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Wnt-1基因对人表皮干细胞的分化与增殖的影响研究
目的 探讨Wnt-1基因对人表皮干细胞分化与增殖的影响.方法 将Wnt-1基因用重组腺病毒基因导入技术导入人表皮干细胞内,在证实Wnt-1基因在人表皮干细胞中导入成功后,检测人表皮干细胞的增殖能力、标记性分子、基质金属蛋白MMP-2、MMP-7浓度及细胞内Ca2+浓度等指标的变化.结果 分离获取的人表皮干细胞在接种后第3天进入快速生长期,第7天时到达平台期;Wnt-1基因导入人表皮干细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到了Wnt-1mRNA的存在,台盼兰excell系统检测发现人表皮干细胞直径无明显变化,而细胞增殖则明显加强;培养基中的MMP-2的浓度由感染前(-21.33±3.34)增加到感染后的(812.33±41.26)、MMP-7的浓度均值由感染前(17.33±2.31)增加到感染后的(1126.44±13.56),差异均有统计学意义(P<0.01);人表皮干细胞内Ca2+浓度明显升高,作为上皮终末分化标志的K10表达变为阳性;在汗腺分泌部表达的K18表达增强;作为干细胞和腺上皮细胞共同标记的K19的阳性明显减弱.结论 导入Wnt-1基因后,人表皮干细胞增殖能力明显增强,细胞直径则没有明显变化;人表皮干细胞培养基中NPVIP-2和MMP-7的浓度均显著增高;Wnt-1的导入能够诱使人表皮干细胞内Ca2+浓度升高;Wnt-1基因具有诱使人表皮干细胞向腺样上皮细胞分化的倾向.
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β1转化生长因子体外诱导人表皮干细胞分化为成纤维细胞的初步研究
目的 探讨β1转化生长因子(transforming growth factor β1,TGF-β1)诱导人表皮干细胞(human epidermal stem cells,hESCs)分化与瘢痕形成之间存在的关联.方法 将包皮环切术后的包皮用中性蛋白水解酶消化,采用改良的Ⅳ型胶原选择黏附法分离、培养,传代至第3代时经过hESCs表面标志物β1整合素和CK19检测,证实为hESCs后接种于24孔板,随机分为3组:3 d组、7 d组、空白对照组,前两组分别加入梯度浓度的TGF-β1(0.1、5.0、10.0 ng/ml)诱导,采用HE常规染色及Masson胶原特殊染色、免疫组织化学染色等手段检测量波形蛋白表达和羟脯氨酸试剂盒法测量各组上清液中胶原含量.结果 hESCs在TGF-β1诱导下,形态由圆形转变为梭形类成纤维细胞样,Masson胶原染色阳性,释放到细胞上清液中的胶原浓度,均显著高于对照组,抗-波形蛋白染色阳性率各组都至少在(95.00±1.20)%以上,大于对照组的(5.70±0.20)%(P<0.05).结论 结果表明,hESCs与病理性瘢痕发生关系极其密切,在TGF-β1体外诱导下向成纤维细胞分化,分泌胶原,提示在病理性瘢痕的发生中,hESCs可能是活化的成纤维细胞的另一个来源,hESCs可能参与瘢痕增生发生过程.
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人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮支架制备的人工皮肤
背景：多种原因会导致皮肤大面积缺损的出现，临床可采用组织工程人工皮肤进行移植修复，而构建组织人工皮肤需要种子细胞和支架材料。目的：观察人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮构建的组织工程人工皮肤的应用效果。方法：①取幼儿包皮分离培养人表皮干细胞，取裸鼠皮肤制备脱细胞真皮支架，将两者复合构建人工皮肤。②10只 SD 大鼠随机等分为组织工程皮肤组和脱细胞真皮支架组，均制备皮肤缺损模型，分别采用移植脱细胞真皮支架与人表皮干细胞复合物与单纯脱细胞真皮支架进行修复。结果和结论：①人工皮肤均呈乳白色，质地柔软且富有弹性，柔韧性好，不易断裂，并具有良好的随形性，可加工为不同的形状。②2组大鼠修复后创面均未出现明显渗出。造模后2周，组织工程皮肤组裸鼠移植皮肤均呈现出良好的生长状态，创面逐渐愈合。脱细胞真皮支架组出现瘢痕愈合，且2只动物移植失败。③结果表明，以人表皮干细胞为种子细胞，以裸鼠脱细胞真皮材料为支架，可复合获得组织工程皮肤，并对皮肤缺损动物具有良好的修复效果。
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猪脱细胞真皮与人表皮干细胞构建组织工程皮肤修复全层皮肤缺损
背景：目前已有应用蚕丝蛋白、结缔细胞、生物高分子材料、合成高分子材料、纳米材料、传感器制成的生物人造皮，以及非生物人造皮，应用于临床试验都取得了良好效果，但它们与真正皮肤相比还有很大差距。目的：观察表皮干细胞/猪脱细胞真皮组织工程皮肤修复大鼠全层皮肤缺损的效果。方法：取20只SD大鼠，建立背部皮肤缺损模型，随机分为2组，实验组于皮肤缺损处植入人表皮干细胞-猪脱细胞真皮组织工程皮肤，对照组植入猪脱细胞真皮。植入后4周，进行大体、组织学和免疫组织化学观察。结果与结论：①大体观察：实验组创面愈合良好，皮肤弹性佳；对照组移植区域呈现瘢痕愈合，触之质地偏硬；②组织学观察：两组在镜下均可见良好的表皮和真皮结构，表皮可明显区分为基底层、棘层和角化不全的角质层，与实验组相比，对照组可见较多纤维结缔组织；③免疫组织化学观察：实验组愈合创面抗人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原呈现阳性，对照组愈合创面抗人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原呈阴性；④结果表明：人表皮干细胞/猪脱细胞真皮组织工程皮肤修复动物全层皮肤缺损，可有效抑制瘢痕形成及挛缩。
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人表皮干细胞体外培养及分化特性的研究
目的探索人表皮干细胞(KSC)的筛选和体外培养方法,了解表皮干细胞在体外快速扩增的条件及其分化特性,为研究创伤愈合和组织工程提供良好的细胞模型;
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人表皮干细胞的体外培养
表皮干细胞(epidermal stem cells, ESCs)是表皮发生、分化和创面修复的摇篮,1其正常增殖分化是维持皮肤正常组织结构和细胞内环境稳定的基本要求,但由于ESC数量较少,只占基底细胞总数的1%～10%,2缺乏明确的特异性分子标志,体外培养很容易丢失其干细胞生物学特性,因而如何大量获得纯度较高的表皮干细胞将成为目前干细胞研究领域的热点.本研究利用酶消化法和IV胶原筛选法从整形手术的正常人头皮、包皮中进行表皮干细胞分离和培养,报道如下.
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线粒体转录因子A对表皮干细胞生物学功能的调节作用
目的 探讨下调线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM,也称为mTFA)对人表皮干细胞(epidermal stem cell,ESC)增殖、凋亡等的影响.方法 将TFAM基因干扰慢病毒转染至ESC中,得到目标ESC为干扰组,并取对照病毒转染ESC作为对照组.对比分析两组中ESC的增殖与克隆成型率、凋亡以及端粒酶反转录酶表达水平等生物学特征的差异.结果 两组比较,干扰组ESC克隆形成率及凋亡均显著高于对照组,而增殖率显著低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);在细胞端粒酶反转录酶水平测定中,两组均为阳性,但干扰组经定量分析,其平均光密度与阳性面积值均显著低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TFAM基因的沉默可导致ESC体外增殖活性降低,促进其凋亡过程,通过增加克隆形成效率而利于维持干细胞特性,并可能进一步抑制创面的愈合.
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人表皮干细胞的分离和鉴定
目的探索一种分离人表皮干细胞的新途径,为组织工程皮肤的构建提供种子细胞.方法以基底细胞作常规细胞培养;采用分类技术并结合表皮干细胞的特性;免疫细胞化学S-P法鉴定.结果用中性蛋白酶和胰酶消化可分离基底细胞,(1～2)×104/ml的基底细胞接种于以3T3为滋养层的培养瓶内,以含EGF等因子的DMEM为培养液,2 d后细胞开始增殖,一周许去除滋养层,10～12 d可传代.异硫氰酸酯荧光素(FITC)标记的基底细胞经流式细胞仪分选及IV型胶原20 min内的粘附后获得一些圆形、大小较一致的细胞.以鼠抗人K19的单抗为一抗,免疫细胞化学S-P法呈棕黄色阳性反应,证实分离出的细胞为表皮干细胞.结论通过荧光激活细胞分类和IV型胶原的粘附可分离出表皮干细胞,为组织工程皮肤的研究打下基础.
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人表皮干细胞在烧伤整形外科的研究进展
皮肤是人体大的组织器官,覆盖于人体的外表,是烧伤整形外科研究的主要内容.在烧伤方面,表皮干细胞(Epidermal stem cel1,ＥＳＣ)拥有无可质疑的潜能,它是皮肤组织特异性干细胞,在维持表皮自我更新、保持皮肤正常的表皮结构与功能方面起着重要作用．目前利用干细胞进行组织重建和转基因研究成为生物医学领域的重要方向,本文就对表皮干细胞的研究进展进行综述.
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皮肤科学基础
20120001 人原代表皮干细胞及其传代细胞生物学特性的比较/王元元(三军大大坪医院野战外科研究所皮肤科重庆市创伤愈合与组织工程研究所),杨桂红,杨涛…//第三军医大学学报.-2011,33(1).-24 ～27选择2009年5 -12月在该科医学美容门诊行包皮环切术后的包皮标本共20例,从包皮标本获得人原代表皮干细胞,利用0.25％胰蛋白酶冷消化4h获得传代细胞,利用CASY系统计数后计算细胞的黏附率,倒置相差显微镜下观察原代干细胞及传代细胞的形态学变化,观察干细胞表面标志物整合素β1和CK19,细胞分化的表面标志物CK10的表达,以及各代细胞基因组的表达差异.结果:原代干细胞的黏附率为(55.44±2.42)％,随着传代次数的增加,2代、4代及6代细胞的黏附率分别为(44.30±2.76)％,(30.95±2.24)％和(20.64±1.37)％,与原代细胞相比,差异有统计学意义(P＜0.05).细胞生长融合时间随着传代次数而增加.各代细胞均表达整合素β1;原代、2代及4代细胞表达CK19,但6代细胞不表达CK19;部分6代细胞表达CK10.原代及4代细胞基因组比较结果相近,但与6代细胞结果差异较大.提示与原代干细胞相比,体外培养的人表皮干细胞在4代以后生物学特性发生改变,体外实验宜选用4代以前的细胞.
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TGF-β1诱导表皮干细胞向间质细胞转化对增生性瘢痕形成的影响
目的：探讨转化生长因子-β1（Transform growth factor-β1，TGF-β1）对人表皮干细胞（Human epidermal stem cell， hESCs）向间质细胞转化的影响及该现象对瘢痕增生的作用。方法：体外原代培养hESCs，分析细胞表面标志物表达，不同浓度TGF-β1刺激后，MTT 法检测细胞增殖活性，酶联免疫吸附法（ELISA）检测上皮-间质细胞转化（Epithelial-mesenchymal transformation，EMT）正相关蛋白：波形蛋白（Vimentin，Vim）、Smad3，负相关蛋白：E-钙粘着蛋白（E-cadherin，E-cad）。建立兔耳瘢痕模型，不同浓度TGF-β1干预，术后4周取材行组织形态学观察。结果：利用人包皮皮肤成功培养出hESCs，表面标记物表达阳性。不同浓度TGF-β1可促进hESCs增殖，使Vim、Smad3表达上调，E-cad表达下调，且在一定浓度范围呈剂量依赖，兔耳瘢痕标本显示各组均有瘢痕增生，TGF-β1刺激组更为明显。结论：hESCs可发生EMT现象，该现象与瘢痕增生程度一致并可被TGF-β1诱导。推测瘢痕增生的实质可能为EMT。
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有血清和无血清培养人表皮干细胞的比较研究
1 对象与方法1.1 主要试剂Ⅱ型dispase酶、角质形成细胞无血清培养液(K-SFM)、胎牛血清(FCS)、DMEM无血清培养液、牛垂体提取物(BPE)均购自美国Gibco公司,人胎盘Ⅳ型胶原购自美国Sigma公司,角蛋白19(K19)单克隆抗体为福州迈新生物技术开发有限公司产品,整合素β1多克隆抗体购自美国Oncogene公司,Envision试剂盒由丹麦DAKO公司提供.
