，71.27%)；而胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90-细胞比率(15.03%)则低于胰酶组及混合酶组(18.8%，24.23%)。结果表明Accutase酶在分离和获取精原干细胞实验中效果优于胰酶。 -
大鼠CD4+CD25-T细胞的Foxp3基因转染及其表达
背景:调节性T细胞在维持机体免疫应答稳态和免疫耐受方面具有非常重要的作用,但外周血中CD4+CD25+调节性T细胞含量极低,且增殖能力较差.目的:以携带Foxp3基因的慢病毒EGFP+载体转染大鼠CD4+CD25- T细胞,观察其在大鼠CD4+CD25- T细胞中的表达.方法:以免疫磁珠两步法分选大鼠CD4+CD25- T细胞,用携带大鼠Foxp3基因的慢病毒载体体外转染分选的细胞,以转染Foxp3基因的CD4+CD25- T细胞为实验组,EGFP空白质粒组及CD4+CD25- T细胞为阴性对照组,CD4+CD25+ T细胞为阳性对照组.荧光显微镜和RT-PCR分别从蛋白和mRNA水平检测Foxp3基因的表达.结果与结论:成功完成了免疫磁珠的分选,获得了纯度较高的CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+ T细胞,细胞存活率为(94±2)%,慢病毒转染的CD4+CD25- T细胞高表达Foxp3基因.表明以携带Foxp3基因的慢病毒载体系统可有效介导Foxp3基因在大鼠CD4+CD25- T细胞中高表达.
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人外周血巨噬细胞培养及功能鉴定
目的：从人外周血单个核细胞（ PBMC）中分离单核细胞，诱导分化成巨噬细胞并鉴定其功能。方法：应用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中分选CD14＋单核细胞，分离后的细胞用流式细胞仪检测其纯度，用含有10％人AB血清和10 ng／ml人M－CSF的IMDM培养基体外培养CD14＋单核细胞，诱导分化成巨噬细胞，并进行形态特征和吞噬功能鉴定。结果：免疫磁珠法能从外周血中分离到高纯度的CD14＋单核细胞，分选前CD14阳性率为10％，分选后CD14阳性率为85．8％。诱导培养7天后巨噬细胞的直径大可达40～45μm，大部分细胞呈煎蛋状，能有效地吞噬淋巴瘤Raji细胞。结论：从外周血中分离了高纯度的CD14＋单核细胞，诱导形成的巨噬细胞具有吞噬淋巴瘤细胞的功能。
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人胎盘来源的造血干细胞和间充质干细胞的分离及鉴定
目的 建立人胎盘来源的造血干细胞(placenta hematopoietic stem cells,hP-HSCs)和间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,hP-MSCs)的分离方法,并进行鉴定和组分分析.方法 选取10份新生健康婴儿胎盘组织,采用机械破碎法联合磁珠分选法分离hP-HSCs,胎盘绒毛膜组织块贴壁法分离hP-MSCs,利用形态学观察、集落培养、流式细胞术等进行鉴定.结果 hP-HSCs:分离后有核细胞数(total nucleated cell number,TNC)为(11.82±2.46)×108个,TNC回收率≥80％;细胞活性为(99.7±0.3)％;细胞表面抗体CD34+CD45dim表达率为(8.69±0.36)％,CD34+总数为(108.0±6.48)×106个;集落形成总数为(1.88±1.07)×106.hP-MSCs:冻存细胞总数为(40.78±9.35)×107个;细胞活性为(99.0±1.5)％;细胞表面抗体CD34+CD45+表达率为(0.1±0.1)％,CD44+CD105+为(99.6±0.2)％,CD14+CD19+为(0.1±0.1)％,CD90+CD73+为(98.9±0.2)％;且具有良好成脂、成骨分化潜能.结论 成功建立了hP-HSCs和hP-MSCs体外分离培养方法,为胎盘的临床应用奠定了基础,并提供了细胞种子资源.
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成人心肌干细胞的体外培养纯化与鉴定
目的:自成人心脏组织培养获得的细胞中分选得到心肌干细胞,体外培养并鉴定其表面标记. 方法:手术中取下的非心肌病患者心脏组织标本,通过组织块培养法及冲洗获得的细胞,以免疫磁珠进行分选,纯化后的细胞在条件培养基中培养,待增殖至一定数量后进行表面标记的流式细胞鉴定. 结果:心肌组织块培养可获得小、圆、亮细胞,将其冲洗下来后以c-kit磁珠分选,之后在通过胎鼠成纤维细胞制备的条件培养基中培养,可增殖并形成心球样细胞团结构,流式细胞仪鉴定其为c-kit+. 结论:通过本实验的方法可以在成人心肌组织中分离并纯化得到c-kit+的心肌干细胞,其可在体外增殖形成典型的心球样细胞结构并可保持表面的c-kit干细胞标记.
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干细胞表面标志物在牙髓干细胞中的表达
目的:探讨磁珠分选后培养的人牙髓干细胞的表面标记抗原随培养代数增加的变化情况.方法:改良组织块法培养的人牙髓细胞,至第2代(P2)时,用磁珠方法分选出STRO-1阳性细胞,用流式细胞术分别检测P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8代的干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、CD166、STRO-1.取P3代细胞,分别进行成骨诱导和成脂诱导.21 d后,分别行茜素红染色和油红O染色,观察矿化物形成情况和脂滴形成情况,同时以未诱导细胞为对照.结果:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,CD73、CD90、CD105、CD166的表达比较稳定,茜素红染色可见矿化结节形成,油红O染色显示形成大量脂滴.结论:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,其他干细胞标志物比较稳定.
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免疫磁珠法纯化人外周血CD4+T细胞
目的:采用Dynal免疫磁珠法从人外周血单个核细胞(MNC)中分离和纯化CD4+T细胞.结果:经过流式细胞仪测定纯度达到(96.4±2.6)%,0.2%台盼兰染色细胞活力为(96.9±3.6)%,增殖试验表明分离后的CD4+T细胞对植物血凝素(PHA)的刺激保持了良好的增殖能力,为进一步纯化CD4+T细胞的生物学特性创造了条件.
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心脏干细胞分泌的 exosome对氧化应激下心肌细胞的保护作用研究
目的：探索心脏干细胞分泌的外泌体（exosome）对体外氧化应激所致心肌细胞凋亡的保护作用。方法磁珠分选出 Sca-1＋CPCs 进行培养，流式细胞术鉴定；分离 CPCs 分泌的 exosome，并用 Western blot 进行表型鉴定和用 Nanosight进行粒径分析；免疫荧光法及 PKH26标记技术观察心肌细胞 H9c2对 exosome 的摄取作用；通过 H2 O2处理诱导 H9c2细胞凋亡，用 Western blot 检测对照组与 CPC-exo 处理组凋亡相关蛋白水平，观察 exosome 对心肌细胞凋亡的保护作用。结果①磁珠分选出的细胞用免疫荧光检测发现 Sca-1呈阳性表达，且纯度可达95％以上。②从 Sca-1＋CPCs 细胞培养上清中提取出的 exosome 其表面标记蛋白 CD63呈阳性表达，Nanosight 结果显示大部分粒子都处于（82.33±3.06） nm（n ＝3）。免疫荧光显示 H9c2细胞中可见大量 PKH26标记的 exosome 在胞质聚集。③Western blot 结果显示，与对照组相比，CPC-exo 处理组总的 caspase-3表达不变，而激活型caspase-3表达水平明显降低（P ＜0.05）。结论CPCs 分泌的 exosome 可被 H9C2细胞所摄取，可以保护心肌细胞由于氧化应激引起的凋亡。
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人工合成树状串联hTERT表位肽对mDC表型和功能的影响
目的 通过对树状串联hTERT表位肽(MAP)与无肽刺激组髓样树突状细胞(mDC)的相关检测,研究MAP肽对mDC的表型和功能的影响.方法 人工固相合成四分支的MAP肽,免疫磁珠分选mDC,流式细胞技术检测相关表面分子.ElISA分别检测两组mDC培养基的IL-12p70含量,并作统计学分析.结果 人工合成MAP肽纯度高(95.26 %),免疫磁珠分选mDC纯度为72.59 %,相比于无肽刺激组mDC,MAP肽刺激组成熟(培养第9天)时MHCⅡ类分子为83.90 %、MHCⅠ类分子为91.08 %,CD86:77.03 %,CD83:92.16 %;IL-12p70的含量也大于无肽刺激组,且有统计学差异.结论 人工合成hTERT的MAP肽能足够强的激活mDC,刺激其成熟和功能的表达,可作为mDC抗肿瘤疫苗的刺激肽结构.
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免疫磁珠法分离胆囊癌CD133阳性细胞及其生物学特性鉴定
目的 建立胆囊癌CD133+细胞分离纯化的方法,观察胆囊癌CD133+细胞和CD133-细胞生物学特性的差异.方法 流式细胞仪检测胆囊癌GBC-SD、SGC996细胞中CD133所占百分比,免疫磁珠法分选CD133+细胞亚群,免疫荧光法定位检测CD133蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD133 mRNA表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测CD133+组和CD133-组细胞增殖能力及对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药特性的差异,单克隆形成实验观察单个CD133+细胞生长特性.结果 胆囊癌GBC-SD、SGC996细胞中CD133+亚群所占相对百分比为(68.5±2.9)％、(0.3±0.2)％.GBC-SD组CD133 mRNA相对灰度值(0.6466±0.0259)显著高于SGC996组(0.2181±0.0108,P＜0.01).CD133蛋白定位于细胞膜表面,并在GBC-SD细胞中呈强表达.人胆囊癌GBC-SD细胞分选后,CD133+组CD133蛋白表达明显强于CD133-组.CD133+组中CD133+亚群所占比例为(90.4±0.9)％.CD133+组CD133mRNA相对灰度值(0.7734±0.0217)显著高于CD133-组(0.2146 ±0.0174,P＜0.01).CD133+组细胞增殖能力明显强于CD133-组(P＜0.01).经5-Fu(0.1μg/ml)处理后,CD133+组细胞生存率明显高于CD133-组(P＜0.05).单克隆形成实验结果示单个CD133+细胞可形成新的细胞克隆,且CD133+组[(36.25±2.99)％]细胞克隆球形成率高于CD133-组[(4.50±1.29)％,P＜0.01].体内成瘤实验结果示CD133+组与未分选组移植成瘤率分别为100％和60％,而CD133-组不成瘤.结论 免疫磁珠分选系统可成功分离高纯度的胆囊癌CD133+细胞,而且人胆囊癌CD133+细胞具有一定的增殖、耐药、自我更新及致瘤潜能.
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免疫磁珠法分离膀胱癌CD133+细胞及生物学行为研究
目的 探讨免疫磁珠法分离膀胱癌5637细胞株中CD133+细胞的方法,观察CD133阳性、阴性细胞间生物学行为的差异.方法 采用免疫磁珠法分选出膀胱癌5637细胞株中CD133+细胞,流式细胞仪检测分选纯度,通过噻唑蓝(MTT)实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、分化能力检测研究其生物学行为.结果 流式细胞仪检测CD133+细胞在膀胱癌5637细胞中比例为1.45％,经免疫磁珠法分选所得CD133+细胞比例为93.45％;CD133+细胞的增殖、迁移能力明显强于CD133-、未分选的肿瘤细胞(P＜0.05);平板克隆形成实验结果示CD133+组[(89.333±4.530)％]细胞克隆形成率明显高于CD133-组[(22.667±4.041)％,P＜0.05].流式细胞仪检测CD133+细胞培养2d后其纯度降至48.19％,4d后其纯度与分选前无明显差异.结论 免疫磁珠分选技术可高效快捷获得CD133+细胞,CD133+细胞具有自我更新、迁徙、生成其他表型肿瘤细胞等干细胞样特性.
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U251细胞系中脑肿瘤干细胞耐药性的初步研究
目的 探讨脑肿瘤干细胞对抗肿瘤药物的耐药性及其机制.方法 通过磁珠分选(MACS)将U251细胞中的CD133+与CD133-细胞进行分选,用MTT法和流式细胞技术比较CD133+与CD133-细胞对抗肿瘤药物替尼泊苷(Vm-26)、卡莫司汀(BCNU)和顺铂(DDP)的敏感性、细胞凋亡率及细胞内药物蓄积的差异性,通过RT-PCR检测CD133+与CD133-细胞耐药基因谱的差异.结果 U251细胞系中,CD133+细胞约占5.4%.分选后的CD133+细胞的阳性率可达92.4%,CD133-细胞对抗肿瘤药物替尼泊苷、卡莫司汀和顺铂的敏感性明显高于CD133+细胞;流式细胞仪试验显示,在中等浓度的替尼泊苷作用下,CD133-细胞的凋亡明显,并出现明显的"亚G1峰",而CD133+细胞并未受到明显抑制和杀灭;流式细胞仪检测显示CD133+细胞内的药物蓄积明显低于CD133-细胞;RT-PCR实验显示MDR1、BCRP、MRP、MGMT和Bcl-2表达在CD133+明显高于CD133-细胞.结论 CD133+是U251细胞系中的耐药细胞亚群,高表达ABC转运体,DNA修复和抗凋亡基因可能是CD133+细胞耐药的重要机制.
关键词： 肿瘤干细胞 磁珠分选 耐药性 U251人胶质母细胞瘤细胞系 -
人心肌干细胞的体外改良培养
目的:用改良的培养基培养人心肌干细胞,并筛选鉴定.方法:通过心脏外科手术取下右心耳组织,用组织块培养法来获得原代心肌干细胞,用改良的心肌干细胞培养液培养,增殖传代后进行心肌干细胞表面标志物的鉴定,再用免疫磁珠筛选以获得较纯的目的心肌干细胞.结果:培养约2周后,贴壁良好的心肌组织块周围可见有小、圆、亮的细胞爬出,用Accutase(细胞消化液)短时间消化后冲洗细胞,培养增殖传代,其增殖能力与传统心肌干细胞培养液培养的细胞比较无显著差异,用流式细胞术鉴定c-Kit(干细胞表面标志物),其阳性率(6.8±2.1)%,之后用含抗c-Kit抗体(anti-c-Kit)的磁珠进行分选,即得较纯的c-Kit阳性(c-Kit+)心肌干细胞,它们可以分化为心肌细胞.结论:通过心脏组织块贴壁培养法,用改良后的心肌干细胞培养基培养,再借助免疫磁珠的分选,同样可得到较纯的c-Kit+心肌干细胞.
