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人白细胞介素6的原核表达和纯化及包涵体复性
1980年,Weissenbach等[1]在研究人成纤维细胞β干扰素(interferon β,IFN-β)时,首次发现一种相对分子质量(Mr)约为26 000的蛋白,当时将其命名为IFN-β2,直到1989年,在纽约召开的"急性期反应和免疫应答的调控:新的细胞因子"会议中将其命名为白细胞介素6(interleukin 6,IL-6),并一直沿用至今[2].IL-6是一种多效性细胞因子,由巨噬细胞产生,它的重要功能之一就是诱导免疫系统B细胞分化及抗体的产生,并广泛存在于诸如免疫系统调节、急性期反应、人体造血作用、特定癌细胞的生长调节及细胞代谢活动过程中[3-5].
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小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定
目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.
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HLA-A*0203-BSP的表达和复性及其四聚体的鉴定
目的:优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽(BSP)与HLA-A*0203重链胞外域的融合蛋白(HLA-A*0203-BSP),并制备负载HLA-A*0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3596-604的四聚体( HLA-A*0203/SVR).方法:以HLA-A*0203-BSP原核表达载体转化E.coli BL21(DE3)菌株,优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达.通过稀释法复性可溶性HLA-A*0203/SVR单体,然后以BirA对其进行生物素化,并以阴离子交换树脂纯化.将纯化的HLA-A*0203/SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4:1的比例混合形成四聚体,通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性.结果:当IPTG的浓度为0.4 mmol/L,于37℃诱导过夜后,融合蛋白的表达多.该重组蛋白相对分子质量(Mr)为34000,与HLA-A*0203-BSP的理论Mr相一致.该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分,约占菌体总蛋白的30%.负载抗原肽的可溶性HLA-A*0203/SVR单体是在同时存在HLA-A*0203-BSP、β2微球蛋白及HLA-A*0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得.该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4: 1的比例混合后即形成四聚体.流式细胞术(FCM)分析证实,该四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性.结论:HLA-A*0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达.以此蛋白制备的HLA-A*0203/SVR四聚体具有与HLAA2+供者特异性CTL结合的活性,为研究HLA-A*0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础.
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人白细胞介素-21 cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达
目的:克隆人细胞因子IL-21全长cDNA及其在大肠杆菌中表达,并进一步检测其表达产物的功能.方法:抽取外周血,分离淋巴细胞;抗CD3抗体刺激后,提取总RNA,通过RT-PCR获得两个部分重叠的IL-21 cDNA片段(分别为5′端242 bp,3′端425 bp),重组PCR扩增出IL-21全长cDNA.DNA测序正确后,将成熟IL-21 cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a(+)中.卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达.SDS-PAGE、Western blotting鉴定,亲和层析分离纯化得到Mr为18 600的带有组氨酸标签重组人IL-21融合蛋白.透析法重折叠复性,MTY法测定其对T细胞增殖活性.结果:成功获得人IL-21全长cDNA,并以包涵体形式表达于大肠杆菌中.重折叠后的rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用.结论:获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子,为进一步研究其功能奠定基础.
关键词： 白细胞介素-21(IL-21) 克隆 包涵体 重折叠 T细胞增殖 -
rhIL-15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的获得rhIL-15基因工程菌.方法从肺癌细胞株A549中提取细胞总RNA,用RT-PCR法扩增编码人IL-15成熟区基因的片段.经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,插入融合表达质粒pGEX-4T-2的相应酶切位点,构建重组融合蛋白表达质粒,并转化感受态大肠杆菌BL21而得到工程菌.结果重组质粒插入片段核酸序列测定的结果,与文献报道的IL-15蛋白成熟区的核酸序列相一致.该工程菌所表达的融合蛋白多数以包涵体的形式存在,占菌体蛋白总量的39%.复性后,纯化的rhIL-15蛋白经MTT比色法初步测定,具有促进CTLL-2细胞增殖的能力.结论获得了具有生物学活性的rhIL-15高效表达菌株.
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BAC5-scFv的表达、复性及活性检测
目的:探讨以包涵体形式表达的抗鼻咽癌单克隆抗体(mAb)BAC5的单链抗体(BAC5-scFv)的纯化、复性方法,并对其活性进行检测.方法:扩增pET-22b-scFv质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,培养、破菌后,分离和变性包涵体,用Ni-NTA His Bind层析柱纯化变性的scFv.经稀释、透析及尿素梯度凝胶层析柱3种方法进行复性.用细胞免疫组化染色和蛋白印迹法(Western blot),鉴定复性后的BAC5-scFv的免疫活性.结果:Ni-NTA His Bind亲和层析柱能有效纯化变性的scFv.以尿素梯度凝胶层析柱复性的蛋白回收率高.免疫细胞化学染色法检测及Western blot分析证实,复性后的BAC5-scFv可与CNE2细胞上的抗原特异性结合.结论:以包涵体形式表达的BAC5-scFv经变性、纯化及复性后,获得良好的免疫活性,为大量制备具有活性的BAC5-scFv,并用于鼻咽癌的放射免疫显像和治疗研究奠定了基础.
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大鼠补体调节因子DAF功能区的表达纯化及功能鉴定
目的: 重组表达促衰变因子(DAF)功能区的4个短的保守重复序列(SCR1-4).方法: 通过克隆大鼠DAF的SCR1-4并插入到原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导共表达,根据表达结果选择纯化方式.结果: 诱导后表达产物为不溶蛋白,通过纯化包涵体并复性,得到了具有抑制致敏绵羊红细胞发生溶血的可溶性蛋白成分.结论: 原核表达SCR1-4易于形成包涵体,稀释复性法适用于DAF SCR1-4包涵体的复性.
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单纯疱疹病毒Ⅰ,Ⅱ型抗原gG1,gG2表达产物复性与纯化
目的 探讨原核表达系统表达单纯疱疹(HSV)Ⅰ,Ⅱ型分型抗原gG1,gG2包涵体的复性与纯化方法 .方法 采用含氧化/还原谷胱甘肽(1:6)透析液透析法复性,并配合Ni2+固相化的HiTrap Chelating HP亲和层析法纯化表达抗原.应用免疫印迹法、动物免疫实验、SDS-PAGE凝胶电泳对复性纯化后的抗原免疫活性、纯度给以鉴定.结果 复性后的表达抗原具有相当于细胞培养法获得的天然抗原的免疫活性和抗原活性,且纯度迭90%以上.结论 建立的gG1,gG2包涵体的复性与纯化方法 可以用于该类原核表达抗原的大量制备工作,获得的高纯度,高活性抗原可以应用于相关病原体感染临床诊断试剂盒的开发.
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一May-Hegglin异常家系细胞形态学观察
目的：对一 May-Hegglin异常家系细胞进行形态学观察。方法对 May-Hegglin异常家系成员进行血常规检测；外周血细胞进行瑞-姬染色，观察白细胞及血小板形态；对先证者进行骨髓涂片，并进行巨核细胞计数及分类；先证者进行外周血收集白细胞透射电镜检查并对其进行 PCR扩增产物测序。结果 May-Hegglin异常家系成员血常规检测血小板计数不同程度的减低，外周血中嗜酸细胞、嗜碱细胞、单核细胞、中性粒细胞中可见形态不一的包涵体。结论形态学检查可以为 May-Hegglin异常疾病的诊断提供有价值的线索。
关键词： May-Hegglin异常 包涵体 -
针对人CD133分子两个胞外段的单链抗体的克隆与表达
目的:克隆与表达针对人CD133分子两个不同胞外段的单链抗体.方法:提取杂交瘤细胞总mRNA,利用简并引物PCR获得针对人CD133分子两个胞外段抗体可变区基因,再通过重叠延伸PCR的方法,用一段柔性linker (GGGGS)3将其相连,得到CD133 Ex-1 scFv和CD133 Ex-2 scFv基因.随后,将其克隆至携带6×His标签的原核表达载体pRSET-B中,然后对其进行了表达和鉴定研究.结果:获得分别针对CD133不同胞外段的单链抗体基因,并成功获得针对CD133两个胞外段的单链抗体,但该单链抗体主要以不溶性包涵体形式存在于胞内.包涵体蛋白经复性和镍柱亲和层析纯化后,得到纯度较高的单链抗体,通过蛋白质印迹实验证实,融合蛋白确实为单链抗体.结论:成功制备出针对CD133两个胞外段的单链抗体.该研究结果为其功能研究及其在肿瘤靶向治疗研究中奠定了物质基础.
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婴儿肢端纤维瘤病11例临床分析
目的 了解婴儿肢端纤维瘤病临床特点,探讨治疗方案选择依据.方法 回顾性分析北京儿童医院皮肤科2007-2016年诊治的11例婴儿肢端纤维瘤病患儿的临床资料.结果 11例患儿,男5例,女6例.平均发病年龄2.85月(0～8个月).均表现为坚实、平滑、圆顶状、肤色或淡粉色的结节,位于指趾背面或侧面.肿瘤直径平均1.26cm(0.6 ～2.8cm).4例出现临床症状,均予手术治疗.2例皮损增长迅速(4周内增长2倍以上),予瘤体内注射得宝松治疗.余5例无任何症状且生长相对较慢,密切随诊.所有患儿术前均行活检,病理示瘤体由增生的梭形细胞构成,呈束状或编织样排列,其间夹有胶原纤维,肿瘤细胞胞质内可见红色圆形嗜伊红包涵体.患儿均取得良好疗效.结论 婴儿肢端纤维瘤病临床及组织病理特点典型,多数无症状患儿可密切随访,有症状者手术治疗可取得良好效果,生长迅速的皮损予糖皮质激素注射治疗也可获得满意疗效.但仍需扩大样本量论证及长期随访.
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尿液包涵体形成与hCMV-DNA检测用于hCMV感染的诊断
0 引言近年来,由于大量新型免疫抑制剂的出现及应用,临床器官移植的不断增加,对人巨细胞病毒(hCMV)感染问题,以引起医学界高度重视. HCMV是造成临床免疫抑制低下患者机会性感染的重要病毒,其感染对人类可造成极大的危害,特别是在原发性感染、器官移植、反复输血、孕妇、免疫功能低下等患者中常造成严重的不良后果[1]. 因此,探讨hCMV原发性感染的早期、快速、简便的诊断方法具有重要的意义. 我们对临床尿液标本中包涵体的形成与聚合酶链反应技术联合用于hCMV感染的诊断,探讨早期诊断CMV感染和指导治疗中的价值.
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HER-2蛋白疫苗的制备及在小鼠中诱导的抗体应答
目的:制备HER-2抗原疫苗.方法:采用RT-PCR方法从HER-2+SKBR3细胞株中获得HER-2基因胞外段编码区cDNA,构建pQE-30-HER-2原核表达载体,在大肠杆菌中表达HER-2胞外区蛋白.Ni-NTA柱亲和层析纯化后,梯度尿素复性,Western Blot鉴定.用获得的蛋白免疫小鼠,检测重组蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答.结果:构建的pQE-30-HER-2质粒经酶切和DNA测序分析,结果表明该基因的序列与设计的序列完全相同.构建的质粒转化DH5α后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,该重组蛋白以包涵体形式表达,且与mAb Herceptin有较好的结合活性.包涵体用Ni-NTA柱亲和层析纯化后,梯度尿素复性,大限度的获得了可溶性的HER-2胞外区蛋白.用重组蛋白免疫小鼠,得到了较高的抗体滴度.结论:成功制备了HER-2蛋白疫苗并诱导出较高抗体滴度,为下一步工作打下基础.
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趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定
目的:构建趋化因子受体5(CCR5)胞外段重组蛋白(命名为:rCCR5)原核表达载体,并进行诱导表达.对表达产物进行纯化和鉴定.方法:截取CCR5胞外结构4个片段N-Term,ECL1, ECL2和ECL3的氨基酸序列,应用柔性linker分别串联,模拟CCR5胞外结构,依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因.运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达,表达产物经纯化、复性后进行Western blot鉴定.结果:目的蛋白以包涵体形式存在,经包涵体洗涤、变性溶解,SephacrylS-300凝胶过滤层析及SephacrylS-100凝胶柱复性获得了纯化的蛋白质,目的蛋白能与CCR5 mAb特异性结合.结论:获得了大量纯化的rCCR5重组蛋白,可作为研制CCR5自体蛋白疫苗以阻断HIV-1感染的候选抗原蛋白.
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凋亡相关蛋白Apr-2的克隆、测序及初步表达
目的: 从HL-60细胞凋亡模型中克隆凋亡相关蛋白Apr-2编码区基因,并对其进行表达,为进一步研究Apr-2的结构功能及多克隆抗体的制备奠定基础.方法: 建立HL-60细胞凋亡模型,提取HL-60凋亡细胞总RNA,以RT-PCR方法获取Apr-2 cDNA编码区全序列,将其与PGEM-T Easy载体连接,转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体PGEM-TEasy/apr-2,测序正确后,将目的片段亚克隆入PGEX-4T-2原核表达载体,并转化大肠杆菌, IPTG诱导重组蛋白质表达,分析蛋白质在细菌中的表达分布,进行凝胶自动扫描分析. 结果:序列分析表明,与GenBank中已登录的Apr-2 cDNA编码区序列比较,完全一致.表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的40%以上,主要以包涵体的形式存在. 结论:成功的获得了细胞凋亡模型HL-60中Apr-2 cDNA编码区的克隆及其融合蛋白表达产物.
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显微切割技术鉴定病毒核内包涵体
目的建立应用显微切割技术鉴定病毒核内包涵体的新方法. 方法通过光学显微镜直视下用显微操纵系统进行显微切割技术结合DNA提取和PCR方法,对在组织切片上获取病毒核内包涵体的来源进行分子生物学鉴定. 结果在福尔马林固定石蜡包埋的腮腺组织切片上根据形态学特征疑为人巨细胞病毒(HCMV)感染的细胞,利用显微切割技术将核内包涵体病变与其周围染色质分离,从收集的包涵体得到用于PCR扩增的DNA模板,经双重PCR扩增出预期的149 bp片段,从而鉴定出该包涵体为HCMV包涵体. 结论显微切割技术可用于病毒核内包涵体的鉴定,为病毒包涵体病变的分子病理学研究建立了一种新的方法.
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大分子拥挤及其对蛋白质折叠的影响
大分子拥挤现象在过去的几十年中,对于蛋白质体外折叠的大量研究,为理解细胞内新生肽链如何折叠成熟为具有一定功能的蛋白质以及克服大多数重组蛋白在重新折叠的过程中形成包涵体提供了充足的依据.
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包涵体蛋白复性技术研究进展
本文对原核表达的包涵体蛋白的分离,洗涤,溶解及复性方法做了一个简单的总结.同时就国内外近几年的新复性方法进行了概述.并分析了各种复性方法的利弊.
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人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性
目的 将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原.方法 37℃诱导重组菌体pET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不同浓度的TritonX-100(细胞裂解液)洗涤包涵体3次.洗涤的包涵体用8 mol/L尿素进行溶解并用镍离子亲和层析方法进行初步纯化,用阳离子交换层析方法对初步纯化蛋白进行终的纯化.亲和层析纯化蛋白用3种不同的复性液进行了稀释复性.结果 37℃诱导5 000 mL重组菌pET-42b-F1J/Rossata共收获37 g湿菌体,经过不同浓度TritonX-100洗涤包涵体后纯度可达75％.包涵体用8 mol/L尿素溶解后经镍离子亲和层析纯化纯度约为40％,再用阳离子交换层析介质SP HP进一步纯化样品后纯度可达90％.纯化蛋白以3种不同的复性液都能得到复性,其中复性液3的复性效果相对较好.结论 实验中探索了人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的纯化方法及步骤,为后期的蛋白制备及动物免疫奠定了基础.
关键词： 呼吸道合胞病毒截断短F1蛋白 包涵体 纯化 复性 -
大肠杆菌表达的人IL-6复性条件研究
采用稀释法复性,筛选重组人白细胞介素-6(rhIL-6)包涵体蛋白的复性条件.结果显示,复性液的浓度、pH值、复性时间和复性蛋白浓度,对重组人白细胞介素-6复性效果有很大影响.在复性液为2mol/L尿素、pH8.5、复性时间为24h和复性蛋白浓度50μg/ml条件下,重组人白细胞介素-6包涵体蛋白的复性效果佳.
关键词： 包涵体 重组人白细胞介素-6 复性
