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尖吻蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ通过促进半胱天冬酶3表达诱导K562/A02细胞凋亡
本研究探讨尖吻蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ(component I from Agkistrodon acutus venom,AAVC-Ⅰ),对人慢性髓系白血病(CML)细胞生物学特性的影响.选择K562/A02细胞株为对象,培养体系中加入不同浓度的AAVC-Ⅰ(6.25 - 100 μg/ml),用CCK-8法检测K562/A02细胞增殖活性,Giemsa和Hochest 33258染色法观察细胞形态学的变化,流式细胞术检测K562/A02细胞凋亡情况,酶显色活性分析法检测caspase 3酶活性的变化.结果表明,AAVC-Ⅰ能够抑制K562/A02细胞的体外增殖,呈时间和剂量依赖性,48h时半数抑制浓度为30.988 μg/ml.AAVC-Ⅰ作用K562/A02细胞48 h后,镜下可见胞核固缩及凋亡小体的形成.流式细胞术分析显示,随着作用药物的浓度由0增高到50μg/ml,细胞凋亡率也由0.88％升高到53.66％.相比对照组,各实验组caspase 3凋亡蛋白的表达呈浓度依赖性增加(P＜0.05).结论:AAVC-Ⅰ能够有效地抑制人红白血病K562/A02细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与caspase 3蛋白的高表达促进K562/A02细胞凋亡有关.
关键词： 尖吻蝮蛇毒 K562/A02细胞 细胞凋亡 Caspase 3 -
皖南尖吻蝮蛇毒组分ACTX-8抗肿瘤侵袭转移作用的研究
目的 探讨皖南尖吻蝮蛇毒组分ACTX-8对宫颈癌细胞Hela黏附、侵袭能力的影响及相关机制.方法 将Fibronectin包被在96孔板中,Hela细胞经0,2.5,5,10,20,40 μg/ml的ACTX-8处理后,检测与Fibronectin的黏附作用,MTT检测黏附细胞数;Transwell小室法检测细胞侵袭能力和迁移能力的变化;流式细胞仪检测ACTX-8与Fibronectin与Hela细胞膜的竞争结合作用.结果 经不同浓度的ACTX-8处理后,Hela细胞与Fibronectin的黏附作用降低,同时Transwell小室实验显示Hela细胞的迁移和侵袭能力也降低,流式结果说明ACTX-8能竞争结合Fibronectin在细胞上的受体.
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蝮蛇毒抗凝蛋白组分对人结肠癌细胞株SW480凋亡的实验研究
目的 探讨蝮蛇毒抗凝蛋白组分诱导人结肠癌细胞株SW480凋亡及其可能的作用机制.方法 CCK-8比色法测定蝮蛇毒抗凝蛋白组分对体外培养的SW480细胞的细胞毒作用,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞线粒体膜电位(mitochonal membrane potential,MMP)变化和细胞周期分析,Western blot检测凋亡相关蛋白半胱-天冬氨酸蛋白酶3(cysteine containing aspartate,capase-3)、bcl-2的表达.结果 蝮蛇毒抗凝蛋白组分对SW480细胞具有明显的生长抑制作用,显微镜下观察到细胞圆缩,悬浮细胞增多,细胞分裂相减少,培养液内细胞碎片明显增多,流式细胞仪直方图上亦出现特征性的亚二倍体峰,随着蝮蛇毒抗凝蛋白组分浓度的增加,线粒体膜电位逐渐下降,凋亡率逐渐增加,capase-3蛋白表达增加,bcl-2蛋白表达无变化.结论 皖南尖吻蝮蛇毒抗凝蛋白组分可诱导SW480细胞发生凋亡,通过线位体/半胱天冬氨酸蛋白酶3途径可能是SW480细胞发生凋亡的机制之一.
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降纤酶生产过程中测活方法探讨
降纤酶是从尖吻蝮蛇毒纯化的蛋白水解酶。酶的活力是衡量酶制剂水平的一个重要指标，它所处环境的酸碱性、离子强度、温度、金属离子等对其活性有很大的影响。部颁标准的降纤酶测活方法是针对原料药及制剂的，它们纯度高，一般为冻干品且含盐分少，可用合适pH及离子浓度的缓冲液溶解，因而能在降纤酶适测活环境中进行测定。然而，在从尖吻蝮蛇毒纯化降纤酶的过程中，由于工艺的需要[1]，所用的各种层析缓冲液中含有不同浓度的盐，酸碱度也与测活系统不一样。高浓度的盐与偏酸、偏碱都影响降纤酶的活性测定，甚至出现与客观事实相反的结果，给纯化工作造成误导。
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尖吻蝮蛇毒中一种新抗凝血因子的纯化及特性研究
应用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱,从尖吻蝮蛇毒中分离出一个新的抗凝血因子.经Superdex 75 HR 10/30预装柱检测,纯度达99.9%.SDS-PAGE检测为单一条带,相对分子量52.2k.该因子有显著的抗凝血活性,延长白陶土部分激血活酶时间的临界浓度为0.2mg/ml,无纤溶活性、磷脂酶A2活性和出血活性.
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尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化
用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱技术,从尖吻蝮蛇毒中纯化得到一个具有凝血活性的组分.经Superdex 75 HR10/30预装柱检测,纯度达99.91%.SDS-PAGE显示为单一条带,还原、非还原条件下分子量分别为59.25k、52.58k.该组分的凝血酶比活为41.5u/mg,精氨酸酯酶比活为14.29u/mg,但不激活血浆凝血因子ⅩⅢ.EDTA不能抑制其凝血活性,而苯甲磺酰氟则产生不可逆抑制作用.结果表明该酶是一种新尖吻蝮蛇毒类凝血酶.
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降纤酶致肝功能损害1例报道
降纤酶是以生物技术手段从白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇毒中提纯的单一组份的冻干酶制剂,广泛用于治疗急性心肌梗塞、脑梗塞、肺栓塞、股动脉栓塞、血栓闭塞性脉管炎、突发性耳聋及高粘滞血症等疾病.常见的副作用为出血和过敏反应,其它副作用的报道鲜见.现将降纤酶致肝功能损害1例报道如下.
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尖吻蝮蛇毒38k凝血酶样酶的分离纯化工艺
建立从尖吻蝮蛇毒中分离纯化38 k凝血酶样酶的生产工艺,利用离子交换和凝胶过滤技术,中间品加入巯基乙醇处理后,再利用凝胶过滤技术除去性质相近的杂蛋白,获得的38 k凝血酶样酶HPLC纯度达99.93%,比活力达4 416 U/mg,出血毒试验800 U/ml无出血,所建立的分离纯化方法适合规模生产.
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一种来自于尖吻蝮蛇毒的新类凝血酶对血液止血机制的研究
目的:研究尖吻蝮蛇蛇毒止血酶Agacutase的止血机制.方法:水蛭素、肝素、苯甲基磺酰氟(PMSF)、钙离子或尿素等分别与Agacutase酶混合,在体外研究它们对酶凝结活性的影响.新西兰白兔静脉注射Agacutase,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标.结果:水蛭素和肝素对该酶没有影响,PMSF和尿素明显抑制酶的凝结活性,而钙离子激活酶凝结活性.静脉注射Agacutase 0.03～ 0.12 U/kg剂量后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短,给药后2h药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致,对活化部分凝血活酶时间(APTT)无影响.结论:Agacutase在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白,但不激活凝血因子Ⅱ和ⅩⅢ,在伤口部位加速止血.在正常的血管内,不会造成血栓形成.所有实验结果显示,Agacutase是一个有效的潜在止血剂.
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尖吻蝮蛇毒小分子多肽对人卵巢癌A2780细胞增殖和黏附的影响
目的 探讨尖吻蝮蛇毒小分子多肽(K组分)对体外培养的人卵巢癌A2780细胞株的增殖抑制作用及机制.方法 MTT法观察K组分对人卵巢癌A2780细胞增殖的影响;采用光镜、电镜观察细胞形态变化;荧光染色法测定和观察K组分对A2780细胞凋亡影响;采用结晶紫染色法测定K组分对A2780与FN黏附作用的影响.结果 MTT显示K组分呈剂量与时间依赖性抑制人卵巢癌A2780细胞株的增殖,电镜观察给药组细胞出现明显凋亡,荧光显微镜下可见细胞形态发生改变,K组分对A2780细胞在FN基质上的黏附有一定的抑制作用,并呈浓度依赖关系.结论 K组分对体外培养的人卵巢癌A2780细胞株有较明显的抑制作用,该作用与诱导细胞凋亡和抑制细胞和细胞外基质黏附的能力有关.
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尖吻蝮蛇毒小分子多肽的分离及抗血小板聚集作用
目的 从尖吻蝮蛇毒中分离纯化一种抗血小板聚集小分子多肽,研究其理化性质以及对ADP、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集反应的影响.方法 经Sephadex G-75凝胶过滤,超滤,DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析法分离纯化蛇毒组分,采用高效液相鉴定纯度,用SDS-凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量,用比浊法测定其抗血小板聚集活性.结果 从尖吻蝮蛇毒中分离相对分子质量约为7 862 u等电点为4.29的组分,该组分能抑制由ADP、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集并成剂量依赖性.结论 此法成功地从尖吻蝮蛇毒中纯化出抗血小板聚集组分.该组分与去整合素比较相似,可能属于去整合素家族.
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尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入Hela细胞的影响
目的:观察刚地弓形虫速殖子在来源于安徽省南部地区的尖吻蝮蛇蛇毒的作用下侵入Hela细胞的数量,探讨尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入Hela细胞的作用.方法:以不同浓度尖吻蝮蛇毒加入分孔培养的细胞中,于不同时间观察感染弓形虫速殖子细胞的数量.结果:尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞有明显的促进作用, 弓形虫速殖子在蛇毒的作用下在同一时间内对宿主细胞侵入的数量均高于对照组(P＜0.05～P＜0.01),但不同剂量的尖吻蝮蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的作用差异无显著性(P＞0.05).5.0 μg/ml和0.25 μg/ml的剂量分别比对照组平均提高了125.49%和81.37%.结论:尖吻蝮蛇毒可以明显增加弓形虫速殖子对宿主细胞的感染率.
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尖吻蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ对小鼠肺癌LLC细胞增殖的抑制作用
目的:研究尖吻蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ( AAVC-Ⅰ)对小鼠肺癌LLC细胞增殖抑制的影响.方法:以小鼠肺癌LLC 细胞为研究对象,采用显微镜观察细胞形态学的变化、MTT 法检测药物敏感性、DNA ladder法检测细胞凋亡.结果:AAVC-Ⅰ对LLC细胞有较强的增殖抑制作用,抑制程度随药物浓度的增加而增强,其IC50为43.823μg/ml(P＜0.05).琼脂糖电泳观察到细胞DNA的片段化.结论:AAVC-Ⅰ可抑制LLC细胞增殖,诱导其凋亡.
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蕲蛇酶治疗52例急性脑梗塞患者护理体会
蕲蛇酶是尖吻蝮蛇毒中提取的一种新型蛇毒凝血酶样酶,临床试验结果显示是治疗急性脑梗塞的有效、安全药物[1],但在临床实践中发现有过敏反应、皮肤黏膜出血、血小板计数减少等副作用.我科于2002年4月至2004年6月应用该药对52例急性脑梗塞患者进行治疗,现介绍其护理体会如下.
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蕲蛇酶治疗急性脑梗塞临床观察
急性脑梗塞是临床常见病,多发病,致残率极高.蕲蛇酶是从尖吻蝮蛇毒分离纯化的凝血酶样酶制剂[1].其能降低血中纤维蛋白原,增强体内纤溶系统溶解血栓.我科一年多来应用其治疗急性脑梗塞23例,取得了满意的疗效,大大降低了致残率,现报告如下.1资料与方法1.1病例选择:选择发病在5天以内、肌力在Ⅳ级以下(包括Ⅳ级)的脑梗塞患者,全部病例经颅脑CT扫描确诊.有心肌梗塞、心房颤动、频发性期前收缩、肝、肾功能不全、出血性疾病、过敏性体质、中重度痴呆、假性球麻痹、心源性脑梗塞、大面积脑梗塞及有意识障碍的患者,不列为入选对象.按照1995年全国脑血管病会议脑卒中患者临床功能缺损程度评分标准分为三型:轻型(0～15分),中型(16～30分),重型(31～45分).治疗组23例,男16例,女7例;年龄47～ 78岁.
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尖吻蝮蛇毒药理作用的研究进展
目的:探讨尖吻蝮蛇毒的药理作用.方法:综述尖吻蝮蛇毒的化学成分、凝血作用、抗血栓作用、抗肿瘤机制及其他生理活性的新研究进展.结果:研究表明尖吻蝮蛇毒在凝血、溶栓和肿瘤治疗中的应用越来越广泛,既有确切的疗效,又具有一定的不良反应.结论:对尖吻蝮蛇毒的化学成分及不良反应进行研究,观察其在人体内的代谢情况,提高其临床安全性和疗效仍将是今后重要的研究方向.
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尖吻蝮蛇毒活性肽K组分的研究
目的 从尖吻蝮蛇毒中分离纯化一种小分子活性肽K组分,测定其理化性质及生物学活性.方法 经Sephadex G-75凝胶过滤.超滤,DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析法分离纯化活性肽K,采用高效液相鉴定纯度,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量,等电聚焦法测定等电点,用比浊法测定其抗血小板聚集活性,通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测K组分对血管生成的影响.结果 从尖吻蝮蛇毒中分离相对分子量约为7 862D,等电点为4.29的组分.该组分能抑制由二磷酸腺苷(ADP)、胶原(collagen)、凝血酶(thrombin)诱导的血小板聚集并成剂量依赖性;具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用.结论 从尖吻蝮蛇毒中纯化出活性肽K,该组分有很强的抗血小板聚集和抗血管生成作用.
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尖吻蝮蛇毒小分子多肽对人胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用
目的 探讨尖吻蝮蛇毒小肽对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞株的增殖抑制作用及作用机制.方法 用MTT法观察尖吻蝮蛇毒小肽对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响;采用光镜、电镜观察细胞形态及超微结构变化;荧光染色法测定和观察尖吻蝮蛇毒小肤对SGC-7901细胞凋亡影响;采用结晶紫染色法测定尖吻蝮蛇毒小肽对SGC-7901与FN黏附作用的影响.结果 MTT显示尖吻蝮蛇毒小肽呈剂量与时间依赖性抑刺人胃癌SGC-7901细胞株的增殖,电镜观察给药组细胞出现明显凋亡,荧光显微镜下可见细胞形态发生改变,尖吻蝮蛇毒小肽对SGC-7901细胞在FN基质上的黏附有一定的抑制作用,并呈浓度依赖关系.结论 尖吻蝮蛇毒小肽对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞株有较显著的抑制作用,该作用与诱导细胞凋亡和抑制细胞和细胞外基质黏附的能力有关.
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尖吻蝮蛇毒PCA对血管内皮细胞的影响
目的：观察皖南尖吻蝮蛇毒蛋白C激活剂（PCA）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）活性及表达组织因子（TF）、血管性血友病因子（ vWF）的影响，探讨PCA对血栓性疾病的防治机制。方法：常规培养HUVEC，MTT法检测细胞活性，ELISA检测细胞上清液中TF和vWF的含量，Western blot法检测细胞内TF蛋白表达，RT－PCR法检测细胞内TF和vWF mRNA的表达。结果：低浓度的PCA（＜2．5 mg／L）对HUVEC活性和形态没有明显影响，但可明显减轻LPS引起的HUVEC生长抑制和形态改变；高浓度的PCA（＞2．5 mg／L）可显著抑制HUVEC存活率并引起其形态改变。 PCA实验组与对照组比较，其上清中TF和vWF的含量、细胞内TF及vWF mRNA的表达无明显变化，而LPS损伤组各个细胞因子及相关蛋白的表达量明显增加（ P＜0．05）；对于PCA＋LPS组，各指标无明显变化。结论：低浓度PCA在一定程度上可减轻LPS引起的HUVEC损伤；PCA可拮抗内毒素引起HUVEC的TF和vWF的表达；PCA可能通过这种拮抗作用来防治血栓性疾病。
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王锦蛇血清对尖吻蝮蛇毒的抑制作用
目的探讨王锦蛇血清对尖吻蝮蛇毒的抑制作用. 方法王锦蛇血清与不同剂量的尖吻蝮蛇毒分别混合后,注射到小鼠背皮下,测定王锦蛇血清对尖吻蝮蛇毒的抗出血活力;腹腔注射此混合物后,测定王锦蛇血清对尖吻蝮蛇毒的抗毒效价;先后注射尖吻蝮蛇毒和王锦蛇血清,测定王锦蛇血清对尖吻蝮蛇毒引起的死亡、组织损伤和炎症的抑制、保护和治疗作用. 结果 1ml王锦蛇血清可完全抑制10mg(干重)的尖吻蝮蛇毒的出血活力;1ml王锦蛇血清可中和11mg(干重)尖吻蝮蛇毒的致死活力;王锦蛇血清对由尖吻蝮蛇毒引起的致死、组织损伤和炎症有显著的抑制、保护和治疗作用. 结论王锦蛇血清是尖吻蝮蛇毒的强抑制剂,可能成为未来新的蛇伤治疗药物的原料.
