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两种不同的方法对急性白血病脑脊液查白血病细胞的比较
部分急性白血病患者可因其骨髓外浸润而累及中枢神经系统.脑脊液(CSF)的细胞学检查是诊断中枢神经系统白血病的主要方法之一.我们对40例(次)急性白血病患者的脑脊液用FMU-5微型脑脊液细胞玻片离心器收集细胞(玻片离心法)和常规的离心后沉渣涂片(常规法)两种方法同时查CSF中的白血病细胞.现将结果报道如下.
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蟾蜍毒素对P-gp阳性白血病K562细胞的杀伤作用
目的:探讨蟾蜍毒素混合物对白血病K562敏感株和耐柔红霉素株细胞的杀伤作用.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的生长率,流式细胞仪测定细胞的DNA 含量,细胞涂片经Wright-Giemsa染色观察细胞凋亡.结果:蟾蜍毒素混合物＞0.02 μg/mL以上时,抑制K562/S和K562/D细胞的增殖;在0.04 μg/mL以上浓度时,K562/D细胞的生长率明显降低,与K562/S相比差异有统计学意义.当0.04 μg/mL的蟾蜍毒素混合物处理K562/S和K562/D细胞24 h,仅K562/D细胞发生明显的G2/M期阻滞;处理48 h,K562/S和K562/D均发生明显的G2/M期阻滞.0.4 μg/mL的蟾蜍毒素混合物使K562/D细胞在24 h就发生明显凋亡,而K562/S细胞未见凋亡.结论:蟾蜍毒素混合物对K562/S和K562/D细胞均具有杀伤作用,与K562/S相比,对K562/D的杀伤作用明显增强,并且不受P-gp影响.
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急性白血病各亚型共刺激分子CD80和CD137L的表达特点
目的:研究急性白血病(AL)各亚型肿瘤细胞表面共刺激分子CD80(B7.1)和CD137L(4-1BBL)的表达特点及其在急性白血病发病学和治疗学中的重要作用.方法:应用流式细胞术(FACS)检测了50例AL患者(其中ANLL M1 8例,M2 11例,M3 7例,M4 3例,M5 10例,M6 2例,ALL 9例)肿瘤细胞表面两种重要的共刺激分子CD80和CD137L的表达.结果:1)所有病例中,CD80和CD137L的表达倾向相同,即单核细胞起源之AL表达阳性率高(40%;50%),粒细胞起源之低(0;0),淋巴细胞起源之属中(11%;11%);CD137L表达稍高于CD80,但差异无显著意义,P＞0.05;2)同一病例CD80和CD137L的表达不尽相同,即同一白血病标本中不存在二者同时表达阳性.结论:AL细胞表面CD80和CD137L的共表达是激活T细胞介导的抗肿瘤免疫反应所必需的,其缺陷是急性白血病尤其是急性髓性白血病(AML)细胞逃避宿主免疫监视的重要原因,可能是其发病机理之一.
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地塞米松诱导CEM细胞凋亡过程中Survivin和Caspase-3基因表达的研究
目的:探讨地塞米松(dexamethasone,DEX)诱导CEM细胞凋亡过程中生存素(Survivin)和半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)基因表达.方法:台盼蓝拒染法测定细胞活力,绘制增殖曲线;流式细胞仪解析DEX诱导CEM细胞凋亡;Western blot检测Survivin和Caspase-3蛋白表达;RT-PCR检测Survivin基因表达.结果:1)DEX以时间、剂量依赖方式抑制CEM细胞增殖.0.1～10 μmol/L DEX于48h开始明显抑制CEM细胞的生长.24、48、72 h抑制细胞增殖50%的药物浓度分别为9.8、0.9和0.4 μmol/L.2)随DEX剂量增大亚二倍体细胞百分数逐渐增加.5 μmol/LDEX处理12～48 h,亚二倍体细胞从14.9%升至46.2%;3)5 μmol/L DEX处理12～72 h,Survivin蛋白从54.6%下调至9.7%;Survivin mRNA从76.4%(6 h)降至18.3%(72 h);4)DEX作用12h之内只能检测到非激活状态的procaspase-3,处理24 h后出现17×103活性亚基,直至72 h.结论:DEX诱导CEM细胞凋亡时下调Survivin基因表达,活化Caspase-3.
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Parthenolide对急性单核细胞白血病细胞株THP-1增殖与凋亡影响的观察
目的:探讨Parthenolide(PN)对急性单核细胞白血病细胞株THP-1的细胞增殖作用及其可能的作用机制.方法:CCK-8法检测不同浓度处理的THP-1细胞的半数抑制浓度(IC50);以6 μmol/L的PN作用于THP-1细胞,设正常细胞对照及DMSO溶剂对照,以RT-PCR检测各组细胞核因子kB(NF-KB)p65因子和阻遇物IkB的mRNA表达,以蛋白质印迹法检测p65和IkB全蛋白的表达及p65核蛋白的表达.结果:PN对THP-1细胞有增殖抑制作用,PN作用12 h的IC50为8～10μmol/L,24 h的IC50为6～8μmol/L,1～10μmol/L PN的抑制率随浓度的增加而加大,存在剂量-效应关系,大抑制率12 h为(69.56±2.52)%,24 h为(68.20±2.04)%.6 μmol/L PN作用于细胞24 h,与两对照组相比,p65 mRNA及总蛋白的表达差异无统计学意义,但核蛋白表达明显下降,P<0.05;IKB mRNA及总蛋白的表达均有明显上调,P<0.05.结论:PN可通过上调细胞IKB表达,阻滞p65由细胞质向细胞核转运,从而下调NF-kB通路活性,而抑制THP-1细胞的增殖.
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维生素E琥珀酸酯诱导耐药白血病K562/ADM细胞凋亡的研究
目的:研究维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate , VES)对多药耐药白血病K562/ADM细胞的诱导凋亡作用及分子机制.方法:以体外培养的K562/ADM细胞为研究对象,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) 比色法检测细胞增殖活性,Wright-Giemsa染色、DNA凝胶电泳和流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡;FCM测定细胞Fas、Bcl-2和p53蛋白表达水平.结果:VES可显著抑制K562/ADM细胞的生长及增殖,P=0.004.光镜下可见K562/ADM细胞呈典型凋亡的形态学改变.DNA凝胶电泳显示典型的凋亡DNA梯形条带.FCM细胞周期分析显示,G1期阻滞,亚G1期细胞比例增高,P=0.005;Fas蛋白表达明显上调,P=0.002;Bcl-2蛋白表达下调,P=0.000;p53蛋白表达无明显变化.结论:VES可诱导K562/ADM细胞凋亡,作用机制可能与其上调Fas表达和下调Bcl-2表达有关.
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CD34+的M2a转化为M4c1例分析
急性白血病为一种造血干细胞恶性克隆性疾病,随着免疫学、细胞遗传学等在白血病诊治过程中的应用,使我们更深的了解其内在本质.我院收治1例白血病患者,治疗过程中出现形态学改变,其变化过程分析如下.
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三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中IκB-α,NF-κB蛋白表达的研究
目的探讨三氧化二砷(As2O3)诱导慢性粒细胞性白血病K562细胞凋亡过程中IκB-α以及NF-κB的表达变化.方法应用不同剂量As2O3诱导K562细胞凋亡,以Western-Blot免疫印迹电泳检测NF-κB,IκB-α的表达,流式细胞术检测K562细胞凋亡及分析IκB-α的阳性表达率变化.结果 As2O3可诱导K562细胞凋亡,随着As2O3浓度从1 μmol/L到4 μmol/L的增高细胞凋亡率由16.0%增加到60.6%,胞浆中IκB-α阳性表达率则由88.1%减少到49.2%,胞核中p65量逐渐增加.结论 As2O3可诱导K562细胞凋亡,在此过程中伴有NF-κB的激活,在一定剂量范围内激活的程度随着砷剂浓度的增加而增强.砷剂激活NF-κB通过其抑制蛋白IκB-α的降解.
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K562/VCR单克隆多药耐药亚细胞系的建立
目的建立耐药性较为均一的K562/VCR多药耐药(MDR)亚细胞系,为更好研究多药耐药性的产生以及逆转机制提供良好的实验材料.方法采用三种不同的培养方法和有限稀释法对K562/VCR MDR细胞系进行亚克隆培养,并用流式细胞仪(FCM)测定p170的表达情况.结果加用培养上清或滋养细胞存在的条件下,亚克隆效率明显高于无条件培养液(P<0.05,P<0.01).建立的单克隆MDR亚细胞系6株,FCM分析证实p170呈不同程度的表达,其中表达高者为31.4%(K562/VCR A5-A1).结论 (1)耐药细胞系的亚克隆培养需要条件培养液或滋养细胞的支持,后者较前者更为有效.(2)成功建立了6株K562/VCR单克隆多药耐药亚细胞系.
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多参数流式细胞术观察251例白血病细胞CD14表达的意义
目的探讨CD14在白血病细胞的表达及其在白血病诊断和鉴别诊断中的意义.方法采用CD45/SSC参数设门多色流式细胞术分析251例白血病细胞CD14及其它白血病相关抗原的表达情况.结果 251例中有19例(7.5%)白血病细胞表达CD14,95例急性髓系白血病(AML)中16例(16.8%)白血病细胞表达CD14,130例淋系白血病未见CD14阳性的病例.M4和M5bCD14的阳性率(9/14;6/6)明显高于M2(1/30)(P=0.001;P=3.6×10-6)及M5a(0/5)(P=0.03;P=2.2×10-3).标准CD14单抗均不与5例M5a细胞反应,而制CD14新克隆2F9单抗则全部阳性.5例M5a中1例CD15和29例M2中13例CD11b的阳性率明显低于M5b(6/6,P=0.02;6/6,P=0.02).在AML组中,CD14的表达与CD117呈负相关(r=-0.2,n=81,P=0.03),与CD11b、CD15及HLA-DR呈正相关(r=0.5,n=93,P=0.001;r=0.4,n=95,P=0.001;r=0.2,n=95,P=0.02).结论 CD14有助于淋巴系白血病、髓系白血病及其单核细胞相关性白血病的诊断与鉴别,其对单核细胞相关性白血病免疫分型诊断中的特异性为96.7%,敏感性为60.0%.
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紫杉醇对K562细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用
目的探讨紫杉醇体外抑制K562细胞株及诱导凋亡的作用.方法体外培养K562白血病细胞株,以不同浓度紫杉醇处理12～72小时后,用MTT法测定细胞生长抑制作用,用细胞形态学观察和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,用流式细胞仪(FCM)检测细胞DNA含量及细胞周期.结果 K562细胞经紫杉醇处理后细胞生长受抑,对K562细胞的半数抑制浓度IC50为0.84 μg/ml.经药物作用后可见细胞染色质浓聚和凋亡小体形成,FCM显示细胞凋亡率明显增加,但电泳检测未见DNA裂解.结论紫杉醇能抑制K562细胞的生长,诱导细胞凋亡可能为其抗肿瘤作用机制之一.
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白细胞介素2激活外周血、脐带血和骨髓单个核细胞培养上清对人白血病细胞株的影响
目的探讨用白细胞介素2(IL-2)激活的外周血(APB)、脐带血(ACB)和骨髓(ABM)单个核细胞的培养上清对肿瘤细咆的作用,及其作用的可能机制.方法应用MTT法和集落培养法在体外检测了APB、ACB和ABM培养上清对HL60和K562细胞的作用,用ELISA法检测了各种上清中TNF-a和IFN-γ的产生情况.结果APB、ACB和ABM培养上清都可以产生TNF-a和IFN-γ,对HL60和K562细胞有一定抑制作用,以APB培养上清强.结论应用IL-2净化自体干细胞移植物中混杂的肿瘤细胞时,培养上清中的细胞因子或其它成分也可以直接抑制肿瘤细胞.
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小檗胺诱导白血病细胞株NB4细胞凋亡及其机制的研究
目的:探讨小檗胺对白血病细胞系NB4生长的影响及其机制.方法:体外培养人白血病细胞株NB4细胞,经不同浓度小檗胺处理不同时间后,MTT法检测药物对NB4细胞的抑制作用;细胞形态学观察和DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡;流式细胞仪检测DNA含量及细胞周期;巢式PCR及RT-PCR检测PML/RARα融合基因及Survivin基因表达及流式细胞仪检测Caspase3阳性表达率.结果:经不同浓度小檗胺处理不同时间后,NB4细胞生长出现明显的抑制,并呈现明显的时间剂量依赖性,48 h IC50为3.860μg/ml;细胞形态学观察可见细胞凋亡现象,DNA琼脂糖电泳显示典型的凋亡梯形图;流式细胞仪检测发现细胞凋亡率明显增加,经48 h作用后,凋亡率从2.83%增至12 μg/ml时的58.44%;虽未发现药物作用后PML/RARα基因表达量的改变,但检测到NB4细胞经药物作用后Survivin基因表达量的减少和Caspase3表达的增加,Caspase3阳性率从对照组的2.06%增至12 μg/ml时的70.89%.经相关性分析,随着细胞Survivin表达水平的下降和Caspase3表达水平的增高,NB4细胞凋亡率相应地增高.结论:小檗胺对NB4细胞有增殖抑制作用,诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的重要机制之一,但不是通过作用于NB4细胞特异性融合基因PML/RARα发挥作用的,其抗凋亡的可能分子机制之一是抑制Survivin基因的表达和增加Caspase3的表达.
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白细胞介素-24增强溶瘤腺病毒抗白血病作用机制研究
目的:研究白细胞介素-24(IL-24)增强溶瘤腺病毒(CRAd)ZD55抗白血病作用的机制.方法:用流式细胞仪检测ZD55对白血病细胞株Mutz-1的感染率;分别用ZD55、ZD55-IL-24和携带IL-24的非增殖型腺病毒(Ad-IL-24)处理白血病细胞(实验组),对照组为PBS.Western blot检测CRAd对白血病细胞血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响;用免疫组化检测Mutz-1白血病荷瘤模型经CRAd治疗后肿瘤病理组织CD31和VEGF表达.结果:用10、100病毒感染复数(MOI)的ZD55感染白血病细胞48 h,感染率分别为5.1%和42.3%.ZD55-IL-24使VEGF蛋白表达显著下降,而Ad-IL-24感染后未能使VEGF明显下调.ZD55对VEGF蛋白表达有轻度抑制作用.免疫组化结果显示,Ad-IL-24有轻度抑制血管新生作用,ZD55治疗组有明显的抑制血管新生作用,而ZD55-IL-24治疗组血管新生几乎消失.结论:IL-24通过抑制VEGF表达和血管新生增强ZD55在体外和动物实验中的抗白血病作用.
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嵌合型溶瘤腺病毒SG235体外对白血病细胞抑制作用的实验研究
目的:研究嵌合型溶瘤腺病毒(CRAd)SG235的抗白血病作用.方法:用流式细胞术(FACS)检测原代白血病细胞CD46的表达和SG235对多种白血病细胞株的感染率,MTT法研究SG235对Kasumi-1细胞的生长抑制,Annexin-V/PI染色和TUNEL法观察SG235诱导白血病细胞凋亡的作用,Western blot检测CRAd对磷酸化Akt蛋白表达的影响.结果:大多数急性白血病患者原代白血病细胞表达CD46.用50病毒感染复数(MOI)的SG235-EGFP感染Mutz-1、Kasumi-1、K562、HL60、Molt-4、RPMI8226、L428、Jurkat细胞,感染率分别为45.1%、35.7%、54.2%、37.0%、30.1%、67.1%、17.2%、33.1%.SG235对Kasumi-1细胞有显著的生长抑制作用,作用24 h和48 h IC50值分别为79.0 MOI、38.4 MOI.SG235能诱导多种白血病细胞株凋亡,而且呈剂量依赖性;并能抑制Kasumi-1细胞磷酸化Akt活性.结论:嵌合型溶瘤腺病毒SG235能有效地感染白血病细胞,并能抑制白血病细胞的生长,诱导其凋亡.
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急性白血病肝浸润~(31)P磁共振波谱学分析及临床意义
目的:通过对白血病肝脏浸润(LIL)病例与正常对照组的肝脏二维化学位移磁共振31磷波谱成像(2D CSI ~(31)P MRS)对照研究,探讨LIL的肝脏磷化合物代谢特征变化.方法:收集LIL 15例,并与12例正常肝脏作对照,进行2D CSI ~(31)P MRS肝脏扫描,检测各种磷代谢物包括磷酸单酯(PME)、磷酸双酯(PDE)、三磷酸腺苷(ATP)、无机磷(Pi)的相对值,经体模所测校正系数校正后,分析PME、PDE、Pi、ATP的校正相对值(以下简称相对值),及PME/PDE、PME/ATP、PDE/ATP、Pi/ATP、 PME/(PME+PDE)的比值变化.结果:在所测的肝脏磷代谢物相对值中,仅LIL组的PME相对值升高,为1.992±0.876,与对照组(1.167±0.427)相比有显著性差异,P<0.05;其它各磷代谢物相对值均无差异.比较LIL与正常对照组之间磷代谢物比值,发现LIL组中与PME相关的比值包括PME/PDE、PME/ATP和PME/(PME+PDE)比值升高,分别为0.551±0.339、1.402±0.654和0.326±0.13,与对照组(分别为0.254±0.059、0.792±0.232和0.199±0.049)相比有显著性差异,P<0.01;LIL组的其它磷代谢物比值与对照组相比均无显著差异.结论:肝~(31)P MRS检查为LIL提供新的非创伤性检测和评价方法,肝脏PME相对值及其相应比值升高提示白血病患者肝浸润存在的可能.
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Q39在缺氧条件下诱导人白血病K562细胞凋亡
目的:探索3-(4-溴苯基)-2-(乙砜基)-6-甲基喹喔啉-1,4-二氧化物(Q39)在缺氧条件下诱导人白血病K562细胞凋亡的作用机制.方法:①MTT法测定Q39对K562细胞的体外抑制作用,计算其半数抑制浓度(IC50).②4,6-Diamidino-2-Phenylindole(DAPI)荧光染料染色观察细胞的凋亡情况.③流式细胞术测定K562细胞凋亡率.④JC-1染色法观察Q39对K562细胞线粒体膜电位(△ψm)的影响.⑤Western-blotting法检测低氧条件下细胞内procaspase-3、cleaved caspase -3、PARP、Bax、Bcl-2和HIF-1α蛋白表达的变化.结果:在缺氧(3%O2)条件下,Q39对K562细胞表现出较强的体外抑制增殖作用,IC50为(0.21±0.05)μmol/L.经DAPI染色证实,Q39作用6 h后开始诱导K562细胞凋亡,后期细胞体积缩小,并出现凋亡小体.流式细胞术结果显示:K562细胞与Q39共孵育0、6、12和24 h的凋亡率分别为2.8%、3.2%、5.9%和19.2%.JC-1染色实验结果显示:孵育0、6、12、24和48 h后Q39使K562细胞的线粒体△ψm呈明显下降趋势,并且具有时间依赖关系.Western- blotting结果显示:Q39降低K562细胞的HIF-1α、procaspase-3和Bcl-2蛋白表达,明显增加Bax和cleaved caspase-3蛋白表达,并且促使PARP裂解.结论:Q39在缺氧条件下对K562细胞有较好的抑制作用,并能通过降低HIF-1α蛋白表达和调节其他凋亡相关蛋白表达,促使K562细胞线粒体△ψm下降,诱导细胞凋亡.Q39诱导细胞凋亡可能是通过线粒体和HIF-1α信号转导通路实现的.
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Pin1在恶性血液病细胞和细胞周期中的表达
目的:研究Pin1(肽酰脯胺酰顺反式易构酶)在髓系、淋系10种恶性血液病细胞株中的表达情况以及其与不同细胞周期的关系.方法:利用Realtime-PCR检测血液病细胞株的Pin1表达,同时用Thymidine和Nocodazole将细胞阻断在不同的细胞周期,用Realtime-PCR及Western Blot的方法,检测Pin1的mRNA和蛋白的表达水平.结果:Pin1在恶性血液病细胞株中mRNA的表达明显高于正常人骨髓单个核细胞的表达(F=10.508,P＜0.01),其在髓系血液病细胞株和淋系恶性血液病细胞株中的表达均较正常人骨髓单个核细胞明显增高(分别为F=13.584,P＜0.01;F=5.339,P＜0.05).Pin1在G1期mRNA的表达水平显著高于S期(F=40.572,P＜0.05),S期与M期比较没有明显差异(F=8.309,P＞0.05).但在蛋白水平上来看Pin1的变化不明显.结论:Pin1的mRNA在恶性血液病细胞中呈高表达,其表达水平与细胞周期有关,其中以G1期为高,S期低.
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流式细胞术检测急性白血病中枢神经系统微量残留病变
目的探讨流式细胞术在儿童急性白血病脑脊液寻找幼稚细胞方面的价值.方法对22例急性白血病患儿的脑脊液(CSF)除常规检查外,另同时使用离心沉淀涂片法和流式细胞仪技术进行幼稚细胞检测.结果经流式细胞术(FCM)检测22例急性白血病患儿的脑脊液中8例发现幼稚细胞,而离心沉淀涂片法仅3例检出幼稚细胞.结论流式细胞术在白血病患儿脑脊液寻找幼稚细胞方面敏感性优于离心沉淀法.
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核干细胞因子mRNA在原代白血病细胞中的表达
[目的]探讨急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞(BMNC)核干细胞因子(NS)基因的表达水平.[方法]采用半定量RT-PCR方法检测52例AL患者及20例骨髓正常的非恶性血液病(对照)的BMNC NS基因的表达水平.[结果]在52例AL患者的BMNC中均存在NS基因的表达,20例非恶性血液病对照的BMNC极低表达或不表达NS基因.急性淋巴细胞白血病患者和急性非淋巴细胞白血病患者NS mRNA 的相对表达量均明显高于对照组 (P＜0.01).但在AL各亚型之间NS mRNA的表达无明显差异(P=0.253),NS mRNA的表达水平与患者初诊时骨髓原始细胞数呈正相关,与外周血白细胞数及血小板数无关.[结论]NS基因在AL原代细胞中表达上调,但NS mRNA 表达水平与AL患者某些临床特征无相关性.
