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鼠双微体2与核糖体蛋白L23在胃癌组织中的表达及临床意义
目的:研究胃癌中鼠双微体2(murine double mimute 2,MDM2)与核糖体蛋白L23(ribosomal protein L23,RPL23)的表达及其临床相关性,初步探讨他们在胃癌发生发展中的生物学意义.方法:采用免疫组织化学染色方法检测90例胃癌组织和30例胃癌旁正常组织中MDM2和RPL23蛋白的表达;统计学分析他们表达的相关性及其与临床病理因素、患者生存时间的联系.结果:胃癌组织中MDM2表达阳性率与癌旁对照组比较显著性增高(62.2％ vs 40.0％,P＜0.05),而RPL23蛋白表达显著性降低(30.0％vs 63.3％,P＜0.05).MDM2和RPL23在胃癌中的表达呈负相关(r=-0.23,P=0.029).多因素分析显示MDM2高表达和RPL23低表达、淋巴结转移、肿瘤入侵深度、肿瘤的大小对胃癌患者生存预后的影响有统计学意义.结论:MDM2、RPL23的表达与胃癌的发生发展具有一定的相关性,针对两者的信号通路或许可作为胃癌预后的标志和新型治疗靶标.
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Numb、MDM2和p53在胰腺癌中表达的相关性及临床病理学意义
目的 探讨胰腺导管腺癌(PDAC)中Numb、MDM2和p53表达相关性及临床病理学意义.方法 应用免疫组化法检测65例配对的PDAC及癌旁组织石蜡标本中Numb、MDM2和p53蛋白表达情况,观察三者表达相关性及与患者临床病理学参数的关系;再以Western blot法检测16对配对新鲜PDAC组织及癌旁组织中三者的表达水平.通过免疫荧光法、Western blot法和实时定量(qRT)-PCR法检测Numb在不同分化的胰腺癌细胞株Capan-2、PANC-1及AsPC-1中的表达.分别采用配对t检验、x2检验、Kaplan-Meier、Cox回归分析等统计学方法分析实验结果.结果 免疫组化检测结果显示,Numb在PDAC及配对癌旁组织中表达差异无统计学意义(t=1.746,P=0.086);MDM2和p53在PDAC中表达高于癌旁组织(t=3.294,P=0.002;t=3.152,P=0.002);Numb表达与肿瘤大小(x2=5.206,P=0.023)、分化程度(x2=7.802,P=0.005)及UICC分期(x2=4.770,P=0.029)呈负相关;MDM2和p53表达分别与胰腺癌T及UICC分期呈正相关(x2=5.182,P=0.023;x2=6.448,P=0.011).相关性分析结果显示,Numb与MDM2呈负相关(r=-0.283,P=0.023),但他们与p53表达无明显相关性(P＞0.05).单因素和多因素分析结果显示,Numb是影响胰腺癌患者预后的一个保护因素(x2=5.408,P=0.020),并且Numb阳性和MDM2阴性表达的胰腺癌患者预后更好(x2=5.868,P=0.015).Western blot检测结果显示,Numb在8例高分化PDAC中蛋白表达高于配对的癌旁组织(t=1.092,P=0.020),而MDM2和p53在16例PDAC中呈明显高表达(t=3.263,P=0.005;t=3.607,P=0.003).免疫荧光、Western blot和qRT-PCR检测结果显示,随着胰腺癌细胞分化程度增高,Numb荧光强度、蛋白和mRNA表达水平逐渐增强.结论 Numb在胰腺癌发生发展中主要充当一个抑癌基因的角色,Numb、MDM2和p53可能共同参与胰腺癌的发生进展.
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Mdm2转录产物对p53调节作用的研究进展
在肿瘤生物学中,p53是重要的蛋白质之一,这种蛋白又称“基因守护者”,作为一种细胞内应激反应的基础,在抑制肿瘤中有重要的作用.鼠双微体2(Mdm2)是一种肿瘤蛋白,有抑制p53肿瘤抑制因子介导的转录激活的作用,而且在肿瘤细胞中高表达.除全长Mdm2(mdm2-fl)高表达外,Mdm2其他转录产物,如Mdm2-a、Mdm2-b、Mdm2-c,在肿瘤细胞中也存在高表达.肿瘤的发生及发展与Mdm2和p53之间相互作用有关,在Mdm2与p53研究成为热点的同时,Mdm2其他转录产物对p53影响也是至关重要.
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MDM2、MDMX以及p53在肿瘤中的研究进展
肿瘤抑制基因p53在抑制肿瘤生成中起重要作用.作为p53的主要负性调节因子,鼠双微体(MDM)2能够泛素化降解p53蛋白并降低其活性,而p53则与MDM2的P2启动子序列结合,抑制其转录活性,降低其表达,两者相互作用形成负反馈环.MDMX,又称MDM4,其能够抑制p53的转录激活,调节MDM2的E3连接酶活性,且MDM2与MDMX均具有p53非依赖性致瘤作用.因此探究p53-MDM2、MDMX的相互作用及具体的作用机制可为肿瘤治疗提供新的方向.
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RPL23、MDM2表达与胃癌术后辅助化疗疗效及毒副反应的相关性研究
目的 研究胃癌组织中核糖体蛋白L23(RPL23)、鼠双微体2(MDM2)蛋白表达与术后辅助化疗效果及毒副反应之间的关系,对胃癌化疗获益人群进行探索性分析.方法 回顾性收集胃癌根治术并行术后辅助化疗患者34例,免疫组化检测胃癌组织中RPL23、MDM2表达,统计学分析其与3年无病生存期(DFS)及化疗毒副反应之间的关系.结果 34例患者中,RPL23、MDM2阳性表达率分别为23.5％、58.8％.RPL23 (x2=9.946,P=0.002)、MDM2(x2=12.560,P＜0.001)是影响患者3年DFS获益的重要因素,RPL23阳性患者中位DFS为17.4个月,明显低于阴性患者(26.7个月)(x2=10.90,P=0.001);MDM2阳性患者DFS为28.2个月,明显高于阴性表达患者(18.4个月)(x2=20.42,P＜0.001).血液毒副反应方面,RPL23阳性患者的发生率为50.0％,明显高于阴性表达患者(11.5％) (P=0.037);MDM2阳性表达患者为5.0％,低于阴性表达患者(42.9％)(P=0.012);RPL23、MDM2表达与患者胃肠毒性反应发生率之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RPL23、MDM2在胃癌组织中表达有可能作为患者术后辅助化疗效果及血液毒副反应的预测指标.
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鼠双微体基因2与p53在子宫颈癌发生中的作用
鼠双微体2(murine double minute 2,mdm2)基因是从一个含有鼠双微体(marine double minut,DM)自发转化的BALB/3T3DM细胞中克隆出来的高度扩增的基因.高表达时呈现癌基因功能.子宫颈鳞状上皮由CIN转变为癌有许多因素参与,其中mdm2和p53在宫颈感染人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)情况下相互作用,可促进宫颈上皮的恶性转变,是导致子宫颈癌的发生的因素之一,本文对其进行综述.
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ERG和鼠双微体2蛋白在前列腺癌组织中的表达及意义
目的 检测ERG蛋白和鼠双微体(MDM2)蛋白在前列腺癌组织中的表达情况,并探讨其相关性.方法 收集经病理学确诊为前列腺癌标本48例,良性前列腺增生10例,采用免疫组织化学二步法或SP法检测组织标本的ERG蛋白和MDM2蛋白的表达情况,采用 χ2检验及Spearman等级相关分析ERG和MDM2表达与前列腺癌分级的关系.结果 前列腺癌组织中ERG和MDM2蛋白阳性表达率分别为33.3%和47.9%,在良性前列腺增生组未见表达,差异有统计学意义(P<0.05).ERG和MDM2蛋白表达与前列腺癌Gleason评分分级不相关(P>0.05);但ERG与MDM2蛋白在前列腺癌组织中的表达呈正相关(r=0.831,P=0.001).结论 ERG和MDM2蛋白在前列腺癌组织中的高表达,与前列腺癌的发生、发展密切相关.前列腺癌中ERG蛋白表达与MDM2蛋白的异常表达密切相关说明这两个蛋白可能存在协同作用.
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人体鼠双微体2C端结构域ZF&RING重组蛋白的表达、纯化及单体结构研究
目的:通过在大肠杆菌SUMO系统中对鼠双微体2(MDM2)C端结构域ZF&RING (aa.300-491)进行构建并进行表达,酶切和纯化,从而得到MDM2蛋白C端结构域的单体结构,为其后续的晶体研究及MDM2非p53依赖途径的研究提供途径.方法:利用大肠杆菌SUMO表达系统对zf&ring基因进行重组构建.构建成功的表达载体经诱导表达优化后,通过Ni-NTA进行亲和层析纯化,并利用SDS-PAGE及Western blot鉴定分析.纯化后的融合蛋白经ULP1酶切得到目的蛋白ZT&RING,并通过HiTrap Q FF离子交换层析检验和去除杂质DNA.后通过分子筛检验其蛋白结构.结果:构建了SUMO-ZF&RING重组载体.重组载体在大肠杆菌高效可溶性表达,纯化并酶切后的目的蛋白ZF&RING以单体形式存在.结论:通过原核表达、纯化、酶切及层析发鉴定,成功获得高稳定、高纯度且为单体结构的MDM2 C端结构域ZF&RING蛋白,为后续关于MDM2,尤其是其非p53依赖途径的结构学和功能学提供了思路和途径.
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黄芩素对多西他赛体外抗前列腺癌活性的影响
目的 探讨黄芩素对多西他赛体外抗前列腺癌活性的影响和机制.方法 将人前列腺癌细胞系LNCaP按不同处理方式分为对照组(空质粒转染处理)、黄芩素组(单用10 mmol/L黄芩素处理)、多西他赛组(单用1 nmol/L多西他赛处理)、多西他赛+黄芩素组(用1 nmol/L多西他赛和10 mmol/L黄芩素处理)和多西他赛+黄芩素+鼠双微体2(MDM2)质粒组(用MDM2质粒转染后再用1 nmol/L多西他赛和10 mmol/L黄芩素处理).采用噻唑蓝(MTT)实验检测LNCaP细胞的活力,流式细胞术检测LNCaP细胞的凋亡情况,免疫印迹法检测LNCaP细胞中MDM2、蛋白53(p53)、佛波醇-12-肉豆酸酯-13-乙酰基诱导蛋白1(PMAIP1,又称Noxa)、受p53基因上调表达的凋亡调控基因(Puma)蛋白的表达水平以及细胞色素c的释放水平、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-9和Caspase-3的活化水平.结果 多西他赛+黄芩素组对LNCaP细胞活力的抑制率和LNCaP细胞凋亡率均明显高于多西他赛+黄芩素+MDM2质粒组、多西他赛组、黄芩素组和对照组(P<0.05).黄芩素组和多西他赛+黄芩素组LNCaP细胞MDM2 mRNA和MDM2蛋白水平均明显低于多西他赛+黄芩素+MDM2质粒组、多西他赛组和对照组(P<0.05).多西他赛+黄芩素组p53、Puma和Noxa蛋白的表达水平、细胞色素c释放水平及Caspase-9、Caspase-3活化水平均明显高于多西他赛+黄芩素+MDM2质粒组、多西他赛组、黄芩素组和对照组(P<0.05),而相对线粒体膜电位则明显低于其他各组(P<0.05).结论 黄芩素能通过MDM2/p53途径提高多西他赛的体外抗前列腺癌活性.
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鼠双微体2在卵巢浆液性和黏液性肿瘤中的表达及临床意义
目的 探讨原癌基因鼠双微体2(MDM2)在浆液性和黏液性卵巢上皮肿瘤(良性、交界性和恶性)中的表达特点及临床意义.方法 收集手术切除的原发性卵巢浆液性和黏液性肿瘤标本82例,其中良性囊腺瘤22例(浆液性12例,黏液性10例)、交界性囊腺瘤30例(浆液性22例,黏液性8例)、恶性囊腺癌30例(浆液性18例,黏液性12例).用免疫组织化学法检测标本中MDM2的水平,比较它们的表达强度.结果 MDM2在良性、交界性和恶性囊腺癌中的表达阳性率分别为0.0%、20.0%和66.7%,恶性囊腺癌组织中MDM2的表达高于交界性、良性囊腺瘤(P<0.05).恶性浆液性囊腺癌中MDM2的阳性率低于恶性黏液性囊腺癌(44.4%比83.3%,P<0.05).结论良性卵巢浆液性和黏液性囊腺瘤组织中MDM2未见表达,而恶性卵巢浆液性囊腺癌,尤其是恶性黏液性囊腺癌中MDM2表达的阳性率更高.
关键词： 鼠双微体2 原发性卵巢浆液性肿瘤 原发性卵巢黏液性肿瘤 -
Musashi-2和鼠双微体2在卵巢上皮肿瘤中的表达及临床意义
目的 探讨Musashi-2和鼠双微体2(MDM2)在卵巢上皮肿瘤中的表达及临床意义.方法 选择2014年1月至2016年6月在巴中市中心医院手术切除的原发性卵巢上皮肿瘤标本89例,其中良性囊腺瘤24例(浆液性11例、黏液性13例),恶性囊腺癌65例(浆液性30例、黏液性24例、其他组织学类型11例).采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中Musashi-2和MDM2的表达,观察卵巢恶性上皮肿瘤Musashi-2和MDM2阳性表达与病理学参数的关系.结果 恶性卵巢上皮肿瘤Musashi-2和MDM2的阳性表达率明显高于良性肿瘤(P<0.05);卵巢恶性上皮肿瘤直径≥2.5 cm和FIGO分期Ⅲ/Ⅳ期患者Musashi-2表达阳性率明显增高,黏液性癌和FIGO分期 Ⅲ/Ⅳ期患者MDM2的表达阳性率明显增高;Musashi-2阳性表达和MDM2阳性表达无关(r=-0.203,P=0.104).结论 Musashi-2和MDM2在卵巢恶性上皮肿瘤中阳性表达率高,这2种蛋白的阳性表达可能提示肿瘤分期晚,预后不良.
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脑胶质瘤组织中c-Myc、MDM2的表达及意义
目的 观察脑胶质瘤组织中原癌基因c-Myc、鼠双微体2(MDM2)表达,并探讨其意义.方法 收集89例份脑胶质瘤组织和35例份正常脑组织的石蜡标本,采用免疫组化法检测脑组织样本中c-Myc、MDM2蛋白表达,分析c-Myc、MDM2表达与脑胶质瘤组织学病理分级的关系,Spearman等级相关分析法检验c-Myc、MDM2蛋白表达间的关系.结果 脑胶质瘤、正常脑组织中c-Myc蛋白阳性表达率分别为55.06％ (49/89) 、8.57％ (3/35),二者比较差异有统计学意义(P=0.000);脑胶质瘤、正常脑组织中MDM2蛋白阳性表达率分别为48.31％ (43/89)、2.86％ (1/35),二者比较差异有统计学意义(P =0.000).c-Myc蛋白在低病理分级(Ⅰ～Ⅱ级)、高病理分级(Ⅲ～Ⅳ级)脑胶质瘤组织中的阳性表达率分别为43.75％ (21/48)、68.29％ (28/41),二者比较,差异有统计学意义(P =0.020);MDM2蛋白在低病理分级(Ⅰ～Ⅱ级)、高病理分级(Ⅲ～Ⅳ级)脑胶质瘤组织中的阳性表达率分别为29.17％(14/48)、70.73(29/41),二者比较差异有统计学意义(P=0.020).Spearman等级检验结果显示,脑胶质瘤组织中c-Myc、MDM2蛋白表达呈正相关(r=0.370,P ＜0.05).结论 脑胶质瘤组织中c-Myc、MDM2蛋白均呈高表达,且均与脑胶质瘤病理分级有关;联合检测c-Myc、MDM2有助于患者病情预测.
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骨肉瘤组织p53、鼠双微体2蛋白表达及意义
目的 观察骨肉瘤患者癌组织p53、鼠双微体2(MDM2)蛋白表达变化,并探讨其与化疗疗效、预后的关系.方法 选择新辅助化疗前的骨肉瘤患者39例,取其活检获得的骨肉瘤组织及肿瘤周围正常骨组织,采用免疫组化法检测p53、MDM2蛋白表达.患者经新辅助化疗及手术后取其肿瘤组织,HE染色后以肿瘤坏死率评价化疗敏感性.分析骨肉瘤组织p53、MDM2蛋白表达与患者临床病理参数(性别、年龄、组织学类型、化疗敏感性)及无病生存时间(DFS)的关系.结果 39例患者术前活检肿瘤组织中p53蛋白阳性表达率为23.1％ (9/39),MDM2蛋白阳性表达率为76.9％(30/39),肿瘤周围正常骨组织中均未见p53、MDM2蛋白阳性表达;两者比较P均＜0.05.39例患者中,肿瘤坏死率＜90％者27例,对化疗敏感性低;≥90％者12例,对化疗敏感性高.化疗敏感性低者肿瘤组织p53、MDM2蛋白阳性表达率明显高于化疗敏感性高者(P均＜0.05);肿瘤组织p53、MDM2蛋白阳性表达率与患者性别、年龄、组织学类型均无关(P均＞0.05).肿瘤组织p53蛋白阴性与阳性表达者DFS分别为34.0(18.8,42.0)、12.0(9.0,17.0)个月,两者比较P＜0.05;MDM2蛋白阴性与阳性表达者DFS分别为53.0(42.0,63.5)、18.5(12.0,34.0)个月,两者比较P＜0.05.结论 骨肉瘤组织p53、MDM2蛋白阳性表达率升高,可导致患者化疗敏感性降低及预后不良.
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烟尘慢性染毒致肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化离体实验研究
目的 建立模仿肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)暴露于云锡炼厂烟尘环境的离体研究模型.方法 以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高、低剂量染毒组和空白对照组.前2组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养.从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性.采用透视电镜观察细胞超微结构,流式细胞术观察细胞周期,免疫印迹法及免疫组织化学观察各组细胞肺表面活性蛋白(SP)-B、SP-C、鼠双微体2(MDM2)蛋白、脆性组氨酸三联体(FHIT)蛋白的改变.结果 染毒24 h后即可观察到烟尘对RLE-6TN细胞超微结构造成损伤,主要表现为板层小体变性且数量减少,以及细胞凋亡和坏死;转化后的细胞由圆形或类圆形铺路石样生长变为长梭形.高、低剂量染毒组细胞培养至25代时软琼脂克隆形成检测实验均呈阳性,克隆形成率分别为3.33‰和1.67‰;继续培养至35代观察高、低剂量染毒组克隆形成率分别为12.50‰和10.00‰,空白对照组始终没有克隆形成.高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P＜0.01),但与烟尘染毒剂量相关性无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪检测示高、低剂量染毒组G2/M期+S期的比例较空白对照组增高.高、低剂量染毒组第25、30代细胞MDM2蛋白阳性、SP-B及FHIT蛋白阴性,而空白对照组同代细胞MDM2蛋白阴性、SP-B及FHIT蛋白阳性.高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞示SP-C失表达,空白对照组SP-C有表达.结论 ATⅡ长期暴露于云锡炼厂烟尘中可导致其恶性转化.ATⅡ特异性蛋白SP-B、SP-C、FHIT失表达,MDM2阳性表达可作为RLE-6TN细胞转化的参考指标.
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鼠双微体2蛋白参与醛固酮诱导的系膜细胞增殖
目的 探讨鼠双微体2(MDM2)蛋白是否参与醛固酮(ALD)诱导的系膜细胞生长及其可能的机制.方法 用RT-PCR方法检测人系膜细胞株(HMCL)盐皮质激素受体(MR)、11β-羟类固醇脱氧酶(11β-HSD2)、MDM2 mRNA的表达,以明确HMCL是否具备对ALD刺激产生反应的基本条件.以不同浓度ALD刺激HMCL并以螺内酯(MR拮抗剂)抑制试验以及放线菌酮(CHX,一种蛋白质合成抑制剂)抑制试验,分别观察MR是否参与了ALD诱导的MDM2表达增加并了解ALD诱导MDM2表达是否为非基因组机制.使用小干扰RNA技术(siMDM2)了解ALD对HMCL MDM2表达及细胞生长的影响,以明确MDM2在ALD诱导系膜细胞增殖中的作用.结果 HMCL有MR、11β-HSD2、MDM2的表达.ALD刺激可使HMCL的MDM2表达增加,螺内酯和放线菌酮可抑制其增加.提示MDM2是一种盐皮质激素敏感的蛋白,MR介导了ALD诱导的MDM2表达增加.该作用方式不属于ALD的非基因组作用方式.ALD可使HMCL的DNA增殖期细胞百分比(S期细胞比例)与MDM2表达同步增加.siMDM2可抑制ALD诱导的MDM2蛋白表达的增加,相应S期细胞比例亦不升高,说明MDM2参与了ALD诱导的系膜细胞增殖.结论 MDM2是一种盐皮质激素敏感的蛋白,它参与了ALD诱导的系膜细胞增殖,这种作用需经过MR介导.ALD对MDM2的作用方式不属于ALD的非基因组作用方式.
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核糖体蛋白-鼠双微体2-p53信号通路的研究进展
p53基因是细胞生长周期中的负调节因子,与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化和细胞凋亡等重要的生物学功能有关.p53基因受多种信号因子的调控,其中较为重要的负反馈调控因子是鼠双微体(murine double mimute,MDM)2.在正常细胞增殖和分化过程中,MDM2-p53反馈回路对控制p53蛋白水平及其活化至关重要;并且经过该反馈回路的调节,实现在细胞受到各种打击后对p53的动态调节.笔者就RPs-MDM2-p53信号调控通路的研究进展进行综述.
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鼠双微体2在乳腺癌中的表达及其临床意义
目的：通过检测鼠双微体2（ murine double minute 2，MDM2）在人乳腺癌中的表达，探讨其在乳腺癌发生发展中的作用。方法选取拟手术切除的70例乳腺癌患者，自乳腺癌癌灶中心非坏死部位及距肿瘤切缘5 cm以外的配对正常乳腺组织分别收集标本。采用实时荧光定量RT-PCR和免疫组化法检测乳腺癌组织中MDM2 mRNA 及其蛋白的表达水平，定量分析其表达与临床病理特征的关系。结果 MDM2在乳腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常乳腺组织，差异有统计学意义（ P ＝0.001）。 MDM2 mRNA水平与肿瘤大小、分期、组织学类型、淋巴结转移和HER-2阳性表达有关（ P＜0.05），与雌、孕激素受体无关（ P＞0.05）；MDM2蛋白表达与肿瘤组织学类型、淋巴结转移和HER-2阳性表达有关（ P＜0.05），与肿瘤大小、分期、和雌、孕激素受体无关（ P＞0.05）。结论乳腺癌组织中MDM2表达明显升高，在乳腺癌的浸润与转移中具有重要作用。
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MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白原核表达载体的构建与蛋白制备
目的:采用分子克隆技术和大肠杆菌原核表达系统制备具备生物学活性MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白.方法:首先应用PCR合成大肠杆菌硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)A的cDNA序列,将其插入到大肠杆菌原核表达载体pET40b中,将人工合成的人免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus,HIV-1)反式激活蛋白(transactivator,TAT)的蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)和MDM2/4双抑制肽pDI(peptide double inhibition)的cDNA序列分别插入到Trx序列的C端和核心位点,从而构建出可表达MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的原核表达载体pET-TAT-TrxA-pDI.然后将pET-TAT-TrxA-pDI原核表达载体转化大肠杆菌表达菌种BL21感受态细胞,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导蛋白表达,筛选优表达的单克隆菌种,分析重组蛋白的表达部位,并了解不同IPTG浓度(0.1 mmol/L、0.4mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L)、温度(16℃、25℃、37℃)、表达诱导时间(1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h)对MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白表达的影响,以获得优的蛋白表达条件.终利用MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白携带的His标签,采用能够特异性结合His标签的蛋白纯化柱进行蛋白纯化,并应用梯度透析法和氧化还原法进行MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的体外折叠.结果:成功构建可以表达MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的原核表达载体pET-TAT-TrxA-pDI,并实现MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白在大肠杆菌表达菌种BL21(DE3)中的高效表达,表达量占总蛋白表达量的60％以上,并且主要存在于包涵体中.蛋白表达条件优化结果发现,温度对重组蛋白表达无明显影响,而应用0.4mmol/L的IPTG浓度和3h的诱导时间即可获得重组蛋白的高效表达.经过蛋白纯化后获得纯度99.99％的重组蛋白,将纯化的MDM2/MDM4双靶点抑制蛋白溶液用梯度透析复性和氧化还原复性法终成功获得包涵体蛋白的体外正确折叠,复性效率约为80％.结论:成功实现MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白在大肠杆菌原核表达系统中的高效表达、纯化以及体外的正确折叠,终获得高纯度并具有生物学活性的MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白,从而为进一步MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白抗肿瘤活性与机制的研究奠定了基础.
