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立止血的药理作用及临床评价
立止血中蝮蛇的毒液中含有特殊止血功效的类凝血酶,我院自1996年应用以来,一直被临床医生公认为较理想的止血药,下面就立止血的药理作用及临床应用做一下综述.
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蛇毒类凝血酶的研究现状
在40余种含有类凝血酶成分的蛇毒中,已有10余种蛇毒类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到明确,并有20余种先后得到分离和纯化,在其生物化学特征、基因工程研究、药理学作用等方面均取得了重要成果,并在临床上得到了广泛应用.
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降纤酶研究进展
降纤酶(Defibrase)是从尖吻蝮蛇Agkistrodon acutus和长白山白眉蝮蛇Agkistrodon halysussuriensis 蛇毒中提取分离得到的一种类凝血酶.具有显著的去纤、降粘、溶栓等作用,广泛地应用于临床治疗和预防心脑血管血栓性疾病.对降纤酶的生化性质与结构、生产制备、药理作用与临床应用以及质量分析与控制等方面的研究进行了综述.
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一种类凝血酶制剂的人体药动学研究
目的:研究单次静注注射用尖吻蛇毒血凝酶(HCA)的人体药代动力学规律.方法:30例男性健康志愿者随机分组至1 U、2 U、4 U 3个剂量组,每组10例,采用放射免疫分析法对受试血清检测HCA的含量,用DAS软件计算其药代动力学参数.结果:受试者给药后,药一时曲线符合二室模型,主要药代动力学参数:t1/2α为34-55 min;t1/2β为301～351 min;CL分别为0.0011、0.0012、0.000 9L/(min·kg),Vd分别为1.357 0、0.593 4、0.410 1 L/kg,AUC0-th分别为16 518.38、22 405.67和29 531.41 μU/(min·ml),呈明显的剂量依赖关系.结论:单次静注注射用HCA体内药代动力学特征符合一级线性动力学二室模型.
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东菱克栓酶对急性脑梗死患者血液流变学的影响
东菱克栓酶是由生物合成的一种高纯度类凝血酶样物质,能通过降解血中纤维蛋白原,增强纤溶系统活性,抑制血栓形成.我院于 2006年9月至2008年1月应用东菱克栓酶治疗急性脑梗死并进行疗效观察,结果报道如下:
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降纤制剂-巴曲酶注射液
目前,降纤治疗已经成为缺血性血管疾病的主要治疗方法之一.巴曲酶注射液作为降纤制剂,是一种经生物工程提纯、精制的丝氨酸蛋白酶,是类凝血酶的酶制剂.
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消栓灵皮试液的配制经验
消栓灵系以类凝血酶为主的复合酶制剂,临床用于治疗脑栓塞、血栓闭塞性脉管炎及断肢再植中抗凝等.用药前须做皮内过敏试验.
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长白山白眉蝮蛇毒类凝血酶的分离纯化
目的建立一种分离纯化长白山白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法.方法将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶解后离心,取上清进行阴离子交换层析,所得蛋白进行分子筛层析.提纯的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定及相对分子量测定.测定酶的N-末端氨基酸序列.结果经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一区带,相对分子量为35.5kDa.N-末端氨基酸序列分析表明其N-末端氨基酸序列与立止血中巴曲酶N-末端氨基酸序列基本一致.提取率约为5mg类凝血酶/g蛇毒.结论用上述方法可制得高纯度的类凝血酶.
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长白山白眉蝮蛇类凝血酶基因特异片段的制备与分挝
目的:分离和纯化长白山白眉蝮蛇类凝血酶 cDNA片段,为克隆全长类凝血酶 cDNA奠定基础.方法:应用RT-PCR方法获得长白山白眉蝮蛇类凝血酶 cDNA片段,克隆于pGEM-T载体上,进行测序和NCBI数据库同源性分析.结果:获得长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段长度为289 bp,该片段与其他种蝮蛇类凝血酶DNA片段有同源性.结论:本实验克隆了长白山白眉蝮蛇类凝血酶基因片段.根据不同种属蛋白质家族成员的保守性和同源性设计引物可以有效地克隆家族成员的DNA片段.
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应用东菱迪芙预防再次脑梗死及治疗进展性脑卒中的临床研究
巴曲酶,商品名为东菱迪芙和DF-521,是由生物合成的一种高纯度类凝血酶样物质,属于糖蛋白.它能直接降低血液中纤维蛋白原浓度,并使纤维蛋白多聚体降解为纤维蛋白单体,因此具有降纤、溶栓、抗凝、抑栓的效应.明显降低纤维蛋白原和纤维蛋白,间接诱发内皮细胞释放t-PA,抑制了血栓再形成,有助于挽救缺血半暗带神经元,且相对安全.实践中我们对个例进行了短期较大剂量降纤突击治疗后继续给予小剂量维持,效果满意.该研究目的在于进一步探讨降纤疗法对近期再梗死和进展性脑卒中的防治作用.
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尖吻蝮蛇蛇毒抗凝、纤溶组分的分离及对凝血系统的影响
目的:研究同一尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的类凝血酶和纤溶酶对凝血系统的影响.方法:采用DEAE-SepharoseCL-6B和Sephadex G-75层析法从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化获得类凝血酶和纤溶酶,通过体内实验,观察两者对凝血系统指标的影响.结果:从尖吻蝮蛇蛇毒中分别分离获得单一组分的类凝血酶和纤溶酶,它们的相对分子质量分别为39300和26600,体内实验证明,尖吻蝮蛇毒类凝血酶和纤溶酶都能明显延长全血凝固时间、活化的部分凝血酶原时间、凝血酶时间和凝血酶原时间,降低纤维蛋白原含量,但类凝血酶的作用更强,而纤溶酶在较大剂量时才显现抗凝作用,两者合用优于各自单用.结论:尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶和纤溶酶对动物体内的凝血系统有影响,两者合用具有明显的抗凝作用.
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尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化
用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱技术,从尖吻蝮蛇毒中纯化得到一个具有凝血活性的组分.经Superdex 75 HR10/30预装柱检测,纯度达99.91%.SDS-PAGE显示为单一条带,还原、非还原条件下分子量分别为59.25k、52.58k.该组分的凝血酶比活为41.5u/mg,精氨酸酯酶比活为14.29u/mg,但不激活血浆凝血因子ⅩⅢ.EDTA不能抑制其凝血活性,而苯甲磺酰氟则产生不可逆抑制作用.结果表明该酶是一种新尖吻蝮蛇毒类凝血酶.
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不同蛇毒类凝血酶制剂对纤维蛋白原的作用
主要研究了人凝血酶、速乐涓、邦亭、苏灵、巴曲亭对纤维蛋白原的水解作用.通过还原性SDS-PAGE法对作用结果进行检测,并用透射电子显微镜观察各样品在不同时间形成的凝块结构.速乐涓、苏灵、巴曲亭只作用于纤维蛋白原的α链,对β、γ链无作用;邦亭起初作用于纤维蛋白原的β链,对α链作用较弱,随着时间的延长对α链增强,对γ链无作用.相同反应条件下,类凝血酶制剂作用纤维蛋白原的初速度:巴曲亭≥人凝血酶＞速乐涓＞邦亭＞苏灵;反应过程的速度:邦亭＞人凝血酶＞苏灵＞巴曲亭≥速乐涓;凝块纤维直径:巴曲亭＞苏灵＞速乐涓≥邦亭≥人凝血酶.不同蛇毒来源类凝血酶制剂对纤维蛋白原作用情况有差异,为临床应用提供参考.
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Agacutase体外水解牛纤维蛋白原机制的研究
Agacutase是自尖吻蝮蛇蛇毒中分离出的新的具有止血功能的蛇毒类凝血酶,它能够将纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体.通过SDS-PAGE和ELISA方法,我们研究了Agacutase体外水解牛纤维蛋白原的分子机制.实验结果显示,Agacutase仅仅水解牛纤维蛋白原的α亚基并释放血纤肽A,而对牛纤维蛋白原的β和/或γ亚基没有影响.研究表明Agacutase属于血纤肽A类(FP-A类型)的类凝血酶.
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蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin基因的克隆及原核表达
目的 构建蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的原核表达载体,并诱导其表达重组Agkihpin,为将来量产Agkihpin提供方法和依据.方法 RT-PCR法扩增Agkihpin基因,构建重组表达质粒pET30a(+)-Agkihpin和pEASY-E1-His6-Agkihpin,并转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳观察重组蛋白Agkihpin的表达情况,Western blot检测其特异性.结果 成功构建Agkihpin的原核表达载体pEASY-E1-His6-Agkihpin和pET30a(+)-Hiss-Agkihpin,并利用pEASY-E1-His6-Agkihpin首次在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出分子量约为30kD的His6-Agkihpin重组融合蛋白.结论 首次实现了His6-Agkihpin重组融合蛋白在原核系统中的高效表达,为Agkihpin将来量产提供了方法和实验依据.
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一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶对血液活性的研究
目的研究蛇毒类凝血酶Agacutin的止血效果.方法新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察新西兰白兔的血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1剂量后,各剂量组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各实验组兔血纤维蛋白原含量和血黏度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致.试验结果显示,Agacutin对活化部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性.腹腔注射Agacutin 0.5～2.0 U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%).结论Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白和不激活凝血因子Ⅱ和Ⅷ,当有伤口时,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成不溶性纤维蛋白和血栓的形成.所有实验结果显示,Agacutin是一个有效的潜在止血剂.
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浙江尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯化及促凝活性
采用柱色谱等纯化方法从浙江尖吻蝮蛇凝血酶中提取获得一种类凝血酶(TQ-1),采用RP-HPLC、MALDI-TOF、SDS-PAGE、等电聚焦电泳、Edman降解法对其进行了结构确证,并对其体内、外凝血活性进行测定.纯化所得TQ-1纯度98.5％,相对分子质量为30 522.95,SDS-PAGE分析其为一种单链蛋白,等电点为4.5,N末端氨基酸序列为VIGGNECDTNEHRFL.体外凝血活性为900 U/mg,小鼠体内凝血试验结果表明:TQ-1凝血活性与阳性对照药巴曲亭相似.TQ-1为一种未见报道的尖吻蝮蛇类凝血酶,具有较高的开发价值.
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邦亭在肝功能受损病人手术中的应用
肝功能损害后,肝脏合成的与凝血有关的凝血酶原第Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子,纤维蛋白原减少,导致凝血功能障碍,造成术中出血甚至失血性休克[1].邦亭(注射用白眉蛇毒凝血酶)利用蛇毒凝血的独特作用,具有类凝血酶样作用和类凝血激酶样作用在手术中能起到减少出血或止血作用.本研究拟观察邦亭对肝功能受损手术病人中的止血作用.
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发色底物法测定注射用降纤酶中类凝血酶的含量
目的建立发色底物法测定注射用降纤酶类凝血酶的方法.方法以Be-Phe-Val-Arg-PNA为发色底物,检测波长405nm.结果降纤酶在2～10单位/mL范围内呈良好的线性关系,r=0.9993(n=5).结论本法简便,准确,专属性强,适用于产品的质量控制.
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东菱迪芙治疗下肢深静脉血栓形成的疗效评价
下肢深静脉血栓形成(DVT)是临床常见的静脉性疾病,起病较急,若不及时治疗容易导致血栓形成加重,严重者可引起肢体坏死;若并发肺动脉栓塞,则可危及生命;病变后期静脉瓣膜被破坏,形成后遗症[1].东菱迪芙(Batroxobin,DF-521)即巴曲酶注射液,是一种由蝮蛇毒液提纯、精制的类凝血酶生化药品.我们自2002年9月～2003年5月,用东菱迪芙治疗DVT38例,取得了良好效果,现报道如下.
