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肝素酶HLA-A2限制性CTL表位肽的筛选及其活性鉴定
目的 预测并鉴定新的人乙酰肝素酶(Hpa)抗原的HLA-A2限制性CTL表位,为恶性肿瘤多肽疫苗的免疫治疗提供依据. 方法 采用SYFPEITHI和BIMAS软件预测方法,对肝素酶HLA-A2限制性CTL表位进行预测,合成候选表位肽;利用T2细胞特点,对合成的候选肽与HLA-A2分子进行亲和力分析;利用乳酸脱氢酶释放试验检测待检肽特异性CTL诱导活性;利用ELISPOT检测T细胞活性. 结果 在所筛选的6条候选CTL表位肽中,Hpa(310～318)FLNPDVLDI与HLA-A2分子具有高亲和力,在体外可有效诱导肝素酶特异性CTL的产生,对肝素酶阳性且HLA-A2限制性的HCC-LM6肝癌细胞及SW-480结肠癌细胞具有明显的杀伤效应,且能有效诱导IFN-γ分泌,增强免疫活性. 结论 首次发现Hpa(310～318)FLNPDVLDI可能是肿瘤肝素酶抗原的HLA-A2限制性CTL表位.
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C3bα链N端42肽促进外源性抗原的交叉呈递
目的观察补体C3b α链N端42肽是否可促进外源性抗原的交叉呈递.方法三种肽:OVA CTL表位(257～264)、C3bAN42-OVA257～264、OVA253～266用化学法合成,然后HPLC纯化、质谱分析.三种肽分别在不同条件下与H-2b细胞系ANA-1、RMA-S共孵育,单抗25-D1.16检测细胞表面OVA257～264/Kb复合物的变化.结果 C3bAN42-OVA257～264比OVA253～266肽更容易被呈递,TAP分子不影响C3bAN42 肽的交叉呈递,但温度和NH4Cl对交叉呈递有不同程度的影响.C3bAN42介导的交叉呈递可以提高抗原肽-MHC复合物的稳定性.结论补体C3b α链N端42肽可促进外源性抗原的交叉呈递,并且能延长抗原肽的呈递时间.以上发现可以为肽、蛋白疫苗的设计提供新的启示.
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APL提高H2-D~b限制性天然CTL表位HPV-16E7_(49-57)免疫效应
HPV-16E7_(49-57)是H2-D~b限制性免疫显性CTL表位,是治疗HPV-16相关病变的理想靶标,研制HPV-16多肽疫苗可以参考表位为基础.但天然表位HPV-16E7_(49-57),的肿瘤免疫效果并不理想.对表位进行氨基酸置换修饰,筛选出免疫原性强的修饰多肽配体(APL),对构建HPV-16多肽疫苗有重要的意义.
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在我国传播的HIV-1 CRF65_CPX亚型毒株pol基因序列特征
目的 探索亚型为CRF65_CPX艾滋病病毒(HIV)毒株在中国不同高危人群间的传播特征,基因序列及其CTL表位的变化.方法 收集2017年6月之前中国鉴定HIV-1亚型为CRF65_CPX的毒株的pol基因区序列,使用比对好的pol基因区序列进行贝叶斯分析.以系统进化树为根据,选择其中同性性传播人群和异性性传播人群序列,分别生成共享序列后,比较两个人群氨基酸位点和HLA-B位点等位基因限制的CTL表位的差异.结果 共收集获得CRF65_CPX HIV pol基因区序列52条.贝叶斯分析结果显示,异性性传播人群的近共同祖先的时间为1999年,同性性传播人群的近共同祖先的时间为2003年,CRF65_CPX毒株出现在异性性传播人群的时间早于同性性传播人群.与异性性传播人群相比,同性性传播人群pol区共享序列有10个氨基酸位点发生变化;丢失了两个有数据证明的保护性CTL表位(B* 2702、B*5103).结论 CRF65_CPX毒株为中国近些年才发现的多重重组的新型毒株,其在中国的传播途径从异性性传播转变为以同性性传播为主,氨基酸位点和CTL表位在传播过程中也产生了变化,这种变化可能加速了疾病进程,故应引起并加强对该亚型及其类似的新型病毒株不断扩散传播的重视.
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颗粒性HBV多CTL表位基因诱导BALB/c小鼠的免疫应答研究
目的:研究含HBV多CTL表位的杂合HBc基因免疫BALB/c小鼠所诱导的免疫应答.方法:构建以HBV多CTL表位取代MIR区基因的杂合HBc基因疫苗(pHBcMep)并以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠,ELISA、流式细胞术、LDH释放法等分别检测血清特异性抗体与淋巴细胞分泌的IFN-γ水平、CD4+/CD8+T细胞比例变化及特异性CTLs活性等免疫应答指标.结果:颗粒性杂合HBc基因疫苗pHBcMep免疫BALB/c小鼠诱导明显抗体应答,末次免疫后2周,特异性抗preS2抗体阳性率达100%(12/12),高效价1∶1 000,同时诱导淋巴细胞分泌IFN-γ能力增强和刺激CTLs活化,其杀伤活性达16 IU30,CD4+/CD8+T细胞比例明显升高,且诱导明显回忆反应.结论:颗粒性HBV多CTL表位基因疫苗pHBcMep具有良好免疫原性,能迅速诱导高活性体液和细胞免疫应答及回忆反应.
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RSV CTL表位与G蛋白片段的融合表达对G蛋白片段诱导的免疫应答的调节作用
目的:观察呼吸道合胞病毒(RSV)的CTL表位F/M2与G蛋白抗原活性片段G1融合表达后,对G1诱导的免疫应答的调节作用.方法:将重组表达质粒pET-DsbA-G1和pET-DsbA-G1F/M2分别转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白DsbA-G1和DsbA-G1F/M2,亲和层析纯化.取上述蛋白,腹腔注射免疫BALB/c小鼠,定期采集血清和脾细胞,用MTT法测定CTL杀伤活性,ELISA测定IgG及其亚类IgG1和IgG2a抗体滴度,空斑抑制实验检测血清中和抗体.结果:经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白;DsbA-G1F/M2诱导了显著的RSV特异性CTL杀伤活性,而无CTL表位的DsbA-G1则不能诱导产生CTL反应;DsbA-G1F/M2和DsbA-G1均刺激产生了强烈的IgG抗体应答,但DsbA-G1所产生的IgG亚类仅为IgG1,而DsbA-G1F/M2同时诱导了高滴度的IgG1和IgG2a,显著下调了IgG1与IgG2a的比例;二者均诱导了高滴度的中和抗体,但与DsbA-G1相比,DsbA-G1F/M2所诱导的中和抗体滴度有所减弱.结论:CTL表位F/M2与G蛋白片段G1的融合表达产物DsbA-G1 F/M2,能够同时诱导细胞免疫和体液免疫应答,CTL的激活下调了IgG1与IgG2a的比例,使得免疫应答更平衡,有利于改善该候选疫苗的安全性.
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抗原NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位的初步鉴定
目的:鉴定乳腺癌分化肿瘤抗原NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位.方法:采用量化基序法初步预测NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位;分子动力学方法进一步筛选量化基序法中评分高的3个表位肽;HLA-A2亲合力鉴定预测的结果.结果:分子动力学和HLA-A2亲合力实验均证明,在量化基序法预测的3个候选CTL表位中,NY-BR-11043-1051与HLA-A2亲合力佳.结论:NY-BR-11043-1051可能为乳腺癌分化抗原NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位.
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Hela细胞Survivin克隆及HLA-A2限制性CTL表位预测研究
目的:从Hela细胞中克隆凋亡抑制因子Survivin的编码序列,进行测序,并由此预测其HLA-A·0201限制性CTL表位.方法:设计人Survivin基因序列特异引物,通过RT-PCR扩增Survivin编码序列,构建至pGEM-T载体后,测序分析,并对其进行了HLA-A·0201限制性CTL表位抗原表位相关预测.结果:从Hela细胞中克隆得到的Survivin和Survivin-ΔEx3两种剪接体,其中Survivin-ΔEx3发生1个同义突变和三个错义突变,预测其抗原表位抗原性发生了变化.结论:寻找抗原性强、结合力高的表位,对于今后抗肿瘤多肽疫苗的研究具有重要的意义.
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穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒G蛋白片段G1及CTL表位融合蛋白的表达及纯化
目的 在大肠杆菌中表达含穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段G1及CTL表位的融合蛋白,并进行纯化.方法 以质粒pET-G1F/M2为模板,扩增含TAT、RSV G蛋白片段G1和CTL表位F/M2的融合基因片段,与原核表达质粒pET-His连接,构建融合表达质粒pET-TAT-G1F/M2,转化E coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达,采用Ni2+螯合亲和层析法纯化经尿素变性的包涵体,梯度透析复性纯化的目的 蛋白,并进行Western blot鉴定.结果 在E coli中可高效表达重组蛋白TAT-G1F/M2,表达量占菌体总蛋白的30%以上,目的 蛋白主要存在于包涵体中.经变性、纯化、复性可获得高纯度(>95%)特异性的TAT-G1F/M2蛋白.结论 已在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白TAT-G1F/M2,为进一步进行RSV体内体外免疫学研究奠定了基础.
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065 以CTL表位为基础的高效疫苗的分子设计及其效应机制
随着抗原表位及基因免疫的研究进展，以各种病原体的特异性抗原表位为基础所开展的基因疫苗研究取得了长足的进步。本文综述了以CTL表位为基础，通过辅以协同刺激分子基因、细胞因子基因作为基因佐剂或给目的抗原设计一“向导序列”或“得力助手”等方法所进行的高效疫苗的分子设计。
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重要病毒CTL表位肽疫苗的研究现状
CTL表位诱导的细胞免疫在抗病毒感染中发挥重要作用.虽然在早期研究中病毒CTL表位的鉴定及其免疫学效应研究是一项复杂、耗时的工作,但随着科学家对抗原加工和提呈的深入研究,以及BIMAS、ProPred、SYFPEITHI等表位预测软件的开发,各种病毒CTL表位的鉴定及免疫效应研究变得更加科学、高效.本综述将简述CTL表位肽疫苗的优缺点及其发展前景,并对流感病毒、肝炎病毒、HIV、登革病毒等几种重要病毒CTL表位肽疫苗的研究现状及成果进行介绍.
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中国华南地区慢性乙型肝炎患者HLA-A等位基因分布的初步调查及其意义
目的 了解中国华南地区慢性乙型肝炎(CHB)患者HLA-A11、A2、A24、A33等位基因的分布状况,并为筛选HBV特异性CTL新表位提供必要背景资料.方法 以267例CHB患者和300例健康献血员为研究对象,提取其外周血染色体基因组DNA,用PCR-SSP法进行HLA-A11、A2、A24、A33等位基因检测型,并进行统计学比较.结果 CHB组HLA-A11、A2、A24、A33的基因频率分别为57%、41%、21%、7%,以HLA-A11常见,较HLA-A2的基因频率高16%.健康对照组四种HLA-A等位基因的频率分别为57%、46%、24%、14%,HLA-A11较HLA-A2的频率高¨%.HLA-A33的频率在两组间有显著差异(x2=7.556,P=0.006).CHB组HLA-A2/A11、A2/A24、A2/A33、A11/A24、A11/A33、A24/A33的基因频率分别为17%、4%、1%、16%、4%、0.4%,健康人群则为18%、8%、4%、11%、5%、1%,各种基因组合的出现率在两组间近似.HBeAg(+)与HBeAg(-)CHB组比较,HLA-A11(x2=3.324,P=0.072)、A2(x2=0.324,P=0.569)、A24(x2=0.308,P=0.579)、A33(x2=1.159,P=0.282)等位基因的频率分布在两组间无显著性差异.结论 中国华南地区CHB患者和健康人群的主要HLA-A等位基因均为HLA-A11、A2、A24及A33,以HLA-A11为多见,提示鉴定HLA-A11限制性HBV特异性CTL新表位具有十分重要的意义;此四种等位基因及其组合模式与CHB患者的HBeAg状态无明显相关,但与HBV感染的其他临床特点及抗病毒治疗应答之间的关系有待研究.
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Survivin HLA-A2+高亲和性CTL表位的预测及鉴定
目的:采用生物信息方法预测和鉴定survivin抗原HLA-A2+限制性CTL表位,为探索基于survivin的肿瘤免疫治疗奠定基础.方法:采用超基序法和量化基序法对靶抗原survivin HLA-A2+限制性 CTL表位进行预测;选取得分>10的表位肽为候选对象,并进行人工合成.采用T2细胞,以HLA-A2结合实验和流式细胞术(FITC染色)检测候选CTL表位肽的结合亲和力[以荧光系数(fluorescence index,FI)表示];以HLA-A2解离实验和流式细胞术检测其结合稳定性[以复合物解离50%的时间DC50(dissociation complex 50%)表示].结果:预测到的候选survivin CTL表位肽分别是:20STFKNWPFL28 (SV20-28)、23KNWPFLEGC31 (SV23-31)、96LTLGEFLKL104 (SV96-104)、6LPPAWQPFL14 (SV6-14)、33CTPERMAEA41 (SV33-41)、46CPTENEPDL54 (SV46-54)、130KVRRAIEQL138 (SV130-138)、37RMAEAGFIH45 (SV37-45)、88SVKKQFEEL96 (SV88-96).亲和力分析显示:SV20-28 、SV96-104、SV130-138、SV23-31的FI分别为8.61、6.88、5.89、3.81;SV33-41、SV6-14、 SV46-54、 SV37-45 、SV88-96的FI分别为0.31、-0.29、-0.4、-0.16和-0.03;稳定性分析结果DC50为:SV20-28、SV96-104、SV130-138 ＞8 h;SV23-31 为4～6 h;SV6-14、SV33-41、SV88-96为2～4 h;SV46-54、 SV37-45为0～2 h.结果提示,SV20-28 、 SV96-104、SV130-138为高亲和力表位肽,SV23-31为中等亲和力表位肽,SV33-41、SV6-14、 SV46-54、 SV37-45 、SV88-96为低亲和力表位肽.结论:超基序法、量化基序法可快速有效地预测抗原表位,SV20-28 、SV96-104、SV130-138有可能是survivin HLA-A2+ CTL表位,可用于后续研究.
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穿膜序列对MHC-Ⅰ类限制性CTL表位呈递影响的研究
目的:从时间依赖性抗原呈递动力学的角度研究穿膜序列(CPP)对MHC-Ⅰ类限制性CTL表位呈递的影响.方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含CPP与H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的融合多肽,同时合成该表位N、C端自然延伸的抗原肽和无关对照肽.采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测抗原呈递细胞(APC)在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC-Ⅰ类呈递的情况.结果:与不含CPP的抗原肽相比,含CPP的抗原肽中的CTL表位更易进入APC内MHC-Ⅰ类呈递途径,表现为呈递所需时间明显缩短(P<0.05),且同一时相点的呈递强度显著增加(P<0.05).结论:在外源性抗原肽中引入穿膜序列可明显促进其MHC-Ⅰ类限制性CTL表位的呈递效率,从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性.
关键词： 穿膜序列 CTL表位 MHC-Ⅰ类抗原呈递 动力学分析 -
肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究
目的 研究肝素酶(Hpa)多肽疫苗体外能否诱发肝素酶特异性CTL反应,为肝素酶多肽疫苗的临床应用提供理论依据.方法 5条HLA-A2限制性肝素酶抗原表位[Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)]分别负载正常人外周血来源(PBMC)的树突状细胞(DC),诱导肝素酶特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),采用4 h标准51Cr释放实验检测上述CTL对不同肿瘤细胞的免疫杀伤效应,采用ELISPOT方法检测肝素酶表位肽负载的DC疫苗刺激的效应细胞IFN-γ的释放.结果 5条肝素酶多肽表位中,只有Hpa(525-533)、Hpa(277-285)和Hpa(405-413)体外可以诱导肝素酶表位特异性CTL反应,对Hpa阳性且HLA-A2阳性的KATO-S胃癌细胞、U2OS骨肉瘤细胞、SW480结肠癌细胞具有明显的杀伤效应.对HLA-A2阴性的HepG2肝癌细胞和Hpm阴性的MCF-7乳腺癌细胞不具有杀伤效应,但对转染了HLA-A2的HepG2细胞和转染了肝素酶质粒的MCF-7细胞恢复杀伤效应,对自体淋巴细胞不具有杀伤效应,进一步研究表明,Hpa(525-533)、Hpa(277-285)和Hpa(405-413)表位肽可以促进CTL细胞IFN-γ的释放.结论 人肝素酶特异性抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环,这种肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点,为肝素酶表位多肽疫苗的临床应用提供了理论依据.
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穿膜肽对HPV16E7细胞毒性T细胞表位MHC-Ⅰ类抗原提呈影响的初步研究
目的 研究穿膜肽(Tat49-57)对HPV16E7 MHC-Ⅰ类限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位(E749-57)在抗原提呈细胞内经MHC-Ⅰ类途径被提呈的动力学影响.方法 应用多肽固相合成技术,分别合成含穿膜肽与HPV(人乳头瘤病毒)16E7惟一HLA-A2/H2-Kb+限制性CTL表位E749-57的融合多肽,同时合成该表位N端自然延伸的抗原肽和无关对照肽.采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测抗原提呈细胞(APC)在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC-Ⅰ类提呈的情况.结果 在与APC孵育早期,Tat-E749-57在短时间内即被APC快速提呈并进入MHC-Ⅰ类抗原提呈途径,提呈的效率略低于E749-57(P＞0.05);在孵育的后期,与Tat-E749-57组孵育的APC细胞表面,E749-57/Kb复合物存在时间较其他组明显延长(P＜0.05).结论 在外源性抗原肽中引入穿膜肽可明显促进其MHC-Ⅰ类限制性CTL表位的提呈效率,从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性.
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细胞毒性T细胞表位在人乳头瘤病毒疫苗研究中的意义及进展
人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)选择性感染皮肤或黏膜上皮细胞,局部形成增生性病变,甚至诱发恶性肿瘤,而以CTL为特征的细胞免疫对抑制HPV感染引起的机体损伤具至关重要的作用.在抗原结构和功能研究中,由CTL识别的抗原决定簇被确定,使含有CTL表位的疫苗取得了长足进展.
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HCMV-UL138 CTL表位肽重组酵母菌的构建及其免疫效应
目的：以乙肝病毒表面抗原为载体，制备含人巨细胞病毒（HCMV）-UL138 CTL表位肽的重组酵母菌并分析其免疫效应。方法：根据蛋白质数据库获得HCMV-UL138氨基酸序列，综合应用SYFPEITHI、Net-CTL及HLA-Bind方法筛选富含CTL表位的UL138多肽，插入到乙肝表面抗原前S2（PreS2）1-9区末端再与HBsAg 序列连接，在不改变氨基酸密码的前提下，根据酵母偏爱密码子优化序列，进行全序列合成，克隆入pPIC3.5K酵母载体，构建pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重组质粒。重组质粒经Bgl II处理线性化后，电转化至GS115菌株中，构建PreS2-HBsAg-UL13815-27重组酵母，阳性整合菌株经甲醇诱导后，通过Western blot及ELISA方法鉴定目的蛋白表达。鉴定的重组酵母菌经灭活后，全菌体皮下免疫BALB/c小鼠，通过ELISA法检测HBsAg特异性血清IgG抗体；UL13815-27 CTL表位肽（VMLVLIVAILCYL）刺激免疫小鼠的脾细胞，通过检测IFN-γ表达分析诱导产生的CTL反应。结果：PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/PreS2-HBsAg-UL13815-27重组质粒。重组酵母经甲醇诱导后，酵母裂解液中可检测到HBsAg特异性抗体识别的、分子量约33 kD目的蛋白。表达PreS2-HBsAg-UL13815-27灭活全菌体免疫小鼠后，可检测到HBsAg特异性抗体，免疫小鼠脾细胞经UL13815-27 CTL表位肽刺激，IFN-γ表达水平比对照组明显升高。结论：重组酵母全菌体成功表达了PreS2-HBsAg-UL13815-27重组蛋白，且重组酵母菌全菌体免疫小鼠可诱导产生UL13815-27特异性的细胞免疫。
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丙型肝炎病毒HLA-A*0201限制性CTL表位免疫学效应研究
目的:研究前期实验鉴定的2条丙型肝炎病毒HLA -A*0201限制性CTL(活化的CD8+T细胞)表位的体内外免疫学效应.方法:采用丙型肝炎病毒HLA-A*0201限制性CTL表位肽C_181(LLSCLTTPV)和 NS2_172(VLQAGLIRV)分别体外刺激HLA-A*0201阳性健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)和免疫HLA -A*0201转基因小鼠,采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICS)/流式细胞术检测表位肽特异性CD8+T细胞的水平.结果:C_181和NS2_172诱导HLA -A*0201阳性PBMCs产生了高水平的肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN -γ+CD8+T细胞;在C_181和NS2_172免疫的HLA -A*0201转基因小鼠脾细胞中检测到了肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ+CD8+T细胞.结论:C_181和NS2_172具有较好免疫学效应,有望用于研发CTL表位肽疫苗.
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乙型肝炎病毒特异性CTL表位变异分析
目的：初步调查乙型肝炎病毒（HBV）特异性CTL表位的序列特点，同时探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理。方法本研究采用PCR扩增法获取HBV全基因并测序，参考国外文献报道的17个热点HBV特异性CTL表位氨基酸序列，分析其与本文获得的CTL表位氨基酸序列的差别。对患者各个表位变异的差异进行卡方检验。结果获得46份HBV全基因组序列，急性乙型肝炎（AHB）15例，慢性乙型肝炎（CHB）18例，慢性重型乙型肝炎（CSHB）13例。其中40份属于B基因型，6份属于C基因型。对17个表位进行分析发现，B基因型中变异较大的表位有S183-191，S382-390，C18-27，X36-44， X52-60和X115-123；C基因型中有P816-824，C18-27，X36-44，X52-60和X115-123。P816-824表位在CHB和CSHB组的变异率为27.8%和46.2%，显著高于AHB组（0%，P＜0.01）；C23-31表位在CHB组的变异率为22.2%，显著高于AHB和CSHB组（0%，0%，P＜0.05）。结论了解HBV CTL表位序列特点，分析其与文献报道的CTL表位的差异情况，对防治乙型肝炎的重症化和慢性化具有指导意义。
