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新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin止血作用的实验研究
目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果.方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果:静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血粘度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致.试验结果显示,Agacutin对部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性、血小板体外聚集、优球蛋白凝固时间均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性.腹腔注射Agacutin0.5～2 U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%).结论:Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白且不激活凝血因子Ⅱ和XIII,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成血栓形成.
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立止血应用于耳鼻喉手术的临床观察
立止血是含有精制巴西腹蛇蛇毒的巴特罗酶制剂,不含神经毒素.其活性成分类凝血酶和类凝血激酶能激活血小板功能,促进凝血和止血.我院将立止血应用于耳鼻咽喉的术中止血,效果明显,现报道如下:
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尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序
目的 测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列,酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序.方法 通过生物化学方法获得高纯化Agacutin,经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品,后者通过Edman降解法,测定了亚基N端15个氨基酸残基序列.结果 大亚基(16 kDa)的序列为:DCSSGWSSYEEHQYY,小亚基(15kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV.结论 测序结果经NCBI数据库检索发现,Agacutin为新的蛇毒类凝血酶.
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尖吻蝮蛇毒类凝血酶在兔体内的药代动力学研究
目的:研究单一组份尖吻蝮蛇毒类凝血酶在兔体内的药动学过程.方法:采用放射性核素示踪动力法和聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合,检测体液中的原形物浓度,药-时数据用3P87程序处理.结果:兔静脉注射尖吻蝮蛇毒类凝血酶0.5、1、1.5U/kg三个剂量后,t1/2α(快分布相半衰期)在12.6～16.5min范围内,t1/2β(慢分布相半哀期)在131.6～164.7min范围内,1/2γ(消除相半衰期)在988～1292min范围内.AUC0→24h(药-时曲线下面积)分别为2833±312、5780±275和10707±12ng/min/ml比例为1:2:04:3.77.结论:兔静脉注射尖吻蝮蛇毒类凝血酶三个剂量后,药-时曲线经拟合符合三房室模型特征,三个时相的半衰期各剂量组之间无显著性差异,AUC与剂量成正比,表明药物在兔体内的分布和消除为一级线性动力学过程,排泄以肾脏为主.
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气管内给立止血治疗新生儿肺出血
目的:探讨立止血治疗新生儿肺出血的疗效.方法:对52例新生儿肺出血,均以机械通气为主的综合治疗,其中30例均用气管内给立止血治疗作治疗组,22例为对照组,观察治疗效果.结果:对照组22例死亡率72.7%,治疗组30例死亡率33.3%,治疗组较对照组死亡率明显降低.结论:以机械通气为主的综合治疗加气管内给立止血效果较佳,可在临床一种选择.
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长白蝮蛇类凝血酶基因大肠杆菌表达研究
从长白蝮蛇克隆的类凝血酶Ussurin Cdna被克隆进入pET-32α(+)中与5′端与Thx.Tag 和6xHis相连的T7启动子下,构建成大肠杆菌表达载体pET-32α(+)-Ussurin;再转化感受态E.coli BL(21)DE3 细胞,构成表达工程菌株;于IPTG诱导下表达,在细胞质中产生约占细胞质总蛋白10%的具有生物活性的Ussurin.
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重组定点突变巴曲酶质量标准研究
目的 建立重组定点突变巴曲酶的质控方法和质量标准.方法 生物学活性测定采用血浆凝集活性测定法;通过胰蛋白酶消化和RP-HPLC法分析该蛋白还原型肽图;其余检测项目均按<中华人民共和国药典>2010年版(三部)相关规定进行.结果 用建立的方法对三批重组定点突变巴曲酶原液和成品进行检定,各项指标均符合2010版<中华人民共和国药典>和相应指导原则的要求.三批原液比活性均≥2000 kU/mg.肽图三批次之间一致,原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、N末端氨基酸序列等指标均符合规定.结论 建立的质控方法可有效地控制重组定点突变巴曲酶产品质量,并可用于定点突变巴曲酶原液及成品的常规检定.
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重组定点突变巴曲酶酶学性质研究
目的 对重组定点突变巴曲酶的酶学性质进行研究,为开发成临床用药奠定基础.方法 测定不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响.结果 重组定点突变巴曲酶的适pH值在6.5～7.5之间.该酶在50℃以下活力保持90%以上,但当温度超过60℃时,该酶已完全失活.Ca2+和Na+离子对酶的稳定性无明显影响,而Mg2+、K+、Mn2+离子则表现为激活作用,Zn2+、Cu2+、Fe2+、Co+离子则表现为明显的抑制作用.结论 重组定点突变巴曲酶在中性条件下比较稳定,它不耐高温,金属离子对其活性有一定的影响.
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定点突变巴曲酶在毕赤酵母中的克隆与表达
目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解.利用重叠PCR方法对巴曲酶基因进行定点突变,将巴曲酶基因第45位的Arg突变为Lys.方法 将突变后的基因克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入巴斯德毕赤酵母细胞,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变巴曲酶,经SDS-PAG电泳、免疫印迹确定其分子量为32 kD.结果发酵罐的表达量达到52 KU/ml发酵液,较重组天然巴曲酶的表达量提高了73.3%.结论 定点突变巴曲酶的表达量比重组天然巴曲酶的表达量有显著提高,表达的突变巴曲酶同样具有凝血活性.
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巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达
目的 研究巴曲酶在毕赤酵母菌中的表达.方法 按Pichia pastoris偏好密码子人工合成巴曲酶全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入X-33,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的巴曲酶.经SDS-PAGE电泳确定其分子量为33.0 kDa,免疫印迹证明重组巴曲酶具有天然巴曲酶的免疫活性.结果 经发酵条件的优化,发酵罐的表达量达到25000 Ku/L发酵液,从每升发酵液中可纯化出11.0 mg重组巴曲酶.结论 巴曲酶毕氏酵母菌成功的构建,为重组巴曲酶止血药的开发奠定了基础.
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一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析
目的:克隆出五步蛇的类凝血酶cDNA,为研究其结构和功能的关系,并为下一步基因表达开发抗血栓药物提供依据和基础.方法:从五步蛇蛇腺中提取了总RNA,通过反转录合成第一链cDNA,经PCR 扩增出五步蛇毒腺中类凝血酶TLE1的cDNA片段,并将其连接到质粒载体扩增,然后进行DNA测序.结果:成功克隆出一种新的五步蛇类凝血酶的cDNA片段.此片段全长794bp,包括编码部分的全长为777bp.推导其编码的蛋白质序列为258个氨基酸,其中包括18个氨基酸的信号肽,6个氨基酸的前肽和234个氨基酸的成熟氨基酸顺序.TLE1成熟肽与其它蛇毒类凝血酶相比,蛋白质一级结构具有较高的同源性.结论:从五步蛇中成功克隆出一种新的类凝血酶cDNA,并确定了它的DNA顺序.
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一种检测凝血酶、类凝血酶的新方法——纤维蛋白原平板法
目的:创建一种定量检测凝血酶(Thrombin)、类凝血酶(Thrombin-likeenzymes)活性的新方法--纤维蛋白原平板法.方法:采用纤维蛋白原作为底物,用琼脂糖与纤维蛋白原制作成纤维蛋白原平板,以凝血酶、类凝血酶标准品分别在该平板上的扩散反应,制作相应的标准曲线及回归曲线,并对凝血酶、类凝血酶活性作定量测定.结果:本法制作的凝血酶、类凝血酶检测标准曲线具有良好的线性关系(r=0.999 4、r=0.999 7).结论:纤维蛋白原平板法可用于凝血酶、类凝血酶定量测定.具有操作简便、直观、稳定、敏感度高,不受检品浊度或颜色干扰且成本低廉等特点.
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降纤酶的药理作用及其研究进展
蛇毒以多种方式影响血液凝集和血小板功能,如中国长白山乌苏里蝮蛇(Gloydius ussurisis)毒液,不仅含有血小板活化及抑制成分,而且还含有出血毒及参与止血的降纤酶.降纤酶(Difibrase, DF)是蛇毒中的一种丝氨酸蛋白酶,又称为类凝血酶,能分解纤维蛋白原,但它不激活凝血因子Ⅷ,因此不形成交联的血凝块,而形成头对头、肩并肩结构的纤维蛋白,并可立即被纤维蛋白溶解酶彻底降解,导致体内纤维蛋白原降低,呈抗血液栓塞效应.由长白山乌苏里蝮蛇毒制得的 DF,活性较本属其它蛇毒高 2倍～ 3倍 [1],大量的临床资料证实了其治疗血栓的高效性.在临床应用上,其对脑血栓、血栓性静脉炎、动脉硬化性闭塞症、肺栓塞、缺血性冠心病等的治疗均有显著疗效.近年来, DF在癌症领域的研究也取得了巨大进展,并通过对其进行基因克隆拓宽了研究空间.
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长白山白眉蝮蛇蛇毒中类凝血酶的分离纯化方法研究
目的:研究长白山白眉蝮蛇蛇毒中类凝血酶的简单分离纯化方法.方法:采用DEAE-Sephadex A-25及Sephadex G-25层析的方法,比较二者对长白山白眉蝮蛇蛇毒中类凝血酶简单分离纯化的效果.结果:从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离出类凝血酶,SDS-PAGE电泳显示为一条带,分子量大约为35.5 kDa,达到电泳纯.理化性质研究表明,此类凝血酶具有体外凝血活性,体外凝血酶比活力为12.57IU·mg-1,用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐测得该酶的精氨酸酯酶比活力为137.65IU·mg-1.用蛋白酶抑制剂和乙二胺四乙酸对该酶进行抑制实验,结果表明该酶属于丝氨酸蛋白酶,而不是金属蛋白酶.结论:本方法可用于长白山白眉蝮蛇蛇毒中类凝血酶的分离纯化.
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蛇毒对神经疾病的治疗作用
蛇毒中90%～95%是蛋白质,包括毒素,非毒性蛋白,酶及活性多肽.蛇毒的非蛋白成份包括金属离子,无机阴离子和有机小分子化合物.生物活性物质大部分是蛋白质[1],在蛇毒含有的酶中,应用较广泛的是类凝血酶,目前我国研制的清栓酶,蕲蛇酶等蛇毒酶制剂,分别取自于白眉蝮蛇、尖吻蝮蛇等.国外则多从马来西亚红口蝮蛇及南美洲矛头蝮蛇中提取.这些酶制剂可引起血浆纤维蛋白原浓度降低,表现为抗凝效应,抑制血栓形成过程,降低血液粘度,从而改善血液循环.
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立止血在钳刮术前应用对手术出血量影响的临床观察
立止血是以巴西矛头蝮蛇蛇毒为原料制成的巴曲酶以及微量磷脂依赖性凝血因子Ⅴ激活物(FⅤA)的冻干粉注射剂,具有类凝血酶样作用以及类凝血激酶样作用,在我国临床应用已十余年[1].
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蛇毒降纤酶的研究进展
自Konig和Klobusitz在1936年第一次从矛头蝮蛇蛇毒中提取部分纯化的类凝血酶开始,目前发现30余种蛇毒酶类,包括类凝血酶、纤溶酶、水解蛋白酶、精氨酸酶、磷酸二脂酶等[1].其中研究深入、临床应用广泛的则是类凝血酶(thrombin-like enzyme,TLE),并由中国卫生部命名为降纤酶(defibrase)[2].其一部分已作为生化药品(如安克洛酶、巴曲酶、东菱克栓酶等)上市并应用于临床.
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蛇毒类凝血酶基因大肠杆菌和酵母细胞表达条件的优化
蛇毒类凝血酶(thrombin-like enzyme,TLE)是一种丝氨酸蛋白酶,能像凝血酶一样降解纤维蛋白原,但作用方式与凝血酶有所不同.蛇毒类凝血酶在Ca2+存在的条件下释放血纤肽A(fibrinopeptide A,FPA)或B(FPB),导致纤维蛋白的单体首尾聚合而凝固,但不激活其他凝血因子,尤其是凝血因子ⅩⅢ,所以形成的纤维蛋白凝块是可溶的,极易被纤维酶降解,从而在体内表现出抗凝作用[1].
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立止血使用不当加重凝血障碍1例报告
立止血(巴曲酶)是从巴西腹蛇的毒液中分离、精制、提纯而得到的一种蛇酶针剂,其中含有两种类酶、类凝血酶和类凝血激酶.临床上用于预防术中或术后出血以减少创面量以及治疗胃肠道等脏器出血症状.
