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调节性T细胞对输注树突状细胞后小鼠移植心脏的保护作用
目的 探讨在输注供者低表达CD40的树突状细胞(dendritic cells,DC)后,调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)对小鼠移植心脏的保护作用.方法 以针对小鼠CD40基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体在体外感染供者骨髓来源的DC,制备低表达CD40的耐受性DC(Tol-DC).建立小鼠异位腹腔心脏移植模型.设置异系对照组、未感染DC组及单纯慢病毒感染DC组.观察各组移植心脏存活时间,评定术后7d移植物排斥反应、病理分级,并以流式细胞术检测手术前后外周血CD4+ CD25+Treg变化水平.结果 CD40-RNAi慢病毒载体在体外感染DC 48 h后,CD40 mRNA表达明显受到抑制,抑制效率为80.9％.CD40表达明显下降,由74.37％ ±4.08％降至40.07％±4.03％ (P＜0.05).与异系对照组和未感染DC组相比,单纯慢病毒感染DC组移植心脏存活时间(14±4)d明显延长(P＜0.01)；术后7d急性排斥反应病理分级均明显降低(P＜0.05)；术后3d、7d外周血CD4+ CD25+ Treg水平均明显升高(P＜0.05).结论 CD4+ CD25+ Treg对输注供者低表达CD40的树突状细胞的小鼠移植心脏具有保护作用.
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重组腺病毒Ad-PD-L1转染供体小鼠树突状细胞对受体小鼠淋巴细胞激活的影响
目的:观察重组腺病毒载体Ad-PD-L1转染供体C57BL/6(H-2b)小鼠树突状细胞(DC)对受体DBA/2(H-2d)小鼠淋巴细胞增殖和激活的影响.方法:构建腺病毒穿梭质粒pShuttle-GFPCMV(-)-PD-L1和腺病毒骨架质粒pAdxsi-GFP-CMV-PD-L1,重组腺病毒Ad-PD-L1进行包装、扩增和纯化.分离培养供体C57BL/6小鼠的DC,分为3组:腺病毒载体Ad-PD-L1转染组(A组),空载体转染组(B组)和对照组(C组).Western blot检测转染后各组细胞PD-L1的表达.分离受体DBA/2小鼠的淋巴细胞,用羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记,将供体C57BL/6小鼠的DC和受体DBA/2小鼠淋巴细胞混合培养,流式细胞仪观察淋巴细胞的增殖情况.结果:酶切及测序证实含PD-L1的重组腺病毒载体Ad-PD-L1构建成功.转染供体C57BL/6小鼠的DC后其PD-L1的表达升高37% (P<0.05),将转染了PD-L1的DC与受体DBA/2小鼠的淋巴细胞进行共培养.与对照组相比,PD-L1表达升高后,明显地抑制了淋巴细胞的增殖和活化.受体DBA/2小鼠的淋巴细胞增殖降低41% (P<0.01).结论:转染供体C57BL/6小鼠DC后通过共刺激通路PD-1/PD-L1抑制了受体DBA/2小鼠淋巴细胞的增殖和激活.
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RNA干扰供体大鼠库普弗细胞B7分子表达对受体大鼠淋巴细胞激活的影响
目的:观察RNA干扰供体Lewis大鼠库普弗细胞(KC)B7分子表达对受体BN大鼠淋巴细胞增殖和生成IL-2的影响.方法:分离培养供体Lewis大鼠KC, 设计大鼠B7分子的干扰片段, 构建并鉴定含B7干扰片段的RNA干扰载体Psilencer 3.1H1-Neo-B7, 将RNA干扰载体转染供体大鼠的KC, 转染后采用RT-PCR方法检测KC上B7分子表达的变化. 将转染后的KC分为3组, 对照组(A); 空载体组(B); RNA干扰B7表达组(C). 分离培养受体BN大鼠的淋巴细胞, 将以上各组细胞分别与BN大鼠的淋巴细胞进行共培养, 采用MTT法检测各组淋巴细胞的增殖情况. 采用ELISA方法检测各组培养上清中IL-2的含量.结果: 分离培养的供体Lewis大鼠KC得率为5×107, 活率大于98%. 构建的RNA干扰载体经酶切和测序鉴定正确. RNA干扰KC后其B7的表达降低了22%(P<0.01). 将干扰B7表达的KC与BN大鼠的淋巴细胞进行共培养, 与对照组相比, 受体BN大鼠的淋巴细胞增殖降低了49%(P<0.01), 细胞培养上清中IL-2的分泌量下降了67%(P<0.01).结论:RNA干扰供体Lewis大鼠KC B7分子的表达可明显抑制受体BN大鼠淋巴细胞的增殖和IL-2的产生.
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通过PD-1/PD-L1共刺激通路诱导小鼠胰岛移植免疫耐受的研究
目的 观察重组腺病毒Ad-PD-L1对诱导小鼠胰岛移植免疫耐受的作用.方法 酶切含有小鼠全长PD-L1 cDNA的pSport 1-mCD274质粒,亚克隆到穿梭质粒pShuale-GFP-CMV(-)上,再通过酶切、连接等方法构建腺病毒骨架质粒pAdxsi-GFP-CMV-PD-L1,转化DH5α感受态细菌,筛选阳性克隆.经酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒.链脲霉素(250 mg/kg)腹腔注射诱导C57BL/6(H-2b)小鼠糖尿病模型,将C57BL/6小鼠随机分为3组,A为对照组,B为Ad-EGFP处理组,C为Ad-PD-L1处理组,在进行胰岛移植的前1天,经尾静脉输注5×108 pfu的Ad-PD-L1.将DBA/2(H-2d)小鼠的胰岛移植在糖尿病小鼠肾被膜下.术后监测不同时间各组小鼠的血糖变化及胰岛移植物的存活时间,并观察混合淋巴细胞反应的特异性.结果 酶切及测序证实Ad-PD-L1构建成功.Ad-PD-L1在小鼠体内可以高效地表达PD-L1,Ad-PD-L1治疗组胰岛移植物的存活时间明显延长到27.63±3.51 d(P<0.01),混合淋巴细胞反应表明小鼠对供体反应特异性降低. 结论通过PD-L1/PD-1共刺激通路可以抑制T细胞的活化,从而延长了胰岛移植物的存活时间.
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乳腺癌患者B7-CD28共刺激通路的研究
目的探讨乳腺癌患者外周血中CD28表达阳性的 T细胞数量和患者乳腺癌原代细胞表面B7-1(CD80)、B7-2(CD86)的表达水平,以探讨乳腺癌患者共刺激通路是否异常. 方法采用流式细胞技术检测乳腺癌患者外周血中CD28阳性T细胞与乳腺癌患者原代细胞B7分子的表达,并与乳腺良性疾病作比较. 结果乳腺癌患者CD28阳性的T细胞数明显低于对照组(t=2.879,P<0.05),特别是CD4/CD28双阳性T细胞数更低于对照组(t=3.017,P<0.001).乳腺癌患者原代细胞表面B7-1和B7-2表达水平都低于对照组. 结论乳腺癌患者外周血中T细胞低表达CD28分子,乳腺癌细胞低表达B7分子,从而影响B7-CD28共刺激通路,使T细胞不能有效地清除肿瘤细胞.
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腺病毒介导CD40Ig基因在大鼠肝脏移植中的作用
目的 探讨腺病毒介导CD40Ig基因(AdCD40Ig)在大鼠肝脏移植中的作用.方法 随机将供受体大鼠分4组,A:同基因移植组,B:免疫排斥组,C:AdLacZ对照组,D:基因治疗组.观察大鼠存活时间,CD40Ig、细胞因子水平和移植肝病理情况.结果 D组存活时间长于B、C组(P ＜0.05);CD40Ig浓度于术后7天达高峰;D、A组IL-2、IFN-γ水平较B、C组明显降低(P＜0.05),D组IL-10较其他组明显增加(P＜0.05);B、C两组术后出现中、重度排斥反应,汇管区淋巴细胞浸润明显,D组汇管区轻度炎症,无明显血管损伤证据,病理评级较B、C组有统计学意义(P＜0.05).结论 CD40Ig通过阻断CD40/CD40L通路,可延长移植肝存活时间,在受体内长期表达,减少汇管区淋巴细胞浸润,影响相关细胞因子的表达,对大鼠肝脏急性排斥反应有抑制作用.
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共刺激通路与同种异体器官移植免疫耐受
近年来人们发现,在实验动物模型中应用单克隆抗体或融合蛋白联合阻断或激活共刺激分子通路,诱导免疫耐受的效果常常比单独应用的效果好,可使同种异体移植受体的存活时间大大延长.
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活化CD40-CD40L通路联合Docetaxel对乳腺癌细胞增殖的影响
目的:探讨活化淋巴细胞活化的共刺激通路CD40-CD40L联合化疗药Docetaxel对乳腺癌细胞增殖的影响.方法:用rhCD40L活化CD40-CD40L共刺激通路,联合Docetaxel,用MTT法测定CD40+的乳腺癌细胞株M231、M435细胞的增殖;采用碘化丙啶(P1)掺入法测定细胞周期.结果:rhCD40L可抑制乳腺癌细胞M231、M435增殖,合用Docetaxel时乳腺癌细胞M231、M435的增殖受到进一步抑制,测定细胞周期G1期细胞数量明显增加(P＜0.05),S期细胞数量下降(P＜0.05).结论:活化CD40-CD40L通路能抑制乳腺癌细胞的增殖,这种抑制作用具周期特异性,主要将乳腺癌细胞增殖阻滞在G1期,可提高乳腺癌细胞对Docetaxel的敏感性,两者具有抑制肿瘤细胞的协同效应.
关键词： 乳腺癌 共刺激通路 抗CD40配体单克隆抗体 多西它赛 细胞周期 -
强直性脊柱炎患者外周血CD28 CD40共刺激通路相关分子的表达
目的探讨强直性脊柱炎(AS)患者外周血淋巴细胞CD28和CD40共刺激通路相关分子的表达及其与免疫功能紊乱的关系.方法采用流式细胞仪检测69例AS初诊患者和50名健康对照者CD28、CTLA-4和CD40L在外周血CD3+T细胞上的表达及CD80、CD86和CD40在CD19+B细胞上的表达.用ELISA法测定血清中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的水平.结果AS患者CD3+T细胞上的CD28、CTLA-4和CD40L,CD19+B细胞上CD86和CD40的表达均较正常对照组显著增高(P＜0.01),CD80在CD19+B细胞表达增高(P＜0.05);AS患者血清中2种免疫球蛋白IgG、IgA的水平较正常对照组显著增高(P＜0.01).结论AS患者CD28和CD40共刺激通路相关分子表达增强,机体处于免疫激活状态,CD28和CD40共刺激通路在AS的发病中可能起重要作用.
关键词： 脊柱炎 强直性 CD28/CTLA-4 CD40/CD40L 共刺激通路 -
可诱导共刺激分子与自身免疫性疾病
自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)的发病机制非常复杂,但自身反应性T、B细胞的异常激活是AID发病过程中的一个必然环节,而T细胞的激活需要双信号作用,除T细胞受体与MHC分子-抗原肽复合物的特异性结合提供第一激活信号外,还需要CD28/B7等共刺激分子对提供第二激活信号.可诱导共刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)和可诱导共刺激分子配体(inducible co-stimulator ligand,I-COSL)是CD28家族和B7家族的新成员,它们组成共刺激通路,与CD28/B7、CTLA/B7等共刺激通路一起在T细胞活化的不同时空协同作用,提供共刺激信号参与了调节T细胞的各种效应.研究ICOS/ICOSL共刺激通路在AID中的作用,对寻找新的途径来选择性地治疗AID有着重要的意义.
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骁悉在肾脏疾病中的临床应用
当今对自身免疫性疾病的免疫抑制治疗,仍依赖于皮质类固醇,有的还加用细胞毒药物或其他类型的免疫抑制剂如CTX、Aza及CsA.但是对于很多肾脏疾病仍然不能得到治愈及控制.随着免疫生物学、基因学、分子生物学的进展,使我们认识到对于肾脏损害的疾病需要针对疾病急性和慢性机制,以及不同的免疫发病机制,选择特异性免疫抑制剂去治疗,才会取得进一步的疗效.随着上述认识的出现,新一代免疫抑制剂也相继问世了,第一代免疫抑制剂激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤等.第二代免疫抑制剂环孢素、FK506.第三代免疫抑制剂骁悉、雷帕霉素.它们抑制细胞活素的合成和淋巴细胞增生,阻断抗体形成等.第四代免疫抑制剂以白细胞介素-2受体(IL-2R)单克隆抗体舒莱、赛尼哌为代表的能结合活化T淋巴细胞表面的IL-2R,从而阻断IL-2及其受体的结合,终抑制免疫排斥反应.近还有CD40L单克隆抗体,抗CD80单克隆抗体,通过阻断共刺激通路,诱导免疫耐受,故能显著延长移植物存活时间.另外,FTY720为代表的药物,其改变抗原特异性的淋巴细胞在淋巴组织中的移行,而对淋巴细胞功能没有直接作用.
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阻断共刺激通路诱导产生的无能细胞的抗原特异性免疫调节作用
目的:了解联合阻断B7-CD28和CD40-CD154通路诱导产生的小鼠免疫无能细胞的免疫调节特性和表型,以及是否具有抗原特异性.方法:Anti-CD154和anti-CD80单克隆抗体加入BALB/C(反应细胞)和C3H(刺激细胞)的混合淋巴细胞培养(MLR)体系中诱导产生无能细胞.将无能细胞或对照细胞分别加入新的BALB/C和C3H的MLR体系中观察抑制效果.在反应细胞和刺激细胞/第三方刺激细胞(C57BL/6J)之间的MLR体系中加入无能细胞观察抗原特异性.无能细胞中加入刺激细胞或rmIL-2,观察无能细胞的逆转情况.通过流式细胞仪检测无能细胞的表型.结果:无能细胞对反应细胞和刺激细胞之间的MLR具有抑制作用,且呈剂量依赖关系.无能细胞对于反应细胞和第三方刺激细胞之间的MLR无抑制作用.C3H刺激细胞和rmIL-2共同刺激才能逆转无能细胞的无能状态.无能细胞中CD25+CD4+T细胞含量上升,而CD45RBlowCD4+和CD28-CD8+T细胞含量无改变.结论:联合阻断B7-CD28和CD40-CD154通路诱导产生的小鼠免疫无能细胞具有抗原特异性的免疫调节功能,可以通过感染性耐受的方式抑制淋巴细胞的增殖.
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致敏的或记忆性CD8+T细胞能抵抗CD154对同种异体排斥的阻断作用
多次输血,以往移植失败及妊娠等引起的受体对移植物MHC抗原致敏仍是临床器官移植中有争议的问题.一些已致敏的受者排斥移植的器官,可能发生现有免疫抑制剂无法处理的早期排斥,CD8+CTL是加速移植排斥的主要物质.T细胞的活化依赖于TCR对MHC-肽复合物的识别,CD40-CD154(CD40L)的相互作用提供T细胞活化所需的共刺激信号.CD154属TNF家族成员,主要表达于成熟的活化的CD4+和一些CD8+T细胞上.在免疫级联反应中,CD40-CD154共刺激通路导致急性排斥反应.在已致敏的心脏移植受鼠中CD8+T细胞是CD154阻断作用的靶细胞,目前的资料显示CD154阻断对同种异体排斥的抑制作用只能在致敏阶段,而延迟阻断不能发生移植排斥.所以,我们的模型把CD8+T细胞作为CD154阻断的靶细胞.
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阻断可诱导共刺激分子刺激通路抑制大鼠异体肢体移植急性排斥反应的实验观察
目的 通过RNA干扰并阻断可诱导共刺激分子(ICOS)刺激通路,观察对大鼠异体肢体移植急性排斥反应的抑制作用.方法 成年Wistar、SD大鼠各27只,按体质量将大鼠随机分为排斥组、对照组、干扰组.每组9例.大鼠肢体移植采用改良法.将Wistar大鼠(供体)右下肢体移植到SD大鼠(受体)左下肢体上.移植术后排斥组不给予特殊处置;对照组阴茎背静脉注射梭华-Sofast-pSileneer 4.1空载体复合物;干扰组注射梭华-Sofagt-pSileneer 4.1-ICOSshRNA干扰质粒复合物.术后8 d每组处死SD大鼠3只,取移植肢体皮肤、肌肉及骨骼进行病理学检查;流式细胞仪及RT-PCR检测淋巴细胞表面ICOS和基因mRNA表达:分别用Wistar、Lewis大鼠脾细胞刺激,进行单向混合淋巴细胞培养,计算细胞刺激指数;ELISA双抗体夹心法检测大鼠血清细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4);另6只大鼠观察生存情况及肢体存活时间.结果 排斥组大鼠肢体平均存活时间(11.34±1.21)d,对照组平均存活时间(11.14±1.32)d,干扰组平均存活时间(16.85±1.73)d,组间比较差异有统计学意义(F=8.72,P<0.05).排斥组和对照组病理学结果提示,肢体出现了中、重度急性排斥反应,干扰组急性排斥反应轻微.光镜下排斥组和对照组皮肤出现表皮坏死、大泡形成伴有血管周围炎及大量淋巴细胞浸润,肌肉组织有弥散性淋巴细胞浸润,间质水肿同时伴有肌细胞坏死.脾淋巴细胞ICOS基因mRNA表达显示,干扰组(18.75%)明显低于排斥组(100%)和对照组(98.51%),组间比较差异有统计学意义(X2=13.57,P<0.01).淋巴细胞表面ICOS表达荧光强度,干扰组为45.59±12.87,排斥组为103.72±21.76,对照组为93.47±29.55,组间比较差异有统计学意义(F=6.89,P<0.05).单向混合淋巴细胞反应刺激指数(SI),排斥组(5.26±0.42、5.18±0.29)和对照组(5.37±0.27、4.93±0.44)明显高于干扰组(2.37±0.35、4.87±0.36),组间比较差异有(无)统计学意义(F=7.29,P<0.05;F=6.19,P0.05).IFN-γ和IL-4表达.干扰组(230.17±38.47、160.32±59.13)较排斥组(490.73±51.48、230.67±45.21)和对照组(480.15±43.96、240.53±47.36)均降低,组间比较差异有统计学意义(F值分别是7.23、6.75,P<0.05).结论 体内转染pSilencer4.1-ICOSshRNA干扰质粒能有效阻断T细胞共刺激通路,抑制急性排斥反应,延长移植肢体存活时间.
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胃癌患者B7-CD28共刺激通路的研究
目的探讨胃癌患者外周血中CD28+T细胞数量和患者胃癌原代细胞表面B7的表达水平,以探讨胃癌患者共刺激通路是否异常.方法采用流式细胞术检测胃癌患者外周血中CD28+T细胞与胃癌患者原代细胞B7分子的表达,并与胃良性疾病作比较.结果胃癌患者CD28+T细胞数低于对照组(P＜0.01).胃癌患者原代细胞表面B7-1(CD80)、B7-2(CD86)表达水平低于对照组(P＜0.01).结论胃癌患者外周血T细胞低表达CD28分子,胃癌细胞低表达B7分子,从而影响B7-CD28共刺激通路,使T细胞不能有效地清除肿瘤.
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诱导器官移植免疫耐受的新进展
免耐受是机体免疫系统在接触某种抗原后所产生的对该抗原的特异性免疫无应答状态.抗原刺激机体产生免疫应答是一个复杂的过程,涉及到多种免疫细胞和分子间的相互作用.对此过程的各个阶段和环节进行干预和调控从而诱导免疫耐受,是近年来移植免疫学领域的研究热点.
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B7-CD28共刺激通路与系统性红斑狼疮的相关性研究
目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞(PBLC)CD28、B7-1(CD80)及B7-2(CD86)的表达及其意义,探讨SLE患者共刺激通路是否异常.方法 采用流式细胞仪检测30例SLE患者外周血淋巴细胞的CD28、B7-1及B7-2,并以15例正常人作为对照.结果 SIE患者外周血淋巴细胞中B7-1的表达水平与正常对照组差异无显著性,而B7-2的表达水平明显低于正常对照组(P＜0.01);SLE患者外周血淋巴细胞中CD28的表达水平明显低于正常对照组(P＜0.05).结论 SLE患者PBLC上的B7.2及CD28的表达降低,影响B7-CD28共刺激通路,可能与SLE的发病有关.
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CD40-CD40配体共刺激通路在甲状腺相关性眼病发病中作用研究进展
甲状腺相关性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是器官特异性自身免疫性疾病,其发病机制涉及T细胞对几种自身抗原的耐受丧失及以T细胞为主的免疫细胞不适当活化.T细胞活化需要识别共刺激信号,其中CD40-CD40L作为T细胞活化的共刺激信号之一,在TAO的发病机制中起重要作用.本文就CD40-CD40L分子细胞学特征、功能及近年关于其在TAO发病机制中的作用研究进展作一综述.
关键词： CD40-CD40配体 共刺激通路 甲状腺相关性眼病 -
CD40-CD154共刺激信号及其在角膜移植排斥中的研究进展
角膜移植手术失败的主要原因是T细胞介导的免疫排斥反应,T细胞的充分活化需要共刺激信号的协同作用.研究表明CD40-CD154信号在角膜移植排斥中具有重要意义,阻断该信号可延长移植物的存活.本文就其分子特性、免疫学功能进行了综述,重点探讨了阻断该信号抑制角膜移植排斥反应的效应和机制.
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CD28、CD40通路共刺激对淋巴细胞增殖反应的影响及CsA的抑制作用
目的:探讨CD28、CD40通路共刺激后淋巴细胞增殖反应的变化及免疫抑制剂环孢素A(CsA)、抗CTLA4单克隆抗体对共刺激通路激活后淋巴细胞增殖反应的影响.方法:采用单克隆抗体与淋巴细胞表面CD3、CD28及CD40 L分子结合产生相应刺激信号,根据刺激条件不同设组为:①抗CD3单抗单刺激(A组)(剂量为10μg/L、100 μg/L、1 000μg/L);②抗CD3单抗+抗CD28单抗(B组);③抗CD3单抗+抗CD40 L单抗(C组);④抗CD3单抗+抗CTLA4单抗(D组)共刺激(A、B、C、D组中抗CD3单抗剂量固定为100μg/L,其余3种单抗各设10μg/L、100μg/L、1 000 μg/L 3种剂量);⑤抗CD3单抗+抗CD28单抗+抗CD40 L单抗(E组);⑥抗CD3单抗+抗CD28单抗+抗CTLA4单抗(F组)共刺激(E、F组中抗CD3单抗和抗CD28单抗的剂量固定为100 μg/L,抗CD40 L单抗和抗CTLA4单抗的剂量各设10μg/L、100μg/L、1 000 μg/L);⑦CsA干预组:抗CD3单抗+CsA(G组);⑧抗CD3单抗+抗CD28单抗+CsA(H组);⑨抗CD3单抗+抗CD28单抗+抗CD40L单抗+CsA(Ⅰ组),G、H、I组中所有单抗浓度均固定为100μg/L,CsA浓度设为10 μg/L、100 μg/L、1 000 μg/L.采用[3H]-TdR同位素掺入法测定淋巴细胞增殖水平,液体闪烁计数仪测定放射性计数值.结果:用抗CD3单抗+抗CD28单抗共刺激后,淋巴细胞增殖反应明显高于抗CD3单刺激,而在抗CD3单抗+抗CD40L单抗刺激组,淋巴细胞增殖反应低于抗CD3单刺激组.抗CTLA4单抗所提供的刺激信号可抑制抗CD3单刺激及抗CD3+抗CD28共刺激导致的淋巴细胞增殖反应,并且随着抗CTLA4单抗剂量的增加,抑制作用增强.CsA对共刺激后的淋巴细胞增殖反应有抑制作用,且随着剂量增大其抑制作用也增强,但对单刺激后增殖反应的抑制作用更为明显.结论:CD28共刺激通路在淋巴细胞活化中起着关键作用.抗CD40L单抗的刺激作用可能被其对T细胞与抗原递呈细胞(APC,包括B细胞等)间的阻断效应所掩盖.抗CTLA4单抗及CsA对共刺激后淋巴细胞的增殖反应均有抑制作用.
