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细胞外基质的构成
0 引言细胞外 (xtracellularmatrix,ECM)是组成间质和上皮-血管中基质的不溶性结构成分,他不仅仅是细胞机械支持组织,而且是供给营养和免疫应答的场所,参与调节胚胎发育进程,决定细胞的粘附与迁移,在创伤修复和纤维化、细胞的生长、分化、代谢和肿瘤发生及转移中起重要作用并作为组织替代材料用于临床研究其主要成分包括胶原、非胶原糖蛋白、弹力纤维、糖胺多糖、蛋白聚糖、与基质代谢相关的酶及细胞因子[1]
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成纤维细胞生长因子2在椎间盘中表达与作用的研究进展
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)目前发现总共有22种,但在椎间盘领域主要涉及的是成纤维细胞生长因子2 (fibroblast growth factor 2,FGF2)[1].因为FGF2呈碱性,故亦称为碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF).FGF2是一种具有促有丝分裂作用的活性多肽分子,在体内具有广泛的作用.在椎间盘中基本的病理变化是椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD),其本质就是一种基质代谢的失稳态[2].
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麝香通心滴丸对稳定动脉粥样硬化斑块的机制研究
目的 观察麝香通心滴丸稳定动脉粥样硬化(AS)斑块的作用机制.方法 采用高脂饮食伴主动脉内膜球囊损伤复制家兔动脉粥样硬化斑块模型,药物(斑点蝰蛇毒、组胺)触发斑块破裂,观察麝香通心滴丸稳定易损斑块的作用机制.生化方法检测AS家兔的血脂及氧化应激水平；ELISA及实时荧光定量PCR( Real - Time RT - PCR)法检测麝香通心滴丸对AS家兔基质金属蛋白酶-2(MMP -2)、TIMP2以及相关炎症介质的蛋白含量和mRNA表达水平的影响；应用TUNEL法检测麝香通心滴丸对AS家兔斑块内细胞凋亡水平的影响.结论 麝香通心滴丸稳定易损斑块作用的机制有,减轻AS氧化应激损伤,降低脂质过氧化；降低MMP2含量,升高TIMP2含量,减少AS斑块内的基质降解,调节基质代谢；减少斑块内巨噬细胞的数量,降低炎性因子的表达,减轻斑块内的炎症反应；减少斑块内细胞凋亡增加斑块稳定性.
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周期性牵张椎间盘纤维环细胞肌动蛋白骨架的重排
背景：当椎间盘承受应力时，髓核内部产生的液压使纤维环向外扩张、膨胀，纤维环胶原纤维被拉伸，使纤维环细胞外基质也受到压力的作用。蛋白聚糖是椎间盘中主要的蛋白多糖成分，基质金属蛋白酶2是椎间盘降解细胞外基质的主要酶，金属蛋白酶组织抑制剂是特异性抑制基质金属蛋白酶活性的多功能因子，与基质金属蛋白酶相互调节，保持平衡。
目的：探讨周期性牵张在椎间盘纤维环基质代谢中的作用机制。
方法：采用Flexcell4000牵张系统对体外培养的大鼠椎间盘纤维环细胞施加牵张应变为2%和10%、频率为1.0 Hz，时间为2 h和12 h的周期性牵张，分别于2 h和12 h卸载并收集细胞和条件培养基分别进行基因和蛋白检测。采用荧光定量PCR检测aggrecan、基质金属蛋白酶2以及组织基质金属蛋白酶抑制剂2 mRNA的表达；采用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶2蛋白活性。
结果与结论：①2%牵拉对肌动蛋白骨架形成的应力纤维影响不大，10%牵拉则使肌动蛋白骨架发生明显解聚。②2%牵拉12 h Aggrecan上调，牵拉2 h基质金属蛋白酶2、组织基质金属蛋白酶抑制剂2上调，二者保持动态平衡，基质金属蛋白酶2活性无显著变化。③10%牵拉对Aggrecan无影响。无论牵拉2 h或12 h，均使基质金属蛋白酶2上调，组织基质金属蛋白酶抑制剂2下调，二者失衡，基质金属蛋白酶2活性无显著变化。④结果提示周期性牵张可以在基因水平上对纤维环细胞Aggrecan、基质金属蛋白酶2和组织基质金属蛋白酶抑制剂2基因进行调节，通过调节肌动蛋白骨架从而对力学刺激产生响应。 -
ASIC1 a对大鼠关节软骨细胞基质代谢及MAPK信号通路表达的影响
目的：研究ASIC1a(acid-sensing ion channel 1a)对大鼠关节软骨细胞基质代谢及MAPK信号通路表达的影响。方法 SD大鼠关节软骨细胞分离、培养与鉴定,建立软骨细胞ASIC1a 表达沉默模型。将软骨细胞分为正常组( pH 7.4)、pH 6.0酸化组、以及ASIC1a特异性阻滞剂PcTx-1、表达沉默组和非特异性阻滞剂Amiloride处理的酸化组,对二甲基亚甲蓝分光法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中GAG的含量,氯胺T法检测 Hyp的含量, ELISA法检测 MMP-2、TIMP-2的含量,Western blot 法检测酸化及阻断 ASIC1a 后ERK1/2、p38 MAPK 磷酸化蛋白的表达。结果激活ASIC1a明显抑制大鼠关节软骨细胞GAG、Hyp和TIMP-2代谢水平( P<0.01),对MMP-2的代谢水平降低抑制作用较弱(P<0.01),且ASIC1a能引起ERK1/2、p38 MAPK磷酸化水平升高,阻断 ASIC1a后,磷酸化水平升高受到明显抑制(P<0.01)。结论 ASIC1a参与了酸诱导的大鼠关节软骨细胞基质代谢的失衡,其机制可能与激活 ERK1/2和 p38 MAPK磷酸化有关。
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白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)与椎间盘基质代谢
临床上因椎间盘退变而引起腰腿痛患病率高达60%～80%,而由于腰椎间盘突出引起坐骨神经痛的患者占总人口数的5%[1～2].腰椎间盘突出症已成为临床常见病、多发病,给患者带来巨大的痛苦,同时也消耗了大量的医疗资源和费用.虽然目前对椎间盘退变的确切机理尚不清楚,但随着近年来对椎间盘的分子生物学、免疫学及生物力学等认识的进展,以及实验设备的改善和实验手段的改进,对椎间盘退变机理的研究正在不断深入,特别是对椎间盘基质的代谢及其调节的认识取得长足的进步.本文就椎间盘基质的组成及退变时成分的改变和IL-1Ra对退变椎间盘基质代谢的调节做相关总结.
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L-型钙通道在NFAT1调节兔膝骨关节炎软骨细胞基质代谢中的作用
[目的]探讨L-型电压依赖性钙通道在NFAT1调节软骨细胞基质代谢中的作用.[方法]Hulth法制作兔骨关节炎(KOA)模型.使用qRT-PCR法观察对照组和KOA组兔软骨细胞5种NFAT亚型的mRNA表达情况,然后使用L-型钙通道阻断剂硝苯地平,检测软骨细胞NFAT各亚型和基质代谢各标记物的改变,以及膜片钳技术观察KOA细胞膜电位的变化.[结果]与对照组相比,KOA组软骨细胞5种NFAT的mRNA表达变化并不一致.KOA组软骨细胞NFAT1明显升高,是对照组的2.42倍(P＜0.01),NFAT2显著降低,是对照组的0.34倍(P＜0.01),而NFAT3、NFAT4和NFAT5的mRNA表达没有改变.与单纯DMSO培养基对照组相比,10 μmol/L硝苯地平对KOA软骨细胞的活力没有影响,但完全阻断了KOA软骨细胞Car1的mRNA表达,增加了软骨细胞内基质成分Ⅱ型胶原(7.46倍,P＜0.01)、聚集蛋白聚糖(4.98倍,P＜0.05)和转化生长因子-p的mRNA表达(4.37倍,P＜0.01),降低了分解酶基质金属蛋白酶-1(0.17倍,P＜0.01),含血小板反应蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-4 (ADAMTS) (0.29倍,P＜0.01)和ADAMTS-5的表达(0.10倍,P＜0.01),与对照组的差异均具有统计学意义.同时,硝苯地平显著降低了NFAT1的表达,是对照组的0.20倍(P＜0.05),但对NFAT2的mRNA表达没有影响.此外,硝苯地平使KOA组细胞膜电位显著增加(P＜0.01).[结论]L-型钙通道通过上调NFAT1.的mRNA表达参与调控KOA软骨细胞基质代谢.
关键词： 膝骨关节炎 基质代谢 L-型钙通道 钙活化T细胞核因子(NFATs) 膜电位 -
高糖环境对大鼠髓核细胞基质代谢的影响
目的:探讨高糖环境对大鼠髓核细胞基质代谢的影响.方法:选取4～6周龄的SD大鼠30只,分离与培养髓核细胞.分别用5、15、25 mmol/L的葡萄糖干预髓核细胞,观察细胞生长情况,实时荧光定量PCR法检测细胞中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖mRNA的表达,Western blot法检测MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、P38及磷酸化P38蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养液中CTX-Ⅱ质量浓度,免疫细胞化学染色法检测Ⅱ型胶原蛋白的表达.结果:25 mmol/L组髓核细胞生长较5、15 mmol/L组减缓(P<0.001).与其他两组比较,25 mmol/L组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖mRNA表达水平降低,Ⅱ型胶原蛋白表达减少,CTX-Ⅱ含量增加,MMP-3及MMP-13表达升高,P38磷酸化水平增加(P均<0.05).结论:高浓度葡萄糖可抑制髓核细胞的生长,并通过诱导P38磷酸化,抑制基质合成,增加基质降解.
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身痛逐瘀汤方对椎间盘退变中PI3K/AKT通路影响的研究
目的:探明静水压下髓核细胞凋亡及基质代谢的相关分子生物学机制,揭示身痛逐瘀汤方对静水压下髓核细胞凋亡及基质代谢的调控机制及作用靶点.方法:将8只新西兰兔处死后无菌条件下取出髓核,分为8组,将8组髓核细胞分离培养、鉴定及传代后,加入身痛逐瘀汤方含药血清中,在体外静水压加栽系统中进行干预,在0.3 MPa,1 MPa及3 MPa压力下作用4h,24 h后,使用倒置相差显微镜观察髓核细胞加压前后的形态及生长状况;采用透射电镜观察各组髓核细胞超微结构的变化及差异;使用Cell Counting Kit-8法检测各组髓核细胞的增殖活性;使用Annexin V-FITC/Propidium Iodide双染法检验各组髓核细胞的凋亡状况;使用凝胶电泳迁移法(EMSA)检验各组髓核细胞中PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3-激酶)/(丝氨酸/苏氨酸激酶)的活跃情况;Western Blot法检验Sox9,CollagenⅡ,BAD,Caspase-9及GSK-3在髓核细胞中含量的变化.结果:在同一压力与作用时间下倒置相差显微镜及透射电镜示中药干预组较单纯压力组髓核细胞形态及超微结构保存更完整,生长状况更好;CCK-8法示中药干预组髓核细胞增殖活性更高;Annexin V-FIT检验结果示中药干预组髓核细胞凋亡百分比更低;凝胶电泳迁移法及Western Blot法示PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平明显升高.结论:身痛逐瘀汤能明显激活PI3K/AKT信号通路的表达,延缓椎间盘的退变.
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骨关节炎软骨细胞电压依赖性钙通道α1亚单位表达的改变
目的 观察兔膝骨关节炎(KOA)软骨细胞电压依赖性钙通道(Cav)α1亚单位的表达变化.方法 8只兔随机分为对照组和KOA组.膝关节软骨细胞原代培养,采用膜片钳技术,观察软骨细胞膜电位的变化;提取软骨细胞的mRNA,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法观察软骨细胞9种电压依赖性钙通道α1亚单位和软骨细胞基质代谢相关基因mRNA表达的变化.结果 两组软骨细胞膜电位分别为(-38.3 ±2.0)mV和(-27.4±2.1)mV.与对照组比较,KOA细胞呈去极化表现,膜电位值显著减少(P＜0.01).对照组软骨细胞仅有Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4、Cav2.1、Cav2.2和Cav2.3的mRNA表达,未见存在Cav1.1、Cav3.1和Cav3.3的mRNA表达.KOA时,软骨细胞Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4和Cav2.1的mRNA表达增高,分别是对照组的2.2、2.3、7.6(P＜0.01)和3.0倍(P＜0.05),Cav2.2和Cav2.3的mRNA表达无明显改变.KOA时,软骨细胞Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、转录因子性别决定区Y框蛋白(Sox)-9和转化生长因子-β的mRNA表达明显降低,分别是对照组的0.2、0.4、0.6和0.2倍(P＜0.01);基质金属蛋白酶(MMP-1)-1和MMP-13、含血小板反应蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)4和ADAMTS-5显著增多,分别是对照组的4.1、8.0(P＜0.01)、81.3和2.0倍(P＜0.05).结论 KOA时,软骨细胞膜电位去极化,使高电压激活型钙通道开放,而L型和P/Q型钙通道的mRNA表达增高,进一步增加钙的进入.通过钙通道增加的钙可能是软骨细胞合成代谢减少,分解代谢增加的原因之一.
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布洛芬对兔骨关节炎模型 Wnt/β－catenin 信号通路和软骨细胞基质代谢的影响
目的：探讨布洛芬对兔骨关节炎（osteoarthritis，OA）模型膝关节软骨细胞基质代谢及 Wnt ／β－catenin 信号通路的影响。方法采用改良伸直位固定法制作兔 OA 模型，分离提取兔 OA 模型膝关节软骨细胞进行培养。采用四唑盐比色法选择布洛芬和二甲基亚砜（DMSO）实验浓度。确定实验浓度后将软骨细胞分为 DMSO 组和布洛芬组，分别给予1％DMSO 和250μM 布洛芬干预48 h 后，采用 real－time PCR 法和 ELISA 方法检测软骨细胞 Wnt ／β－catenin 相关因子（β－catenin、MMP－13、ADAMTS－4、II 型胶原和蛋白聚糖）mRNA 及蛋白的水平。结果DMSO 对照组和布洛芬组β－catenin、MMP－13、ADAMTS－4、II型胶原和蛋白聚糖的 mRNA 及蛋白水平比较，差异均无统计学意义（P ＞0．05）。结论兔 OA 模型膝关节软骨细胞中，布洛芬对 Wnt ／β－catenin 信号通路和软骨细胞基质代谢无明显影响。
关键词： 骨关节炎 Wnt /β-catenin 信号通路 基质代谢 布洛芬 -
组织工程修复软骨基质蛋白聚糖代谢的初步探讨
目的 检测软骨修复组织中蛋白聚糖相关代谢指标,初步探讨在软骨修复过程中基质蛋白聚糖的代谢变化以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和蛋白聚糖酶(aggrcanases)的作用.方法 松质骨骨基质明胶(bone matrix gelatin, BMG)复合同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨,体内植入修复兔膝关节骨软骨缺损.术后6个月取材检测蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs裂解表位BC-4 以及aggrcanases裂解表位BC-13的表达情况.结果 在修复组织中,蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表达增加,MMPs及其裂解表位BC-4表达减低,而aggrcanases裂解表位BC-13表达阴性.结论 利用蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13的表达情况可以初步了解修复软骨组织中蛋白聚糖的代谢变化,修复软骨组织蛋白聚糖的合成大于分解,MMPs在兔关节修复软骨基质蛋白聚糖的基础代谢和重塑中具有重要作用.
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兔骨关节炎模型中Wnt/β-catenin信号通路研究
目的：探讨兔骨关节炎软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路的表达情况及其在骨关节炎中的作用。方法：采用改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型，分阶段酶消化法分离正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞。采用ELISA法检测正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞中β连环蛋白（β-catenin）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶-4（ADAMTS-4）、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、白细胞介素（IL）-1β、IL-18和IL-33的水平。结果：与正常对照组比较，骨关节炎组β-catenin、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4的蛋白水平均明显升高，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的蛋白水平均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。与正常对照组比较，骨关节炎组IL-1β、IL-18和IL-33蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论：兔骨关节炎中Wnt/β-catenin信号通路明显激活，介导软骨细胞外基质分解代谢、促进软骨破坏，而炎性因子IL-1β、IL-18和IL-33可能在此过程中并未起到关键作用。
