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电穿孔法在眼科研究中的应用
电穿孔是细胞在高电压的脉冲作用下,细胞膜通透性暂时升高的现象.用电穿孔法可向细胞内转运药物、DNA等各种分子.该法具有安全、快速、简便、应用范嗣广、可调节等优点,近年来在一系列眼科研究中得到广泛尝试,如角膜病的治疗、青光眼手术抗瘢痕化、葡萄膜炎的治疗、视神经保护、眼肿瘤的治疗及眼发育的研究等,有望成为一种新的治疗途径.
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透皮促渗方法联合应用的研究进展
透皮给药系统具有传统给药方式不可比拟的优势.但由于药物的低渗透量,使其应用受到一定限制.各种物理的、化学的促渗方法,包括透皮吸收促进剂、超声导入法、离子导入法、电穿孔法等可改善皮肤透过性,增加药物的透皮速率.而且几种方法联合应用的促渗效果更加显著.本文总结了近年来各种促渗方法联合应用的研究进展.
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基因物理靶向递送技术
应用非病毒物理方法进行基因递送已成为细胞内基因递送和基因治疗的基本手段.本文总结目前常用的非病毒物理方法,重点阐述每种基因递送方法的机制,以及治疗应用中的优缺点.本文还对各种方法的技术特点进行总结,重点阐述了提高递送效率的改进方法,并简要探讨了本领域未来的发展方向.
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透皮给药系统新方法及新技术的研究进展
参阅国内外有代表性文献,介绍透皮给药系统中新方法及新技术的新研究进展,并着重介绍以月桂氮(艹卓)酮为代表的透皮吸收促进剂的研究动态.表明透皮给药系统在药物制剂领域中颇具广阔的开发前景.
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非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞:脂质体及电穿孔转染法的比较
背景:基因转染细胞有病毒及非病毒载体法,因病毒载体面临安全性、免疫排斥等问题,实验探讨脂质体及电穿孔转染法.目的:比较脂质体及电穿孔法介导人脑源性神经营养因子基因转染骨髓间允质干细胞的细胞转染特性和体外表达情况,建立基因工程细胞.方法:①脂质体法:取体外分离、培养的第3代豚鼠骨髓间充质干细胞,将质粒-脂质体混合物加入含细胞的培养基中培养6 h,再加入胎牛血清的培养基,孵育48 h后行免疫组织化学检测,即为瞬时表达.48 h后加入含G418培养基筛选.②电穿孔法:取骨髓间充质干细胞,胰酶消化,用无血清培养基重悬细胞,将细胞悬液加入电转化池中,加入质粒,将电转化池移至电极间放电转导.转染48 h后,检测目的基因瞬时表达.48 h后加入含G418培养基筛选.用免疫组织化学及RT-PCR检测两种方法脑源性神经营养因子基因表达情况.结果与结论:免疫组织化学显示脂质体介导转染的脑源性神经营养因了瞬时表达率约为5.80%,电穿孔法约为24.29%.脂质体法转染筛选14 d后细胞几乎全部死亡;电穿孔法转染后筛选并扩大培养建立工程细胞,免疫组织化学显示工程细胞脑源性神经营养因子阳性表达率达90%以上,RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带.结果表明,用电穿孔法可成功建立脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞的工程细胞,并用免疫组织化学和RT-PCR办法证实细胞体外表达目的基因.
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电穿孔法介导环氧合酶-2基因沉默抑制裸鼠移植瘤的研究
大量研究表明,抑制环氧合酶(COX)-2高表达肿瘤中COX-2的表达可抑制新生血管形成,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖[1].因此,人们希望通过抑制COX-2表达来预防和治疗相关肿瘤.为进一步验证COX-2是否可作为相关肿瘤治疗的靶点,我们采用RNA干扰(RNAi)方法,构建靶向COX-2的短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达质粒,在体电穿孔法转染人胃癌细胞系SGC-7901,抑制细胞中COX-2表达,观察裸鼠皮下接种SGC-7901细胞的生长情况.
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电穿孔技术辅助眼内基因治疗
电穿孔法可将外源基因有效导入靶组织或器官,简单经济,可应用于多种组织器官上,近年来已成为一种新颖的非病毒基因转染体系,应用于眼内疾病基因治疗的研究屡见报道.本文对电穿孔技术辅助基因转染在眼内疾病治疗中的研究进展做一综述.
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胰腺癌细胞 BXPC-3转染条件的优化
目的：探讨实验室常用的人胰腺癌细胞株BXPC-3的有效转染方法及佳转染参数。方法通过脂质体法和电穿孔法将表达绿色荧光蛋白的质粒（ pGFP-N3）导入人胰腺癌细胞株BXPC-3中，24 h后观察并比较细胞的存活率及瞬转效率，确定佳转染参数。结果常规脂质体法BXPC-3细胞瞬转阳性率为1．36％，细胞存活率为87．45％；而电穿孔法在电压120 V电击时程70μs条件下，BXPC-3细胞瞬转阳性率为54．78％，细胞存活率为64．01％，2种转染方法的瞬转阳性率差异有统计学意义（P＜0．05）。结论转染BXPC-3细胞，电穿孔法可取得比常规脂质体法更高的转染效率。通过条件的优化，电穿孔法可以用于某些脂质体法难以有效转染的细胞株。
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原代培养神经元的转染技术研究进展
体外培养原代神经元是目前研究阿尔茨海默症、脑卒中等多种神经系统疾病的一种重要手段,并已成为研究神经元各个结构发育等诸多方面的标准模型.在原代培养神经元的基础上,利用转染的方法使外源分子如DNA、RNA等在哺乳动物中枢神经系统稳定表达,是目前研究中应用广泛的方法.本文综述了如磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法等多种转染原代神经元方法的原理、优缺点及应用.总结了近年来原代培养神经元转染技术的选择和应用进展,可为中枢神经系统的相关研究提供良好的细胞模型.
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CHO细胞转染策略的分析及优化方法的建立
按嵌套设计进行细胞电敏感性实验,通过嵌套设计的方差分析了解电穿孔转染缓冲液的pH值、电场强度及电容与活细胞数量的关系.根据嵌套设计结果安排L9(34)正交设计,以接近50％存活率为期望指标,同时分析主因素间的交互作用并确定优转染方案.CHO-dhfr-细胞电穿孔转染的优化参数为pH 7.2的低离子强度Tris-Cl缓冲液,525 V/ema、75 μF电击2次,间隔1 min.该方法不但确定了电穿孔转染CHO-dhfr -细胞的条件,而且适用于其它种类细胞的电穿孔转染条件的快速优化.
关键词： 电穿孔法 CHO-dhfr-细胞 嵌套设计 正交设计 -
电穿孔法提高hTERT转染原代培养乳鼠心肌细胞效率的研究
目的 探讨提高人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转染原代培养乳鼠心肌细胞效率的有效方法.方法 通过测量悬浮心肌细胞的半径,估计电击穿时临界电压的范围.以钙黄素为报告分子,确定佳可逆性电击穿时电压范围.进而用pAdtrack-GFP-hTERT对乳鼠心肌细胞进行转染,并通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达比较电穿孔、Lipofectamine 2000和Top Easy 3种转染方法对hTERT的转染效率.结果 电压170～200 V,波宽2 ms左右,间隔125 ms,脉冲4～6个时,pAdTrack-GFP-hTERT可有效转染乳鼠心肌细胞,转染率高达7.5%,而Lipofectamine 2000法和Top Easy法转染率均为0(P＜0.01).结论 利用电穿孔技术可将hTERT长cDNA片段导入原代培养的乳鼠心肌细胞.
关键词： 电穿孔法 人端粒酶逆转录酶基因 基因转染 心肌细胞 -
活体电穿孔法导入DNA:牛结核病免疫接种新技术
牛结核病是一种主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,MB)引起的慢性、致死性人兽共患传染病.据统计,目前全球有5000万头以上的牛感染了MB,每年造成大约30亿美元的经济损失[1].同时,由于MB也感染羊、鹿等动物,因此牛结核病也严重威胁着养羊业和养鹿业的健康发展.在欧美等发达国家,控制牛结核病均采用皮内结核菌素变态反应检测,对检出的阳性牛、羊、鹿等均采取屠宰淘汰的防制措施.然而,这种防制措施并没有根除这种疾病,相反,自80年代以来,牛结核病的发病率呈明显上升趋势[2].因此,Krebs在关于英国形势的新独立科学评论中,迫切呼吁开发新型、高效控制牛结核病的疫苗和诊断试剂[2].
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不同基因转染方法对小鼠内耳毛细胞转染效率的比较
目的：对比不同的基因转染方法对小鼠内耳毛细胞的转染效率，以探寻简便、高效转染耳蜗毛细胞的方法。方法分离111只新生昆明小鼠（P2）耳蜗螺旋韧带及感染上皮，分别采用电穿孔法介导质粒载体（pG‐PHI／GFP／Neo）、腺病毒载体（Ad5／CMV／GFP）和慢病毒载体（LV／CMV／GFP）3种方法转染小鼠内耳毛细胞，于转染48小时后在荧光显微镜下观察并比较三种方法基因转染后小鼠内耳毛细胞绿色荧光蛋白（green fluorescence protein ，GFP）的表达。结果电穿孔法介导质粒载体转染组和慢病毒载体转染组GFP阳性细胞极少；腺病毒载体转染组效率高，耳蜗中回外毛细胞GFP阳性率为90．0％±4．1％，内毛细胞GFP阳性率为5％ ± 0．4％。结论腺病毒载体能更有效地将外源基因导入耳蜗毛细胞内表达，是基因转染耳蜗毛细胞的理想载体。
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局部uPAR的高表达促进小鼠创伤后皮肤的再上皮化
目的 将构建的含uPAR的真核表达质粒转入创伤小鼠皮内,研究uPAR在皮肤创伤后再上皮化的作用.方法 将构建的真核表达质粒pEGFPC1-uPAR通过电穿孔法转入创伤小鼠皮内,观察质粒转入情况,测定创面愈合率,通过组织形态学观察和测定创面肉芽组织羟脯氨酸、蛋白含量来反映肉芽组织中胶原和蛋白合成的情况,评价创面愈合质量.免疫组织化学检测细胞增殖阳性率.结果 uPAR质粒转染的小鼠创面愈合率高于对照组,肉芽组织变化不明显,早期胶原蛋白含量增加,表皮细胞的增殖迁移能力增加.结论 局部uPAR的高表达能促进创伤后皮肤的再上皮化.
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抗菌蛋白葛栳纱在乳酸乳球菌中的表达研究
目的:观察人工设计的葛栳素的cDNA在乳酸乳球菌中的表达及其表达产物的抗菌作用.方法:采用统计学方法,统计同种族蛋白质Attacin A cDNA序列各种遗传密码子的出现频率 ,并以此为基础根据已知的葛栳素蛋白质序列设计其cDNA序列.采用PCR重叠延伸法合成葛栳素的cDNA序列,在测序完全正确后将葛栳素基因插入适合乳酸乳球菌MG1363表达的表达载体pNZ8048中,采用电穿孔法转化MG1363,转化的MG1363在电转化后涂布于恢复培养基SGM17 MC(含氯霉素)后放入厌氧培养箱中培养72小时后,挑单个菌落于SGM17培养液(无抗生素), 厌氧振荡培养72小时后收集细胞上清并进行杀菌活性的检测.结论:转化的MG1363细胞上清对大肠杆菌J5具有杀菌活性.结论:人工设计葛栳素的cDNA序列在乳酸乳球菌中得到表达,其表达产物具有抗菌作用.
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外排体载体给药系统的制备和体外性质的初步研究
目的 从小鼠树突状细胞(DC2.4)中提取外排体并载入盐酸阿霉素,研究外排体的细胞摄取能力与肿瘤细胞杀伤效率.方法 使用超速离心的方法从DC2.4细胞的培养基上清液中提取外排体,并通过透射电子显微镜验证提取结果;通过电穿孔法载入盐酸阿霉素并测定其粒径和Zeta电位;用超速离心法进行纯化,测定其载药量及包封率;选用小鼠乳腺癌细胞(4T1)为细胞模型,考察制剂的摄取能力和杀伤力.结果 成功制备了以内源性物质外排体为载体的给药系统,相比于传统给药系统脂质体,在4T1细胞中的入胞能力以及杀伤力都有显著性增加.结论 以外排体为载体的新型给药系统在未来的抗肿瘤治疗领域具有巨大的潜力.
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前列腺癌基因治疗进展
目前,只有局限于包膜内的早期前列腺癌能得到根治.对转移性前列腺癌,虽然内分泌等治疗可使70%～80%的患者症状缓解,但病人往往几个月或几年内死于肿瘤的扩散[1].基因治疗是治疗前列腺癌的希望.有效的基因治疗需要两个条件:一是要有适当的基因导入系统,以保障转染的安全、高效和导入基因的特异性表达,二是要有高效抗肿瘤的基因.基因导入方法有物理化学方法(包括磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、微粒轰击、电穿孔法及显微注射等)和病毒载体介导的基因导入方法,近几年用于前列腺癌基因治疗的几乎都是后者,它的转染率明显高于非病毒系统[2].
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电穿孔法介导质粒DNA转化大肠杆菌XL1-Blue MRF'菌株的实验研究
目的 探讨电穿孔法介导质粒DNA转化大肠杆菌XL1-Blue MRF'的佳条件,提高其转化效率.方法 将pCMV-Scrip质粒转化大肠杆菌XL1-Blue MRF'菌株,观察不同的电转化条件对转化效率的影响.结果 电场强度、脉冲时间、电击缓冲液的离子强度、细菌生长状态、感受态细胞保存时间、质粒DNA浓度对转化效率均有不同程度的影响;在电压2.0kV,电阻200Ω,电容25μF,脉冲时间4.3ms和低离子强度电击缓冲液的条件下转化,能获得较高的转化率.结论 优化电穿孔条件能提高转化效率.
关键词： 电穿孔法 质粒DNA 转化 大肠杆菌XL1-Blue MRF' -
体内电穿孔法转基因技术的应用
电穿孔法转基因是将外源基因通过电场作用导入动物目标组织或器官细胞中的技术.Neumann等[1]首次成功应用该技术,把外源DNA导人小鼠成纤维细胞.随后大的实验证明,几乎所有类型的细胞,包括植物原生质体、动物初生细胞,以及不能用其他方法转染的细胞和组织,都可以成功地使用电穿孔技术进行基因转移.
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人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达
目的构建含人MUC-1全长cDNA序列的真核表达载体,并观察其在COS-7细胞中的表达. 方法将目的基因MUC-1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定. 亚克隆入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MUC-1. 用电穿孔法将重组质粒转入COS-7细胞,以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC-1的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人MUC-1全长cDNA编码序列,转染实验表明MUC-1基因能在COS-7细胞中表达. 结论人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功,为基因疫苗的进一步研究奠定了基础.
