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内参照基因表达检测在宫颈石蜡组织原位杂交中的运用及意义
原位核酸杂交目前已广泛运用于组织和细胞基因表达定位和水平测定.但在实际运用中存在两个主要问题:(1)标本间的定量比较,缺乏比较的基准;(2)对于阴性结果,如何区别杂交失败的阴性结果和由于RNA的降解而出现的阴性结果.3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β-肌动蛋白为细胞的看家基因,其表达水平在不同活动中相对稳定,被广泛运用于基因表达水平检测的内参照基因[1-3],但尚未在原位杂交中作为内参照基因运用.我们通过制备GAPDH和β-肌动蛋白探针,对存档的正常和病理宫颈石蜡组织做了原位杂交检测,并与抑癌基因p53、癌基因c-myc的表达改变相比较,探讨其表达检测是否可作为组织和细胞原位杂交的阳性对照或基准.
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肺癌小RNA即时定量逆转录聚合酶链反应分析中内参照的选择
小RNA(microRNA,miRNA)是一类体积微小的内源性非编码RNA,可其通过翻译后水平调节靶基因的表达.miRNA在肺脏的发育过程中发挥多种作用,其异常表达很可能是肺癌发生的原因之一,且在肺癌的发生与发展过程中呈不同的表达水平,可作为新型的临床生物标志物用于肺癌的诊断、预后评估及指导治疗方案的选择等[1-3].即时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-PCR,RT-qPCR)技术目前已广泛应用于miRNA的表达分析[1-2].
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登革病毒RT-PCR核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照品的建立
目的 登革病毒核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照品建立与评价.方法 将登革病毒核酸检测靶基因序列间引入180碱基与登革病毒无关基因序列构建内参照检测靶靶标并在其下游通过核糖体内部进入位点基因介导的荧光蛋白报告基因后引入慢病毒包装载体,在辅助质粒的帮助下转染HEK 293T细胞,收获假病毒颗粒,定量分析后加入到到待检样本和模拟样本中一起进行评价和应用.结果 所构建的登革病毒病毒核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照品能够充当RT-PCR法检测不同型别登革病毒的内参照品,扩增片段大小和病毒目的 扩增片段明显不同,易于区别,能够监测反应的整个过程.结论 登革病毒核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照系统,容易制备,保存简单,易于改造为多种RNA病毒的核酸检测的内参照.
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先兆子痫胎盘中细胞因子信号转导相关基因表达的变化
为探讨细胞因子与先兆子痫病理发生关键事件之间的关系,采用基因芯片检测技术观察了细胞因子信号转导相关基因在先兆子痫胎盘组织中的表达.胎盘组织取自我科住院病例,正常及先兆子痫患者(各3例)的年龄均限制在24～25周岁,2组患者的一般情况基本一致.基因芯片购自日本Takara生物技术公司,分别点样有约220种人类细胞因子相关基因和约220种人类环境激素相关基因,每枚芯片上还点样有包括β-actin、α2-tublin、GAPDH等在内的看家基因共计56点或48点作为内参照.
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枳实消痞丸对大鼠上消化道CCK及CCK-A受体mRNA表达的影响
目的:探讨枳实消痞丸方对大鼠胃及十二指肠黏膜胆囊收缩素及其A受体基因表达的影响.方法:♂ Wistar大鼠20只,分为对照及用药组,每组10只.分别以1.5mL生理盐水及枳实消痞丸方水煎制剂灌胃4wk.处死后取材,用RT-PCR法检测十二指肠黏膜CCKmRNA及胃底、胃窦肌肉组织CCK-A受体mRNA表达水平,并以同管所扩β-actin作为内参照进行半定量比较.结果:中药组大鼠十二指肠黏膜CCKmRNA及胃底CCK-A受体mRNA的表达水平明显较对照组降低(1.13±0.26vs0.67±0.10,P＜0.001;7.30±2.61vs3.37±1.07,P＜0.01),但胃窦部的CCK-A受体mRNA的表达水平明显增高(1.22±0.24vs3.25±1.11,P＜0.001).结论:枳实消痞丸方可能通过对CCKmRNA及CCK-A受体mRNA表达水平的影响,从而起到对消化道动力的某些影响及临床上的一些治疗作用.
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肾母细胞瘤组织中碱性成纤维细胞生长因子和纤维细胞生长因子受体表达分析
肾母细胞瘤(NBT)是婴幼儿泌尿系常见的恶性肿瘤.我们采用RT-PCR技术对NBT组织中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和纤维细胞生长因子受体(FGFR)基因进行定量分析,探讨其临床意义.资料与方法 38例NBT标本、22例肾癌癌旁组织标本,均经病理学诊断证实为NBT.患儿年龄1～3岁.实验方法:总RNA提取.bFGF、FGFR引物由北京奥科生物有限公司合成.引物序列采用primer premier 5.0软件处理系统设计,并以β-actin为内参照.
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因定量诊断技术评价及其临床应用
基因定量诊断技术已被广泛应用于临床,如判断病情和预后、药物疗效评价和预测等.基因定量诊断技术包括杂交法和PCR法两大类.杂交法以其准确度高,重复性好而得到认同;PCR高度敏感,但受技术影响因素较多,需引入内参照技术,才可保证结果的准确度,且应向自动化方向发展.
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疼痛刺激神经生长因子基因在大脑皮层的过量表达
本文用福尔马林(Formalin)制作了小鼠疼痛及炎症模型,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参照,采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,观察了疼痛刺激神经生长因子基因(NGF mRNA)在大脑皮层的变化以及硫酸镁(MgSO4)对NGF mRNA表达的影响.
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分子信标荧光探针检测结核分枝杆菌的临床应用
目的:探讨分子信标荧光探针检测结核分枝杆菌的临床应用价值.方法:应用设置内参照的分子信标荧光探针检测178例肺结核标本,并与痰涂片和培养结果进行比较.结果:肺结核组分子信标荧光探针阳性率显著高于痰涂片和培养,检出率分别为56.2%(100/178),34.8%(62/178)、34.8%(62/178).结论:分子信标荧光探针具有较高的灵敏度和特异度,对结核病的辅助诊断有一定的临床意义.
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八肽胆囊收缩素逆转内毒素休克大鼠心功能降低及其受体机制
目的:探讨CCK-8对内毒素休克(ES)大鼠心功能的影响及其受体机制.方法:(1)心功能检测分3组(每组6只): ①对照组,静脉注射生理盐水0.2 ml;② LPS组,静脉注射8 mg/kg LPS;③CCK+LPS组,静脉注射40 μg/kg CCK-8,10 min后再注入LPS(8 mg/kg).监测MAP、LVP和±LV dp/dtmax的动态变化.(2)CCK受体表达分5组(每组3只):①对照组(同前);②～⑤LPS组,静脉注射8 mg/kg LPS,于0.5、2、6和12 h放血处死动物,取心肌组织标本.用RT-PCR检测CCK-AR及CCK-BR mRNA表达的变化,以β-actin作内参照.结果:(1)静脉注射LPS后MAP、LVP和±LV dp/dtmax 较对照组均快速持续下降(P<0.01),2 h时下降为 (7.16±0.59) kPa、(7.6±0.68) kPa和+(298.01±25.52)/-(166.96±19.25) kPa;CCK+LPS组30 min内 MAP、LVP和±LVdp/dtmax下降幅度与LPS组无显著差异,20～30 min后即迅速回升,至120 min仍维持在较高水平:(10.71±0.45) kPa、(11.70±1.26) kPa 和+(446.04±67.18)/-(347.90±136.98) kPa(P<0.01).(2)CCK-AR mRNA表达于0.5 h开始增加,2 h达高峰,6 h维持较高水平,12 h开始下降;CCK-BR mRNA表达于0.5 h无明显变化,2 h达高峰,6、12 h仍维持较高水平.结论:ES状态下大鼠心肌组织CCK受体表达上调,CCK-8可直接激活心肌细胞的CCK-R,是发挥逆转ES大鼠心功能下降及顽固性低血压的作用机制之一.
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定量检测CCL20的竞争性内参照RT-PCR的建立及其初步应用
目的建立检测趋化因子CC亚家族配体20(CCL20)表达水平的内参照定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法将人CCL20编码基因克隆到pbs-△ANK质粒中(PAL-2),将-42 bp的外源核苷酸片断插入到上述重组质粒的CCL20中间,构建内参照质粒PAL-2-IS.在该定量系统中以PAL-2-IS和PAL-2为模板,用CCL20的特异性引物扩增,根据扩增出的两个不同大小的条带的光密度扫描值对CCL20进行相对定量.结果将PAL-2与已知不同系列浓度的PAL-2-IS以内参照竞争定量RT-PCR共扩增定量PAL-2浓度,PAL-2计算浓度与实际浓度无差异(P＞0.05).在同一细胞数量水平(105数量级),内参照竞争定量RT-PCR检测表明:CCL20在L02、HepG2、Hepal、Hepa3中表达水平高于Hepa2,而在HepG2.2.15中低.结论建立了检测CCL20表达水平的内参照定量RT-PCR方法,该方法可用于细胞中CCL20不同表达水平的检测.
关键词： 趋化因子CC亚家族配体20 内参照 定量 竞争 逆转录聚合酶链反应 -
AngⅡ、mm-LDL和TNFα对ECV304细胞PDGF-B链基因转录调控的影响
目的:从基因转录水平探讨AngⅡ、mm-LDL及TNFα对ECV304细胞PDGF-B链基因表达的影响.方法:(1)以GAPDH为内参照,用反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测10-6 mol/L AngⅡ、100 μg/mL mm-LDL及200 U/mL TNFα作用于ECV304细胞18 h后各实验组PDGF-B链基因mRNA水平,分别为对照组的1.5倍、2.0倍和1.3倍,提示AngⅡ、mm-LDL及TNFα在转录水平对ECV304细胞PDGF-B链基因的表达有促进作用.
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竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测HBV DNA
我们用与野生模板等长和等效扩增的突变模板作为内参照,通过竞争PCR对HBV基因进行扩增，并引入微反应板酶联杂交技术对扩增产物定量分析。 1. 资料与方法：(1)HBV DNA标准品：质粒pADR-1 DNA 经BamH I酶切线性化后精确定量。(2)PCR2.1-WS319和PCR2.1-MS319质粒：均由长征医院感染科实验室（简称本室）构建。(3)HBV DNA阳性血清抽提物（10份）本室冻存。(4)竞争PCR：在0.2ml薄壁PCR反应管内，每管加入25μl PCR mix、引物EP1和EP2各1μl、按不同实验要求所需的各种模板，加双蒸水，使终体积为50μl。PCR扩增参数: 94℃，5min后；94℃，30s；54℃，30s；72℃，30s，共25个循环；再72℃延伸3min。(5)微反应板酶联杂交定量：由本室建立。(6)野生模板初始量的确定：采用Clementi等[1]介绍的公式: M/W=M'/W'。(7)统计学方法用Student's t检验。
