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新型细胞因子IL-24真核表达载体的构建、表达及其对肿瘤的抑制作用
目的:构建IL-24真核表达质粒,并研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用.方法:采用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-C1-IL-24.用脂质体法将重组质粒及空载体外转染HIC细胞,再经激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察其表达,用MTT法检测HIC细胞的体外增殖能力,用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡.小鼠皮下接种转染IL-24真核表达质粒或空载的B16细胞观察其体内致瘤性的变化.小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的生长抑制作用.结果:pEGF-C1-IL-24转染HIC细胞后,LSCM可观察到其表达.IL-24基因转染的HIC细胞体外增殖能力明显受到抑制,G2-M期细胞比例增高,细胞被阻滞在G2-M期.转染IL-24的B16细胞体外致瘤率降低.与对照组相比,IL-24基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制(P＜0.05).结论:IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑.瘤内注射pEG,FP-C1-IL-24可抑制肿瘤生长,具有明显的抗肿瘤作用.
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IL-24基因联合电离辐射对前列腺癌PC-3细胞凋亡的影响
目的:探讨人白细胞介素24(IL-24)基因联合X射线对人前列腺癌PC-3细胞凋亡的影响,为IL-24基因联合电离辐射治疗肿瘤奠定实验基础.方法:检测电离辐射对PC-3细胞凋亡的影响分为假照射组及2、4、6、8、12和18 Gy X射线照射组,检测IL-24目的基因的表达分为对照组(0.01 mol·L-1PBS)、空载体组[pcDNA3.1(+)载体]和IL-24基因组;检测IL-24基因联合电离辐射对PC-3细胞凋亡的影响分为对照组、空载体组、IL-24基因组、单纯照射组(6 Gy)、空载体联合照射组以及IL-24基因联合照射组.碱裂解法提取纯化质粒DNA,用PEI转染质粒DNA至PC-3细胞中,目的基因表达的检测采用RT-PCR法.AnnexinV-FITC和PI双染后,采用流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞凋亡的变化.结果:与假照组比较,2和4 Gy X射线照射48 h后PC-3细胞凋亡百分率无明显变化,6 Gy X射线照射后细胞凋亡百分率开始明显升高(P<0.01),且细胞凋亡百分率随剂量增大而增加,约是假照组的1.6～3.0倍.PC-3细胞中对照组和空载体组均未观察到IL-24基因的表达,而IL-24基因组则可见IL-24基因的表达;以上3组均有GAPDH基因的表达.IL-24基因联合照射组与对照组、空载体组、IL-24基因组、单纯照射组和空载体联合照射组比较,早期凋亡细胞数均有上升趋势,除单纯照射组外,与其他组比较差异均有显著性(P<0.05);晚期凋亡和坏死细胞数也均有上升趋势,其中与对照组、单纯照射组和空载体联合照射组比较显著升高(P<0.05或P<0.001);凋亡和坏死的总细胞数均有上升趋势,除IL-24基因组外,与其他组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01).结论:IL-24基因联合电离辐射能够有效诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡.
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人白细胞介素24基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达
目的:构建人白细胞介素24(hIL-24)基因原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达hIL-24蛋白,并测定其生物学活性.方法:用PCR方法从含有hIL-24的质粒中扩增hIL-24 cDNA序列,测序鉴定正确后,应用基因重组技术构建PQE/hIL-24,并转入大肠杆菌(E.coli) M15.IPTG诱导表达目的蛋白,镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析鉴定结果,应用外周血单核细胞(PBMCs),通过ELESA法分别在48和72 h检测rhIL-24刺激的PBMCs中IL-8、IFN-γ及TNF-α产生情况.结果:获得与GenBank中报道一致的hIL-24基因片段.SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,获得具有hIL-24免疫原性、相对分子质量约为18400目的蛋白.Ni2+-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白,获得rhIL-24蛋白刺激的PBMCs,PBMCs分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平显著高于未刺激前分泌水平(P<0.05),rhIL-24具有与天然hIL-24蛋白相同的生物学活性.结论成功地构建了hIL-24的原核表达载体,在E.coli中高效表达了rhIL-24蛋白,获得了与天然hIL-24蛋白具有相同生物学活性的rhIL-24.
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IL-24对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用
[目的]研究携带IL-24基因的真核表达质粒对小鼠黑色素瘤B16细胞的凋亡和体外增殖的影响.[方法]采用重组DNA技术构建含有IL-24基因的真核表达质粒pEGFP-N1-IL-24,用脂质体法将pEGFP-N1-IL-24转染B16细胞,用荧光显微镜观察其表达,在生物显微镜下观察细胞的形态学变化,用吖啶橙/澳化乙锭(AO/EB)法检测细胞凋亡,用MTT比色法检测B16细胞的体外增殖能力.[结果]荧光显微镜下观察到pEGFP-N1-IL-24可在B16细胞中表达;生物显微镜下显示转染IL-24基因的B16细胞皱缩、成团;AO/EB法检测显示转染IL-24的B16细胞核染色质着橘黄色或橙红色,并呈固缩状;MTT 比色法显示IL-24明显抑制B16细胞的生长,与对照组相比较差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]外源性IL-24基因在体外对小鼠黑色素瘤B16细胞有显著的诱导凋亡和抑制增殖的作用.
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白细胞介素24对人树突状细胞活化和成熟的诱导作用
目的:研究白细胞介素24(interleukin-24,IL-24)对人外周血单核细胞来源树突状细胞(dendritic cell,DC)表型及抗原提呈功能的影响.方法:利用Western blot检测DC培养上清中IL-24的分泌水平;利用半定量RT-PCR方法分析不同条件下DC表达IL-24受体及趋化因子受体的情况;通过流式细胞术分析检测IL-24共培养后DC细胞表面CD80、CD86、MHCⅡ类分子的表达水平;采用体外混合淋巴细胞实验分析经IL-24共培养对DC抗原提呈功能的影响.结果:体外培养过程中,用LPS刺激DC可诱导其分泌IL-24;同时,LPS还能上调DC表达IL-24受体亚单位IL-22R1.IL-24作用于DC可上调DC细胞表面CD80、CD86及MHCⅡ类分子的表达,并增强DC对T细胞的抗原提呈功能.结论:IL-24这一新型的细胞因子在体外实验中能促进DC的表型成熟,增强DC的抗原提呈功能.
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白细胞介素24的研究进展
白细胞介素24(Interleukin-24,IL-24)又称为黑色素瘤分化相关基因7(melanoma differentiation-associated gene 7,mda-7),它主要由CD3-T淋巴细胞和单核细胞表达,属分泌型蛋白,由206个氨基酸组成,属于IL-10家族的成员.mda-7/IL-24作为细胞因子能诱导多种其它细胞因子的表达;作为肿瘤抑制基因能选择性诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长,以及引起黑色素瘤细胞末端分化.在肿瘤免疫治疗中具有应用价值.
关键词： 白细胞介素24 黑色素瘤分化相关基因7 凋亡 肿瘤治疗 -
携带mda7/IL24的三调控增殖腺病毒治疗肝癌的体外实验
目的:构建缺失E1A区24 bp,由端粒酶反转录酶基因启动子和缺氧基因启动子调控的增殖腺病毒SG600-IL24,研究人白细胞介素24(interleukin 24,IL24)在肝癌细胞内的表达水平和SG600-IL24的增殖情况及其对肝癌细胞的杀伤作用.方法:利用DNA克隆和重组技术,构建SG600-IL24.ELISA检测1124在肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7404和正常成纤维细胞BJ内的表达.半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)法检测SG600-IL24在3种细胞内48和96 h的增殖情况.MTT法和细胞病理效应(cytopathic effect,CPE)染色法检测SG600-IL24在不同MOI值对3种细胞的杀伤作用.结果:IL24在SMMC-7721和BEL-7404细胞内高表达而在BJ细胞内低表达.感染48和96 h后,SG600-IL24在SMMC-7721、BEL-7404和BJ细胞内分别增殖794和7940倍、622和7810倍、20和200倍.MTT结果显示,杀伤50%和90%的SMMC-7721、BEL-7404和BJ细胞所需SG600-IL24的MOI值分别为0.3和5,3和20,50和150.CPE染色显示,SG600-IL24对肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404有明显杀伤作用,而对BJ细胞无明显影响,并且该病毒的杀伤能力比增殖腺病毒ZD55-1124和非增殖腺病毒Ad-IL24强.结论:SG600-IL24高效感染肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404后,病毒增殖活跃,IL24的表达量显著升高.SG600-IL24对此2种肝癌细胞有良好的特异性杀伤作用,而对正常细胞没有明显影响,为应用该病毒治疗肝癌的体内研究建立了基础.
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IL-24诱导肿瘤细胞凋亡的信号转导通路
应用增生活跃和诱导终末分化的人类HO-1黑素瘤细胞产生的cDNA文库进行减数杂交,获得了一组黑素瘤分化相关基因,其中mda-7/IL-24被证明具有抑制黑素瘤增生和促进终末分化的能力.IL-24基因作为目前被发现的唯一的既抑制肿瘤细胞生长、转移和血管形成,并诱导肿瘤细胞凋亡,又刺激表达次级细胞因子免疫调理而日益受到关注.正常表达的IL-24通过配体-受体介导的JAK/STAT通路在免疫应答的调控中起着重要作用.过表达IL-24通过内部的(线粒体介导或内质网应激)和外部的(死亡受体介导)通路诱导肿瘤细胞的凋亡,并有抑制肿瘤细胞侵袭转移和抗血管发生的作用.
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白细胞介素24及其抗肿瘤作用
白细胞介素24(IL-24)又称黑素瘤分化相关基因7(melanoma differentiation associated gene-7,MDA-7)主要表达于脾、胸腺、外周血白细胞、单核细胞等免疫组织和分化的黑素细胞,其他组织细胞可被诱导表达.IL-24受体有2种(IL-22R1/IL-20R2和IL-20R1/IL-20R2).IL-24可诱导人外周血单个核细胞产生高水平IL-6、TNF-α和IFN-γ,以及少量IL-1β、IL-12和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF).将携IL-24基因的腺病毒质粒(Ad-IL-24)转染细胞后能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,但对正常细胞无影响.IL-24的这些作用与其诱导凋亡相关因子(BAX/Bcl-2,BAK/Bcl-2)的比例变化、上调p38-MAPK及可被生长停滞和DNA损伤诱导的基因家族产物增加有关.提示IL-24有治疗肿瘤的临床价值,基于Ad-IL-24基因治疗的临床试验已经开始.现就IL-24及其抗肿瘤作用的现状和发展作一综述.
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白细胞介素24抗肿瘤治疗的研究进展
白细胞介素24(IL-24)是近年来发现的一种新的肿瘤细胞抑制因子,能抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管形成.在信号转导方面,IL-24介导STAT1和STAT3的激活.研究表明,IL-24基因既能抑制肿瘤生长,又能表达刺激免疫系统蛋白;IL-24与化疗、放疗等治疗方法联合应用能明显提高抗肿瘤效应.IL-24有望成为肿瘤临床治疗的有效手段之一.
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白介素-19、20和24与银屑病的关系
白介素-19、20和24是新近发现的3种细胞因子,生物功能尚不完全明了,结构上与白介素-10有很高的同源性.相应的受体和基因结构也明显关联,它们及其受体在结构上有同源性,功能上有联系,但义有各自的独特性.初步研究显示,它们主要分布在银屑病皮损的表皮,在银屑病炎症中发挥重要作用.
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腺病毒介导IL-24基因诱导皮肤鳞状细胞癌细胞COLO 16的凋亡
目的：探讨腺病毒介导IL-24基因表达载体（Ad-IL-24）对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞COLO 16的凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法将构建的Ad-IL-24腺病毒感染COLO 16细胞，qPCR法检测IL-24基因的表达，MTT法检测IL-24过表达对细胞生长的影响，流式细胞仪检测IL-24过表达对COLO 16细胞凋亡的影响，激光扫描共聚焦显微镜观察在IL-24过表达后COLO 16细胞凋亡的形态变化，Western印迹检测Bax，Bcl-2以及活化的caspase 3蛋白水平，qPCR法检测Bax、Bcl-2基因mRNA的表达，免疫荧光方法，检测IL-24过表达后Bax，Bcl-2的表达情况。结果 MTT结果显示，Ad-IL-24组的细胞从第4天开始出现明显抑制，第6天差异明显（P<0．05），并呈现时间依赖性，而Ad-GFP组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0．05）。流式细胞仪显示，Ad-IL-24组的COLO 16细胞凋亡率（13．10±0．92）％，显著高于对照组（3．69±0．36）％（P<0．05）和空载体组（3．39±1．06）％（P<0．05），后两组间比较，差异无统计学意义（P>0．05）。激光扫描共聚焦显微镜显示，Ad-IL-24组细胞加速凋亡。免疫荧光、Western印迹法和QPCR法结果显示，IL-24过表达后Bax在细胞中的表达明显升高，而Bcl-2在细胞中的表达却明显下降。Western印迹法和qPCR法显示，Ad-IL-24组的Bax、Bcl-2的蛋白及mRNA水平分别与对照组和空载组比较，出现了明显的上升和下降，在蛋白水平上产生与抗cleaved caspase 3抗体结合的特异性条带。结论 Ad-IL-24可诱导鳞癌细胞COLO 16细胞凋亡，其机制可能与上调Bax基因、下调Bcl-2基因表达，并活化caspase 3有关。
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腺病毒介导的IL-24基因抑制人脑胶质瘤细胞增殖的机制研究
目的:探讨IL-24抑制人脑胶质瘤细胞增殖的可能机制.方法:用腺病毒介导的IL-24(Ad.IL-24)及腺病毒空载体感染人脑胶质瘤细胞U251,通过荧光显微镜观察腺病毒的感染效率,RT-PCR法检测IL-24的转录水平;用MTT法、流式细胞仪检测IL-24对U251细胞增殖的影响;用蛋白质印迹方法检测神经生长因子(NGF)、酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase A, TrkA)的表达水平,并分析其相关性.结果:Ad.IL-24及腺病毒空载体转染U251后,RT-PCR结果显示Ad.IL-24组出现高表达电泳条带,而腺病毒空载体组则未出现电泳条带;MTT结果显示Ad.IL-24明显抑制了U251细胞的增殖,且流式细胞仪细胞周期检测发现Ad.IL-24处理组较对照组G2/M期明显延长,蛋白质印迹结果显示过表达IL-24的U251细胞中NGF及TrkA表达降低.结论:IL-24可能通过减少细胞中TrkA和NGF的表达来抑制肿瘤细胞的增殖.
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人白细胞介素24重组蛋白对胃癌抗肿瘤机制的实验研究
目的 纯化人白细胞介素24(IL24)的原核重组表达质粒pET-21a(+)-IL-24在大肠杆菌BL(DE3)中的表达产物rhlL-24,并初步探讨其对胃癌细胞株SGC-7901抗肿瘤的可能机制.方法 采用RT-PCR法和Western blot法检测rhIL-24对胃癌细胞株SGC-790l中促凋亡因子bax表达的影响,鸡胚绒毛尿囊膜技术观察其对血管形成的影响.结果 rhIL-24处理组胃癌细胞中促凋亡因子bax表达增高,rhIL-24处理组二、三级血管数目明显减少,三级血管的数目与生理盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 初步表明rhIL-24能上调促凋亡因子bax表达,从而抑制血管生成,发挥对胃癌的抗肿瘤作用.
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重组人白细胞介素24蛋白的纯化及其对胃癌细胞凋亡的影响
目的纯化人白细胞介素24的原核重组表达质粒pET-21a(+)-IL-24在大肠杆菌BL(DE3)中的表达产物rhIL-24,并观察重组表达蛋白rhIL-24在体外对胃癌细胞株SGC-7901凋亡的影响.方法 IPTG诱导原核表达载体pET-21a(+)-IL-24在大肠杆菌中表达rhIL-24,经纯化、复性后作用于人胃癌细胞株SGC-7901.MTT法检测rhIL-24对细胞生长的影响,流式细胞仪检测凋亡峰,荧光染色观察细胞凋亡形态.结果 rhIL-24对体外培养的胃癌细胞SGC-7901有明显的生长抑制作用,且呈时间、剂量依赖性.rhIL-24蛋白30μg/ml作用于SGC-7901细胞24h后,流式细胞仪检测结果显示有明显的凋亡峰出现,荧光染色后显示染色质固缩,细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染.结论本实验成功纯化IL-24原核表达产物rhIL-24,对体外培养的胃癌细胞株SGC-7901有明显的生长抑制、诱导凋亡作用.
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人重组白细胞介素24和表没食子儿茶素没食子酸酯对肿瘤血管生成的影响
目的 观察人重组白细胞介素24(rhIL-24)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对组织新生血管和肿瘤组织血管生成的影响并作比较.方法 在鸡胚模型上比较观察rhIL-24、EGCG对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响,在人肺腺癌裸鼠移植瘤模型上比较观察两者对肿瘤组织生长、组织中CD34和NF-κB(p50)的表达影响.结果 rhIL-24、EGCG均可抑制CAM上Ⅱ、Ⅲ级血管的生成.rhIL-24组瘤体组织中NF-κB(p50)的表达与PBS组比较有显著性差异,而EGCG组则不明显;rhIL-24组和EGCG组瘤体组织中CD34标记的微血管密度,与PBS组比较均有显著性差异.结论 rhIL-24、EGCG都有抑制CAM血管生成和肿瘤组织血管生成的作用,对肿瘤组织中NF-κB表达可能存在不同影响,推测两者或许存在不同的抗肿瘤血管生成机制.
关键词： 白细胞介素24 表没食子儿茶素没食子酸酯 肺癌 血管生成 -
SA/hIL24双功能融合蛋白的制备及其生物学活性的鉴定
目的:制备链亲和素标记的人白细胞介素24融合蛋白(SA/hIL24),并鉴定其生物学活性.方法:通过RT-RCR扩增hIL-24基因序列,构建pET24a-SA-hIL24和pET21a-hIL24-SA重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达,对表达的融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析和凝胶过滤层析纯化、透析复性.MTT法检测融合蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用,流式细胞仪分析融合蛋白对已生物素化的小鼠膀胱癌MB49细胞的锚定修饰效率.结果:成功构建两种融合蛋白的重组表达质粒,在大肠杆菌中实现高效表达,表达量分别占菌体总蛋白的20％和35％,二次纯化后SA/hIL24融合蛋白纯度可达95％以上.SA/hIL24融合蛋白可高效结合至已生物素化的MB49肿瘤细胞表面(表面锚定修饰率大于90％),hIL24-SA融合蛋白可以剂量依赖的方式抑制Hela细胞的生长,而SA-hIL24融合蛋白对Hela细胞没有明显的抑制生长作用.结论:SA/hIL24融合蛋白的制备为hIL-24表面锚定修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供了基础.
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人白细胞介素24研究进展
人类黑色素瘤分化相关基因7/白介素24(MDA-7/IL-24)是近年发现的具有细胞因子特性的抗肿瘤基因,能够通过膜受体或非受体介导的凋亡途径对多种肿瘤细胞产生杀伤作用,对正常细胞没有影响.此外,IL-24还具有抑制肿瘤新生血管形成、增强放疗敏感性和免疫调节等作用,与其他方法联合应用能明显提高抗肿瘤效应,其腺病毒制剂INGN241已经进入Ⅱ期临床试验并已显示出良好的治疗效果.IL-24有望成为将来肿瘤治疗的新武器.
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N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究
目的 构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性.方法 借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的 蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGase F分析IL-24糖基化形式和程度.MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性.结果 成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1.约70%的IL-24发生了N-糖基化.重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响.N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24.结论 毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的 蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础.
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肝癌高发家族中的非肝癌成员血清IL-24水平观察
目的 观察肝癌高发家族中的非肝癌成员血清白细胞介素24(IL-24)表达变化,并探讨其临床意义.方法 133例肝癌高发家族中的非肝癌成员为观察组,133例无癌家族成员为对照组,抽取空腹静脉血5 mL,ELISA法检测两组血清IL-24.结果 观察组、对照组血清IL-24水平分别为304.8751(203.9089,456.2414)、378.3327(268.7921,633.0068)ng/L二者比较,P<0.05.观察组中,不同民族、HBsAg表达情况间血清IL-24水平比较差异具有统计学意义(Z=-2.048,-2.519;P均<0.05).肝癌高发家族未患肝癌成员中一级亲属、二级亲属、三级亲属血清IL-24水平分别为252.0965(161.3105,450.2621)、320.6206(251.4095,548.9994)、309.2690(240.8756,463.8382)ng/L,一级亲属与二级亲属、三级亲属相比血清IL-24水平有显著性差异(P均<0.05).肝癌高发家族中患有2～3例肝癌的家族与患有4例及以上肝癌的家族成员血清IL-24水平分别为404.4768(184.2202,605.1554)、277.1630(206.1688,338.0225)ng/L,二者比较,P<0.05.民族、HBsAg感染、先证者、亲属级别与高发家族成员血清IL-24水平有关(P均<0.05).结论 与无癌家族成员比较,肝癌高发家族中非肝癌成员血清IL-24水平降低.IL-24可能在肝癌的发生、发展中起重要作用.
